分子克隆方法之同源克隆方法
分子克隆方法之同源克隆方法(20160115)
*建议模版量小于10ng
*扩增条带特异时无需切胶回收，可 直接用DNA纯化试剂盒纯化 *扩增效率不佳时，可延长至 ≤35Cycles
同源反应体系（Vazyme产品）
同源反应体系(标准版)
ddH2O 5×CE II Buffer PCR所得线性化质粒 Exnase® II Total Up to 10 μl 2 μl 25～200 ng 1 μl 10μl
分子克隆之同源克隆方法
第一部分---从头合成质粒
单片段克隆 多片段克隆
第二部分---已有质粒改造
突变 缺失 插入
从头合成质粒 之 单片段克隆
单片段克隆流程图
从cDNA做PCR获取包含目 的基因CDS序列的片段
含目的基因片段的质粒
用含有质粒同源序列的引物做PCR扩增 出含质粒同源序列的目的基因片段 PCR产物纯化
已有质粒改造 引物做PCR，扩增得到线性质粒
PCR产物纯化
同源反应
目的质粒
转化
质粒突变原理图一
引物（实线） 需突变区域（渐变色）
第一轮PCR示意图
第二轮PCR示意图
第二轮PCR线性化示意图
质粒突变原理图二
第三轮及之后PCR示意图
同源反应示意图
PrimeSTAR Max Premix（2×） 25μL Primer 1 1μL Primer 2 1μL ddH2O 22.5μL Template 0.5μL Total 50μL
PCR仪设置
98℃ 55℃ 72℃ 72℃ 12℃ 10s 5s 30s/kb 30s/kb +∞ ≤30Cycles
同源反应示意图
目的质粒
第三轮及之后PCR线性化示意图
同源序列法克隆目的基因
同源序列法克隆目的基因同源序列法克隆是一种常用的基因克隆方法，用于获取目的基因的DNA序列。
同源序列法克隆的主要步骤如下：1. 设计引物：根据已知目的基因的序列，设计一对引物（即寡核苷酸片段），其中一个引物具有与目的基因的5'端相互匹配，另一个引物具有与目的基因的3'端相互匹配。
2. 提取模板DNA：从包含目的基因的源生物体中提取总DNA 或特定组织/细胞中的DNA作为模板。
3. 聚合酶链反应（PCR）扩增：在PCR反应中使用设计的引物和模板DNA来扩增目的基因的DNA序列。
PCR反应通过多次循环加热和冷却来产生大量DNA复制品。
4. 凝胶电泳分析：将PCR扩增产物与分子量标记物一起加载在琼脂糖凝胶上进行电泳分离。
通过比较扩增产物与标记物在凝胶上的迁移距离，可以确定是否成功扩增了目的基因。
5. 纯化目的基因：从PCR反应中纯化目的基因的扩增产物，一般使用凝胶切片、DNA纯化试剂盒等方法。
6. 连接到载体：将纯化的目的基因DNA与适当的载体（如质粒）进行连接。
这通常涉及酶切目的基因和载体的DNA，然后使用连接酶将它们连接在一起。
7. 转化宿主细胞：将连接的DNA导入宿主细胞中，使其自行复制和表达。
这可以通过转染、电穿孔或热激冲等方法实现。
8. 筛选与鉴定：通过对转化后的细胞进行选择性培养或检测，筛选出带有目的基因的克隆。
常用的筛选方法包括抗生素筛选、荧光筛选等。
9. 验证目的基因：最终需要验证克隆中是否成功插入了目的基因。
这可以通过DNA测序、限制性酶切、PCR等方法来进行。
同源序列法克隆是一种有效的基因克隆技术，可用于获得感兴趣的基因序列并进一步研究其功能、表达和调控机制等。
分子克隆
3.与反转录相关的PCR扩增
RT-PCR（reverse transcriptase-PCR,RT-PCR): 又称反转录PCR, 是以反转录的cDNA作模板所进行的PCR，
可对基因的表达和序列多态性分析。
ＲＴ－ＰＣＲ
反转录
逆转录酶
AAAnA mRNA
AAAnA
T T TnT
cDNA第一链
ＤＮＡ聚合酶 cDNA
目的基因的获取-----PCR技术:
