生化分离技术考试题目

生化分离技术考试题目85号楼413 工作室第一章1.1何谓生化分离技术的集成化概念？请举例加以说明。

1) 利用已有的和新近开发的生化分离技术，将下游过程中的有关单元进行有效组合(集成);2) 或把两种以上的分离技术合成为一种更有效的分离技术，达到提高产品收率、降低过程能耗和增加生产效益的目标；例子⑪多种分离、纯化技术相结合，包括新、老技术的相互渗透与融合，形成所谓融合技术；⑫生化分离技术（下游技术）与发酵工艺（上游技术）相结合或称耦合，形成系统工程；1.2说明生化分离的主要步骤并指出胞内产物和胞外产物的分离纯化流程不同之处①材料及处理来源丰富，含量相对较高，杂质尽可能少②目的物的提取状态释放出来，方法与存在部位及状态有关③分离纯化性质及具体条件定④浓缩，结晶，干燥⑤保存（收率、纯度）（胞内外的区别就是在于破壁）2.1 ①胞捣碎法，原理：机械运动产生剪切力适用于动植物组织用高压使细胞悬浮液通过针型阀，适用于：较柔软、适用于细菌（G-）（细菌病毒等热不敏感的物质）适用于不稳定的酶）⑨化学法，1、溶剂处理法质化合物，使细胞结构破坏。

2细胞膜而破碎细胞，释放目的物。

1．自溶法，将欲破碎细胞在一定条件（pH、T内物质释放。

2．外加酶法加溶菌酶（结合反复冻融或加β-葡聚糖酶霉菌：添加几丁质酶植物材料：多种破碎方法相结合㈡与上游过程相结合㈢与下游过程相结合(如:,发酵生产A蛋白。

通常A蛋白结合于菌体胞壁上,需要进行细胞破碎,,过程繁琐,难度大。

若用生物技术培养出A蛋白分泌型菌来生产,A.)2.2P8，回收率和纯度考虑。

纯酶的分级范围比粗酶宽在采用盐析时更注重回收率，可以适当加宽分级范围，而粗酶?⑪温度尽可能低；⑫提取液的量要保证“充分浸入”；⑬加入足量酚类吸附剂；（天然清蛋白，合成聚丙乙烯）⑭加入足量氧化酶抑制剂； 2-巯基乙醇、二硫苏糖醇(DTT)及二硫赤藓糖醇(DTE)是常用的抗氧化剂，又是醌的清除剂；⑮搅拌转速要恰当；⑯ pH要控制在合适范围，一般5.5～72.4、分离技术的主要种类：细胞破碎 (cell disruption)沉淀分离(precipitation膜过滤(membrane filtration) 层析分离(chromatography) 电泳分离(electrophoresis)离心分离（centrifugation）1形状和大小：凝胶过滤、超滤、透析⑫电离性质离交色谱、电泳（除SDS）⑬极性（疏水性）分配、吸附、疏水色谱⑭生物功能或特殊化学85号楼413 工作室基团亲和色谱⑮等电点pI 色谱聚焦、电聚焦⑯溶解性盐析、有机溶剂提取、结晶⑰密度、大小超离心 SDS-凝胶电泳2.5怎样选择细胞破碎的方法？总原则：最大提取、不易变性、减少干扰具体须从材料特性和目的物特性综合考虑。

1．材料细胞的特性动物细胞易破碎，只需用温和方法植物细胞较难破碎，须用中等或强度大的方法，微生物细胞较复杂，一般用较强方法2.目的物的特性⑪细胞中的位置游离状：只需温和破碎，除去不溶部分。

结合状：可能结合在膜或细胞器内需先收集膜或细胞器，再破碎⑫敏感性温度、pH、氧、剪切力、杂酶等影响⑬处理量有些处理量少，如超声波破碎等。

3.1膜分离1、何谓“浓度极化”现象，怎样避免膜过滤中的“浓度极化”现象？浓差极化 concentration polarization 被截留于膜表面，并逐渐形成浓度梯度的现象。

