分子克隆方法之同源克隆方法

PCR产物纯化
+
目的载体线性化（PCR 或酶切）及纯化
同源反应 目的质粒 . 转化
单片段克隆原理图一
cDNA
5’
CDS区域
AAA… 3’
PCR获取包含目的基因CDS序列的片段
与基因互补序列 （18-27bp）
5’
正向引物(实线) 3’
目的基因片段
质粒同源序列 （15-20bp）
目的基因片段 质粒
3’ 反向引物(实线)
Primer 2
1μL
ddH2O
22.5μL
Template
0.5μL
Total
50μL
*建议模版量小于10ng (尤其是模板为含目的基因片段的质粒)
PCR仪设置
98℃
10s
55℃
5s 30-35Cycles
72℃
30s/kb
72℃
30s/kb
12℃
+∞
*扩增条带特异时无需切胶回收， 可直接用DNA纯化试剂盒纯化
分子克隆之同源克隆方法
第一部分---从头合成质粒
✓ 单片段克隆 ✓ 多片段克隆
第二部分---已有质粒改造
✓ 突变 ✓ 缺失 ✓ 插入
.
从头合成质粒 之
单片段克隆
.
单片段克隆流程图
从cDNA做PCR获取包含目 的基因CDS序列的片段
含目的基因片段的质粒
用含有质粒同源序列的引物做PCR扩增 出含质粒同源序列的目的基因片段
Exnase® II
1 μl
Total
10μl
同源反应体系(简便版)
*同源反应37℃ 30min，后置于冰上 5min
*同源反应产物全部用于转化 100μL感受态细菌 (慢病毒载体需要用Stbl3感受态)
*同源反应产物可保存于-20℃
5×CE II Buffer
2 μl
线性化克隆载体
1μl
插入片段扩增产物
.
同源反应体系（Vazyme产品）
同源反应体系(标准版)
多片段克隆同源反应体系（标准版）
ddH2O 5×CE MultiS Buffer 线性化克隆载体
插入片段扩增产物1 插入片段扩增产物2 插入片段扩增产物3 …… Exnase® MultiS Total
Up to 10 μl 2 μl
[0.01 × 片段碱基对数] ng (0.15 pmol) [0.01 × 片段碱基对数] ng (0.15 pmol) [0.01 × 片段碱基对数] ng (0.15 pmol) [0.01 × 片段碱基对数] ng (0.15 pmol)
3’ 5’ 5’ 3’
+
3’ 5’
突变位点设计在同源序列内
3’ 5’
5’
3’
3’
5’
线性化载体
同源反应
目的质粒
.
PCR反应体系(以Takara PrimeSTAR为例)
PCR反应体系(Takara PrimeSTAR)
PrimeSTAR Max Premix（2×） 25μL
Primer 1
1μL
55℃
5s 30-35Cycles
72℃
30s/kb
72℃
30s/kb
12℃
+∞
*扩增条带特异时无需切胶回收， 可直接用DNA纯化试剂盒纯化
.
同源反应体系（Vazyme产品）
同源反应体系(标准版)
ddH2O
Up to 10 μl
5×CE II Buffer 线性化克隆载体 插入片段扩增产物
2 μl 25～100 ng 10～100 ng
5’
质粒同源序列
PCR扩增出含质粒同源序列的目的基因片段
5’
.
3’
3’
5’
PCR产物纯化
目的载体线性 化（PCR或酶 切）及纯化
5’ 3’
3’ 5’
单片段克隆原理图二
+
线性化载体
3’--->5’外切酶活性
同源反应示意图
3’ 5’
5’ 3’
目的质粒
.
PCR反应体系(以Takara PrimeSTAR为例)
1 μl 10μl
.
*同源反应37℃ 30min，后置于冰上 5min
*同源反应产物全部用于转化 100μL感受态细菌 (慢病毒载体需要用Stbl3感受态)
*同源反应产物可保存于-20℃
*已线性化质粒： pCDH‐EF1‐MCS‐IRES‐neo PCDNA3.1+ pcDNA6myc-His_A pDsRed-Monomer-C1 pEGFP-N1 pGEX-6P-1 …
已有质粒改造 之
突变
.
质粒突变流程图
以质粒为模版用包含同源序列的 引物做PCR，扩增得到线性质粒
PCR产物纯化 同源反应 目的质粒 转化
.
质粒突变原理图一
引物（实线） 需突变区域（渐变色）
第一轮PCR示意图
第二轮PCR示意图
第二轮PCR线. 性化示意图
质粒突变原理图二
第三轮及之后PCR示意图
同源反应示意图
目的质粒
第三轮及之后. PCR线性化示意图
PCR反应体系(以Takarபைடு நூலகம் PrimeSTAR为例)
PCR反应体系(Takara PrimeSTAR)
PrimeSTAR Max Premix（2×） 25μL
Primer 1
1μL
Primer 2
1μL
ddH2O
22.5μL
用包含同源序列的引物做PCR 扩增出含同源序列的片段1
片段1 PCR产物 纯化
片段2
+ PCR产物
纯化
片段3
+ PCR产物
纯化
+… +
目的载体线性化 （PCR或酶切） 及纯化
同源反应
目的质粒
.
转化
多片段克隆原理图（方法一）---更适用于单个位置突变数较多
引物设计
5’ 3’
3’ 5’
5’ 多个片段PCR 3’ 及其产物纯化
6μl
Exnase® II
1 μl
Total
10μl
*已线性化质粒： pCDH‐EF1‐MCS‐IRES‐neo PCDNA3.1+ pcDNA6myc-His_A pDsRed-Monomer-C1 pEGFP-N1 pGEX-6P-1 …
.
从头合成质粒 之
多片段克隆
.
多片段克隆流程图
从cDNA PCR获取包含目的片段1 含目的片段1的质粒
目的载体线 性化（PCR 或酶切）及 纯化
3’ 5’ 5’ 3’
+
突变位点设计在同源序列内
3’
5’
5’
3’
3’
5’
线性化载体
同源反应
目的质粒
.
多片段克隆原理图（方法二）---适用于仅多片段融合或单个位置仅一个点突变
引物设计
5’
3’
5’ 多个片段PCR 3’
及其产物纯化
目的载体线 性化（PCR 或酶切）及 纯化
PCR反应体系(Takara PrimeSTAR)
PrimeSTAR Max Premix（2×） 25μL
Primer 1
1μL
Primer 2
1μL
ddH2O
22.5μL
Template
0.5μL
Total
50μL
*建议模版量小于10ng (尤其是模板为含目的基因片段的质粒)
PCR仪设置
98℃
10s