定义： PCR技术又称聚合酶链式反应（polymerase chain reaction)，是通过模拟体内 DNA 复制的 方式，在体外选择性地将 DNA 某个特殊区域扩 增出来的技术。
Taq DNA多聚酶的发现
Heat-stable polymerase is vital to the ease of the process…
4.PCR反应程序
⑴94~96℃ ⑵94℃ ⑸ 25- ⑶50-60℃ 35个循 ⑷72℃ 环 ⑹72℃ ⑺4-10℃ 30’’-3’ 预变性（使模板DNA充分变性） 30’’ 变性 30’’-1’ 复性（使引物与模板充分退火） n’(按1’扩增1kb计算）延伸 3-7’ 总的延伸（使产物延伸完整） 保存
质粒自身含有复制起始点，与相应的顺式调控元件组成一个复制子(replicon)， 能利用细菌的酶系统进行独立的复制及转录。质粒具有多种遗传选择标记， 包括各种抗药基因或营养代谢基因等。
氨苄青霉素抗性(ampicillin resistance，ampr)基因：
此基因编码ß 内酰胺酶，该酶能 水解氨苄青霉素ß —内酰胺环，使之 失效而使细菌产生耐药。
1988年Saiki 等从温泉 （ Hot spring）中分离 的一株水生嗜热杆菌 (thermus aquaticus) 中提取到一种耐热DNA 聚合酶。
植物基因克隆方法
RT-PCR实验中的常见问题与对策
问题1：在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物。 原因：
1）RNA被降解
建议解决方法：利用无污染技术分离RNA； 如果使用RNase抑制剂，不要
加热超过45℃或pH超过8.0。
2）RNA中包含逆转录抑制剂 建议解决方法： 通过乙醇沉淀RNA除去抑制剂。用70％（白质具有抗原性及 生物活性，所以除核酸探针外，还可以用核酸类探针筛选的 目的基因的分离。
第22页，共46页。
1、差异杂交筛选（differential hybridization screening） 2、mRNA 差异显示( differential display)
（4）复制时两条模板链是在解旋酶的作用下局部打开双链，而PCR两 条模板链通过变性完全打开双链
（5）复制时两条链的合成是同步进行的，而PCR两条链的合成可能不 同步
（6）PCR的DNA聚合酶为耐热的DNA聚合酶，而复制的聚合酶一般不 耐热
（7）复制一般为双向复制，而PCR反应中DNA合成是单向的
（8）复制时由多种蛋白因子参与，而PCR只有DNA聚合酶参与
淀进行清洗。 逆转录抑制剂包括：SDS，EDTA，甘油，焦磷酸钠，甲酰胺和胍盐。
第10页，共46页。
3）多糖同RNA共沉淀
建议解决方法： 使用氯化锂沉淀RNA以除去多糖。
4）起始RNA量不够
建议解决方法：增加RNA量。 对于＜50ng的RNA样品，可以在第一链
cDNA合成中使用0.1μg到0.5μg乙酰BSA。 5）RNA模板二级结构太多
• 目前认为真核生物的转录起始需要转录因子的参与。这些转录因子 通常由一个DNA结合域（BD)和一个或多个与其他调控蛋白相互作 用的转录激活域（AD）组成。用于酵母单杂交系统的酵母GAL4蛋 白即是一种典型的转录因子。
第八章知识资料知识资料基因克隆
Word-可编辑第八章基因克隆基因克隆（gene cloning）或分子克隆,又称为重组ＤＮＡ技术，是应用酶学主意，在体外将不同来源的DNA分子通过酶切、衔接等操作重新组装成杂合分子，并使之在适当的宿主细胞中举行扩增，形成大量的子代DNA分子的过程。
克隆（clone）一指含有单一的DNA重组体的无性繁殖系，或指将DNA重组体引入宿主细胞建立无性繁殖系的过程(cloning)。
一个残破的基因克隆过程包括以下步骤：１、获得待克隆的DNA片段（基因）；２、目的基因与载体在体外衔接；３、重组DNA分子导入宿主细胞；４、筛选、鉴定阳性重组子；５、重组子的扩增与／或表达。