是指在超滤过程中，溶质浓度增加，在浓度梯度作用下，膜表面形成一溶质浓度分布边界层，它对水的透过起着阻碍作用。

透过膜，引起膜表面附近的溶液浓度升高，(1)增高流速线速度，其中也包括采用层流薄层流道法。

(2)的小球放入被处理的流体中，而言，加填料的方法是不适宜的。

(3)装设油液促进器所谓湍流促进器一般是指可强化流态的多种障碍物，内部可安装螺旋挡板，对板式或卷，这些湍流促进器的效果很好。

(4)脉冲法主脉冲的振幅和频率25---50%，但是，换来了透过速度提高了70%的得益，特别是在测试装置中必定使用的一种也可以和在磁力搅拌器上回转使用，试验表明，传质(6) 为防止反渗透膜结垢，某厂过去曾以加硫酸或盐酸调节PHPTP-0100的高效阻3.2种类据材质分成：1）有机微滤膜，具韧2 无机陶瓷膜具备化学稳定性好、机械强度大、抗污染能力强、 3）复合微滤膜 1）2）通过不同的工艺手段实现有机3）将微滤膜技术与生物处理法相结合的新型复合式膜生物反应器(IMBR) 分离机理筛分，膜将尺寸大于孔径的颗粒截留。

(2) 吸附，膜将尺寸小于孔径的颗粒吸附截留。

(3) 架桥，固体颗粒在膜微孔入口处因架桥而被截留。

(4) 网络，截留发生在膜内部，因膜孔的曲折而形成。

(5) 静电，分离悬浮液带电颗粒时，可采用带相反电荷的微滤膜。

能用孔径比待分离的颗粒尺寸大许多的微滤膜，不仅可达到较好的分离效果，还可获较高通量。

3.3、膜选择和使用时考虑的主要参数是什么？影响流率的主要因素是什么？不管微滤、超滤还是纳滤，选择时，一般应注意以下指标。

⒈截留分子量---指截流率达90%以上的85号楼413 工作室最小被截留物质的分子量。

（以球形分子测）*一般选用的膜的额定截留值应稍低于所分离或浓缩的溶质分子量。

2.流动速率--- 指在一定压力下每分钟通过单位面积膜的液体量。

(ml/cm2.min) 。

其它还有操作温度、化学耐受性、膜的吸附性能、膜的无菌处理等等。

影响流率的因素：⒈溶质的分子性质，比重大的纤维分子扩散性差，比重较小的球形分子易扩散⒉溶质浓度：一定压力下，稀比浓流率高；⒊压力：不同溶质应选择不同的操作压力；⒋搅拌：加快扩散，减少浓度极化，提高流率；*对切力敏感的大分子（酶、核酸）须控制搅拌速度; ⒌温度：升温能提高流率（不同溶质区别对待）; ⒍其它：如溶液pH、离子强度及溶剂因素等对流率均有影链RNA、杂链RNA、双链DNA，为什么？DNA与羟基磷灰石的相互作用基于DNA磷酸酯骨架与羟基磷灰石中的钙离子间的作用。

洗脱时用磷酸缓冲液，核酸分子的亲和性受其分子中磷酸集团的控制。

单链rNA分子的结构可变无序，它与刚性有序的双链DNA分子相比，亲和力要小。

杂交的双链DNA及部分变性的DNA分子的亲和力适中。

因此单链DNA分子结合弱，结合的双链DNA分子可以通过增加磷酸洗脱缓冲液的浓度使之解离。

胶过滤层析5.1、名词解释1）排阻极限用A类分子中最小分子量表示Mwamin2）分级范围实85号楼413 工作室际是B类分子的分子量范围 3）死体积4）外水体积(V0) 间隙液体体积5）内水体积(Vi) 孔隙体积5.2、Kd的意义是什么？为什么它一般在0和1之间，大于1和小于0的反常情况可能是什么原因？怎样处理？Kd 是分配系数=固定相溶质的浓度/流动相溶质的浓度， A类分子只走外水体积，所以Kd=0 ;C类分子走所有的外水体积和内水体积 Kd = Ve —V0/Vi所以Kd大于0小于1. 溶质洗脱的异常⑪. Kd〈0 因装柱不好，发生沟流（短路）⑫. Kd〉1 凝胶对溶质分子可能有吸附作用5.3、请判断分子量为1千和3千的一组分子，或分子量为8万和10G-75柱中分开？为什么？因为sephadeG-75的分离范围为10000到500005.4么？但是以上三种大分子物质的结构不同，蛋白走的快，因此分离的最后效果，所以不能直5.5Vi 要大⑫亲水⑬惰性。