第一节重组DNA中常用的工具酶包括限制性核酸内切酶、DNA衔接酶、DNA聚合酶、逆转录酶等，一、限制性内切酶的定义、命名和分类限制性核酸内切酶是识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。
限制性核酸内切酶的来源：细菌的限制－修饰系统。
分子克隆中所用的限制性核酸内切酶属于第Ⅱ类。
限制性核酸内切酶的命名。
二、限制性核酸内切酶的作用特点1、识别位点的DNA序列呈二重旋转对称（即具有迥文结构）；2、切割DNA均产生含5’-磷酸和3’-羟基的末端；3、错位切割产生具有5’-或3’-突出的粘性末端；而沿对称轴切割双链DNA产生平头末端，也称钝性末端。
4、少数不同的限制酶可识别和切割相同的位点，这些酶称为同切酶，如MboI Ⅰ和Sau3A。
千里之行，始于足下三、其它工具酶参考“分子克隆”（Sambrook,J et al . molecular cloning）第二节载体－宿主系统一、概述载体(vector)是携带外源DNA进入宿主细胞举行扩增和表达的DNA,它们普通是通过改造质粒、噬菌体或病毒等构建的。
载体应具备以下条件：１、能在适当的宿主细胞中复制；２、具有多种限制酶的单一切点（即所谓多克隆位点）以便外源DNA插入；３、具有筛选标志以区别阳性与阴性重组分子；４、载体分子较小，以便体外基因操作，同时载体DNA与宿主DNA便于分离；５、对于表达型载体还应具有与宿主细胞相适应的启动子、增强子、加尾信号等基因表达元件。
植物生物技术研931-分子克隆PPT课件
质粒小、转化率高 质粒大、拷贝数低 ﹥15kb 转化率成为限制因素
分子大小4363bp，容易纯化;
含有2个抗生素抗性基因，可以作为选择标记;
受体细胞内，pBR322以多拷贝存在，一般一个细胞内可达到15个，而在 蛋白质合成抑制剂存在条件下，可达到1000-3000拷贝，如氯霉素。可以 产生大量的重组pBR322分子。
component in such a way as to preserve the reading frame and functional expression. However,
cloning of an insert into the multiple cloning site (MCS) will cause insertional inactivation, and
.
28
Some of the λ gene products lyse the host cell, allowing the virions to escape and infect new cells.
Figure 4.13. In vitro DNA packaging in a phage λ protein coat can be performed using a mixed lysate of
pGEM-3Z 和 pGEM4Z 的差别在于二者 互换了两个启动子 的位置。
作用：体外转录
.
19
质粒的制备
实验室常采用碱法制备质粒
碱裂解法 将菌体悬浮在含有EDTA的缓冲液体中加溶菌酶裂解细菌细胞壁
加NaOH与SDS的混合溶液，去膜、释放内含物
加高浓度的醋酸钾溶液沉淀染色体，去除染色体DNA及大部分 蛋白质
分子克隆技术讲解课件
pUC19
pUC18 和 pUC19
小、高拷贝数, 长2686 bp 只有多克隆位点(MCS)排列 方向不同pUC18/19 含有: (1) pMB1 复制子rep (来自 pBR322)，因缺失了rop 基因和在pMB1的 rep 复制子
单个位点突变而导致了高拷贝数; (2)编码 beta-内 酰胺酶的bla基因，赋予对氨苄青霉素的 抗性 (来自 pBR322)，这个基因上有两个点突变， 因而不同于pBR322的 bla基因; (3) lac 操作元的区域
pUC19图
pBluescript II系列