⑭稳定⑮色谱性能好填料有以下几种：1.交联葡聚糖（sephadex）dextranα-1,6糖苷键（约95%）分支：α-1,3糖苷键（约5% ，特点：化学稳定性较好PH范围为2~12，在强酸下凝聚糖苷键易水解，热稳定性较好，可以高压灭菌。

使用范围：总的工作范围为分子量。

2、聚丙烯酰胺（bio-gelp-x甲叉双丙烯酰胺铰链而成，其中x为2~300，x=工作范围/1000.特点：稳定2~11sephadex相同，总工作范围为100~40万。

吸附性：I>0.023甲叉双丙烯酰胺交联的烯丙基右旋糖苷形成的凝胶，较2~11较Sephadex 抗压色谱性能作范围：1000～7亿吸附性： I 〉 4-D半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖交替结合所形成的线性多聚糖糖浓度、4B…表示糖浓2%… Bio-Gel A 0.5～150M 表示工作范围上限4.5~9.0，抗热性差，抗压性好，总工作范围：103～4×107 吸附性：需I5、. 2,3—二溴丙醇或环氧氯丙烷进行交联㈡.稳定性⒈化性： pH 3～14 ⒉.色谱性能 1.工作范围：同Sepharose ⒉吸附性：下降6、一种具高分辨率，高机械强度，很宽分级范围的新型凝胶过滤介质，是在珠状琼脂糖颗粒的基础上经过两次交联后得到的，适合于组分分子量差异较大的混合物的分离。

Superose具体特点：⑪. 机械和物理稳定性很好，适合于高速分离过程，即使用高粘度的洗脱剂如8mol/L尿素仍能保持较高的流速，在pH7，121℃反复高压灭菌不会对凝胶结构产生明显影响;⑫.化学稳定性也很好，能够耐受0.2mol/L的NaOH，0.01mol/L的盐酸，1mol/L的醋酸，去污剂如1%SDS，促溶盐类，变性剂如8mol/L尿素和6mol/L盐酸胍等。

7、 Superdex颗粒很小且均匀，柱效非常高，很高的流速下仍能获得非常高的分辨率；物理稳定性良好，pH7条件下能承受高压灭菌； pH稳定性良好，清洗时（短程）可暴露在极端pH（1～14）85号楼413 工作室下而不会对层析行为产生影响；凝胶的分离行为不受去污剂如1%SDS，促溶盐类，变性剂如8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍的影响。

该介质同样能在有机溶剂中使用。

5.6、请按凝胶层析流程顺序分析说明主要操作要点。

实验设计的总的要求：高分辨率、回收率高、减少稀释、短时间、最好保证样品为组别分离，已知目的物的Mw ：原则：选斜率大即 Kd大，效果好；选排阻极限低的凝胶，可早些洗出。

未知目的物的Mw 先用中等工作范围的，再据结果进行选择。

样品的浓度＜70mg/ml ；离子强度；综合考虑种种因素：分级分离时，Vs一般选1～3% Vt；组别分离时，Vs可选30%15～20% Vt ；据样品量确定分级分离： Vt = 30～100 Vs 组别分离：Vt = 3～6 VsH/D可选择在30～100 ；组别分离：H/D 相对可低些。

H/D 但流速大；H/D 大，抗流变性好，区带不易发生崎变但流速小。

洗脱剂选择洗脱剂应与平衡液一致，以免体积变化；吸附较强的，调节pH需冷冻干燥的，选挥发性盐类；对脱盐操作，可选用蒸馏水；流速纵向扩散增加Gel的选择和准备1. 凝胶溶涨一般湿胶∶洗脱剂（v/v）=3∶1 g）＝πr2h / 膨胀度（床体积mL/g干胶）⒉倾析⒊ 一般控制沉积体积为总体积70～75% ⒋ 脱气仪器的准备装柱：要求：均匀、无裂缝、无气泡、安柱充填平衡检验**对软胶，装前须先校对操作压力！加样：要求：不能干扰Gel沉淀表面洗脱速控制收集、检测紫外连续检测清洗若被脂肪污染，可用0.1～0.5mol/LNaOH（除Sepharose）须加化学试剂防腐，0.02～0.05%的叠氮钠离子交换层析6.1要？α，效率n，和k′容量因子三个参数。