均为2961 bp 长，用于DNA 克隆、双脱 氧 DNA 测序、体外诱变和在简单体系中 体外转录。 pBluescript II SK 和 KS 这两 个载体只有lacZ基因中的多克隆位点的方 向不同。
pBluescript II载体上的重要位点
Lambda噬菌体唯一切点
Lambda噬菌体载体
cos质粒
是lambda噬菌体和质粒的杂种，其优点 是可以用来插入较大的DNA片段，再转 入细菌。
cos质粒 载体
一个典型的质粒克隆技术涉及5步
1) 用限制性内切酶消化 DNA 样品 2)用限制性内切酶消化 质粒DNA 3) 连接样品DNA和质粒DNA的消化产物
pUC系列质粒
是2.7Kb的双链DNA质粒，有一个复制起点，一 个氨苄青霉素抗性基因和一个多克隆位点，多 克隆位点处于表达LacZ基因产物-β-半乳糖苷 酶的氨基端片段，用pUC质粒转化LacZ基因有 突变的大肠杆菌株（M15）时，因为由质粒表 达的α－肽补充了大肠杆菌却失的α－肽，所 以恢复了分解半乳糖的能力。在加入IPTG和Xgal的培养基上，长出蓝色克隆。如果在多克隆 位点内插入外源DNA，由于它破坏了α－肽的 表达，因而在加入IPTG和X－gal的培养基，不 能长出蓝色克隆，这就是所谓的蓝白筛选。
同源重组法分子克隆 -回复
同源重组法分子克隆 -回复同源重组法是分子克隆技术中的一种重要方法，其基本原理是利用DNA的同源性重组来插入外源DNA序列到宿主DNA中。
同源重组法在基因克隆、遗传工程等领域得到了广泛应用。
本文将详细介绍同源重组法的原理、步骤及应用。
一、同源重组法的原理同源重组法的原理基于DNA分子的自身结构和功能，DNA分子在某些条件下能够进行重组、修复和重复。
同源重组是指两个DNA分子之间具有相似序列（同源）的区域进行交换而形成的DNA分子重组。
同源重组法基于此原理，通过在宿主DNA中引入重组的同源片段，将外源DNA序列插入到宿主DNA中。
同源重组法的原理可以分为两个步骤：相互间接断裂和互补配对。
两个DNA分子的同源片段同时发生间接断裂，获得可供基因重组的末端。
接下来，由于互补配对的作用，从两个DNA分子中间的同源片段在一定条件下进行配对，形成插入、缺失、互换等不同类型的重组产物。
1. 构建载体DNA：载体DNA是将外源DNA插入到宿主DNA中的重要工具，构建载体DNA 需要选择有适当限制酶切位点的载体和外源DNA。
一般来说，常用的载体包括质粒、噬菌体、噬菌体样颗粒等。
2. 制备DNA片段：外源DNA片段可以通过PCR扩增、酶切和DNA合成等技术制备。
需要注意的是，PCR扩增要确保扩增的DNA片段与宿主DNA具有一定的同源性。
3. 利用限制酶切割载体和外源DNA：根据预定的酶切位点设计限制酶切位点并进行酶切。
4. 进行杂交和拼接：将外源DNA片段与载体DNA杂交，并通过互补配对将DNA片段与载体DNA进行拼接。
5. 转化大肠杆菌：利用化学方法或电击法将构建好的载体DNA转化到大肠杆菌中，转化后得到含外源DNA的菌落。
6. 筛选阳性菌落：利用选择性培养基和荧光素酯分析方法等技术筛选阳性菌落。
7. 测序鉴定：对筛选出的阳性菌落进行测序，并鉴定插入的外源DNA序列是否正确。
同源重组法是分子克隆领域中一种非常实用的技术。
同源序列克隆法
同源序列克隆法抗病基因的分离、克隆不仅有助于我们深入理解植物－病原物的识别过程及其专性抗病分子机制，而且对于作物的抗病育种具有极大的应用价值。
1992 年，第一个抗病基因Hml被克隆 (Johal and Briggs, 1992) 。
迄今已经从不同植物中克隆了约 50 个抗病基因，分别赋予植物体针对病毒、细菌、真菌、线虫和昆虫等广泛病原物类型的特异性抗性（汪旭升等， 2005 ）。
尽管这些基因来自上十个不同的植物种属，特异识别的病原物类型各自不同，其核苷酸序列的同源性也较低，但是，其编码的蛋白质产物在结构上却有极大相似性，它们都拥有一些共同的结构域，如富含亮氨酸重复序列（ LRR ）、核苷酸结合位点（ NBS ）、丝氨酸－苏氨酸激酶区域（ STK ）、 Toll 和白介素－ 1 区域（ TIR ）和亮氨酸拉链（ LZ ）等。
考虑到尚未被克隆的抗病基因其编码产物可能也存在类似结构域， 90 年代，许多研究者便提出了利用同源序列法快速克隆抗病基因的设想，其基本思路便是依据这些结构域中的高度保守区域，设计特异性的简并引物，通过 PCR 扩增 R 基因同源序列（ Resistance gene analogs, RGAs ），最后利用这些 RGAs 来快速分离 R 基因。
同源序列法克隆抗病基因相对于传统方法具有一定的优越性。
传统的基因克隆方法主要有图位克隆法和转座子标签法，这两种方法都相当耗时耗力，并且在应用上有一定限制。
例如大麦和小麦等作物的基因组较大并且重复序列较多，很难构建高密度的分子标记连锁图谱，因而图位克隆法分离基因相对困难；果树难以建立理想的分离群体，同时又缺乏合适的转座子系统，因此经典克隆抗病基因的方法都不适合。
同源序列法分离 RGAs 的过程快速、简捷，并且应用上没有限制，因而能够在广泛植物中得到普遍应用。
目前，已经从大豆（ Kanazinet al., 1996 ）、豌豆（ Timmerman-Vaughan et al., 2000 ）、马铃薯 ( Leister et al., 1996) 、番茄 (Zhang et a1., 2002) 、柑橘 (Deng et al., 2000) 、苹果（ Lee et al., 2003 ）、葡萄 ( Donaldet al., 2002) 、辣椒（ Pflieger et al., 1999 ）、莴苣（ Shen et al., 1998;Meyers et al., 1998 ）、亚麻（ Dodds et al., 2001 ）、拟南芥（ Aarts et al,. 1998 ）、玉米 (Collins et al., 1998,1999 and2001 ; Ramalingam et al., 2003 ) 、水稻 (Wang 等，1998;Chen et al., 1998; Leister et al., 1998 and1999; Mago et al., 1999; Wang and Xiao, 2002) 、大麦 ( Leister et al., 1999; Mohler et al., 2002;Madsen et al., 2003 ) 、小麦 ( Feuilletet al., 1997;Chen et al., 1998) 等植物中扩增出大量 RGAs ，并利用这些 RGAs 鉴定到一些抗病候选基因。
同源克隆法原理和方法
同源克隆法原理和方法同源克隆法呀，那可是个很有趣的东西呢。
同源克隆法的原理就像是找失散多年的亲人一样。
它基于基因的同源性，也就是相似性啦。
如果把基因比作一群有着家族特征的人，那些有着高度相似序列的基因就像是近亲。
我们可以根据已知的基因序列信息，在其他生物或者同一生物的不同组织里找到相似的基因。
这就像是凭借着家族的一个特征去找到其他有同样特征的家族成员。
那它的方法呢？首先得有一个已知的基因片段或者序列，这就像是我们有了一个家族成员的线索。
然后提取目标生物的基因组DNA，这基因组DNA就像是一个装满各种宝藏信息的大盒子。
接着利用设计好的引物，引物呢就像是一把精准的钥匙，只能打开特定的基因锁。
通过PCR技术来扩增可能存在的同源基因。
这个过程就像是一场寻宝游戏，我们拿着钥匙在大盒子里寻找我们想要的宝贝。
在这个过程中呀，要注意引物设计一定要准确，可不能马虎，就像你要去参加一场很重要的比赛，准备工作得做足了。
同源克隆法的安全性嘛，哎呀，那还挺不错的呢。
因为它主要是在基因层面操作，只要遵循实验室的规范操作，就像我们遵守交通规则一样，不会有太大的危险。
不会突然像个调皮的小鬼一样搞出什么大麻烦。
它的稳定性也比较可观，只要实验条件合适，就像植物在适宜的环境里生长一样，结果是比较可靠的。
它的应用场景可多啦。
在植物育种方面，就像是给植物做一场基因升级。
比如说，想要提高作物的抗病虫害能力，就可以用同源克隆法找到抗病虫害相关的基因，然后把它转到作物里。
这就好比给作物穿上了一层坚固的铠甲。
优势也很明显呀，它相对比较简单直接，不需要特别复杂的设备和技术，这难道不棒吗？这就像你不需要开着豪车也能到达目的地一样。
给你说个实际案例吧。
在水稻育种中，科学家想要提高水稻对盐碱地的耐受性。
他们就利用同源克隆法找到了一些在耐盐碱植物里存在的同源基因，然后把这些基因转到水稻里。
哇塞，结果水稻真的就像个坚强的战士一样，在盐碱地里也能茁壮成长啦。
同源克隆结合RACE技术扩增基因全长
同源克隆
这是一种参考其他物种的已知基因序列克 隆待研究物种目标基因的方法。目前很多 植物基因的序列信物，然后通过 的PCR方法进行克隆。
同源克隆
如果计划克隆的基因在本物种中已经有报道,那么 只需要在NCBI网站上的Nucleotide数据库中检索到 该基因序列,随后设计基因特异引物进行PCR扩增 即可. 如果计划克隆的目的基因在本物种中未见报道,则 可以以近源物种中报道的该基因序列检索数据库, 看是否能够比对到本物种的公布序列,从而设计基 因特异引物进行PCR扩增.如果无法比对到本物种 的表达序列,那么只有比对近源物种中所报道的该 基因序列从而设计基因简并引物进行PCR扩增.
FT/TFL基因家族
杨树是木本模式植物，自然界中杨树要生 长20年左右才能开花。组成型表达的FT同 源基因可以诱导杨树提前开花，转FT同源 基因的杨树可以在转化后四周内即组织培 养阶段开花。该成果可以广泛应用于多年 生木本植物上从而加快常规育种进程.
二球悬铃木PaFT基因的克隆
悬铃木科现存只有1属—悬铃木属,大约6-10种，悬 铃木属物种在分子方面的研究较为缺乏,数据库中 的基因数据有限,因此根本不存在基因数据很全的 近源物种,使得基因克隆难度大大增加.
FT/TFL基因家族
随着分子生物学的发展，逐步在模式植物拟南芥 中发现一系列基因参与了植物对外界光信号的感 应。拟南芥对于长光照的反应依赖Constans(CO) 基因，但CO基因只能在叶片中诱导开花，而不能 在茎尖中直接诱导开花。CO基因促进开花的作用 又进一步依赖于其下游基因FT。有人通过构建FT 基因的诱导性表达载体，发现只需要在一个叶片 中诱导FT表达就足以促使植株开花，同时证明了 FT蛋白可以从叶片转运到茎尖生长点。这是首次 从分子水平证实了开花素的存在。
无缝克隆,同源重组克隆
简介（INTRODUCTION）原理：Gibson assembly是一种one step, one pot的快速基因组装方法。
它只需要将基因片段和需要的三种酶混合在同一个管内在50°C下培养15-60 min就可以得到组装好的DNA。
装配原理基于DNA片段间的重叠区域，过程依赖于三种酶：DNA 外切酶（T5 exonuclease）,高保真DNA聚合酶。
（Phusion polymerase）和耐热DNA连接酶（Taq DNA ligase）的共同作用。
首先，T5 核酸外切酶消化DNA片段的链方向是从5’到3’. 每个DNA片段分别形成一个单链的突出部分，由于着这两个相邻的突出片段有一部分具有同源性能够互补，所以DNA片段退火，互补的序列重新配对连接。
然后，在空缺的部分DNA聚合酶以另一条DNA 单链为模板，沿3' 方向将对应的脱氧核苷酸连接到单链上，填补缺口。
最后，连接酶将两条DNA 单链黏合起来，密封裂缝。
这样具有重叠区域的DNA片段就组装成一整条DNA分子了。
下面是组装的示意图。
材料（MATERIALS）试剂（REAGENTS）NAD，H2O ，1 M MgCl2，1 M DTT，10 mM dNTP mix，1 M Tris-HCl pH 7.5，50% PEG-8000，2.7 mg/ mL Tag ligase，0.85 μg/ mL T5_ExO，Phusion(1×)、LB培养基、抗生素（据载体而定）、LB平板（相应抗性）实验前准备（SETUP）于冰水浴中配制如下反应体系。
如果不慎将液体粘在管壁，可通过短暂离心使其沉入管底。
4x isothermal assembly bufferNAD 20 mgH2O 300 μL1 M MgCl2300 μL1 M DTT 300 μL10 mM dNTP mix 600 μL1 M Tris-HCl pH 7.5 3 mL50% PEG-8000 3 mL加水到7.5 mL，每管分500 μL存于-20°C 或-80°C冰箱,够3000个反应2× assembly mix: best combination:100 reaction 1 mL2.7 mg/ mL Tag ligase 10 μL0.85 μg/ mL T5_ExO 100 μLPhusion(1× ) 25 μL4× G.A. buffer 500 μL加水365 μL，存于-20°C冰箱，有效期1年。
同源重组的克隆方法
同源重组的克隆方法**《同源重组的克隆方法》**嘿，朋友！今天我要跟你唠唠同源重组的克隆方法，这可是个超级厉害的技术哟！首先，咱们得搞清楚啥是同源重组。
这就好比是两个失散多年的双胞胎，突然在茫茫人海中找到了彼此，然后手拉手紧紧拥抱在一起。
在分子生物学里呢，就是两段有相似序列的 DNA 片段，它们就像那对双胞胎一样，能精准地连接在一起。
那开始咱们的第一步，准备工作得做好！就像你要出门旅行，得先把行李收拾妥当。
你得有要克隆的目标 DNA 片段，还有载体 DNA ，这载体就像是一辆小货车，负责把咱们的目标 DNA 拉到目的地。
还有各种酶，比如限制性内切酶，这玩意儿就像是一把小剪刀，能把 DNA 剪成咱们想要的片段。
然后呢，进入第二步，用限制性内切酶把目标 DNA 和载体 DNA 都剪一剪。
这时候你得小心，别剪错地方啦，不然就像你出门剪坏了衣服，那可就尴尬喽！剪完之后，就得到了有粘性末端的 DNA 片段。
接下来第三步，这可是关键的一步！把剪好的目标 DNA 和载体DNA 放在一起，就像让两个拼图的边缘对齐。
这时候，它们那些相似的序列，也就是同源序列，就开始发挥作用啦，它们会互相吸引，就像磁铁的两极。
然后在一些酶的帮助下，比如 DNA 连接酶，它们就紧紧地连接在一起，形成了一个重组的 DNA 分子。
第四步，把这个重组的 DNA 分子转到细菌或者其他细胞里，让它们帮咱们复制和表达。
这就好比是把种子种到地里，等着它发芽长大。
我跟你说，我自己刚开始弄这个的时候，那真是状况百出。
有一次我着急忙慌地做实验，结果把酶加错了，那感觉就像是上错了车，完全跑偏啦！还有一次，我不小心把 DNA 样本弄混了，搞得我自己都晕头转向，简直是一场灾难！但是别怕，只要咱们按照步骤，一步一步来，多练习几次，肯定能掌握这个同源重组的克隆方法。
最后再跟你强调一下哈，每一步都得细心，准备工作要充分，酶不能加错，操作的时候要稳准狠。
相信我，等你熟练掌握了这个方法，那感觉就像是拥有了一把神奇的钥匙，可以打开好多科学的大门！好啦，朋友，快去试试这个同源重组的克隆方法吧，祝你成功！。
无缝克隆,同源重组克隆
简介（INTRODUCTION）原理：Gibson assembly是一种one step, one pot的快速基因组装方法。
它只需要将基因片段和需要的三种酶混合在同一个管内在50°C下培养15-60 min就可以得到组装好的DNA。
装配原理基于DNA片段间的重叠区域，过程依赖于三种酶：DNA 外切酶（T5 exonuclease）,高保真DNA聚合酶。
（Phusion polymerase）和耐热DNA连接酶（Taq DNA ligase）的共同作用。
首先，T5 核酸外切酶消化DNA片段的链方向是从5’到3’. 每个DNA片段分别形成一个单链的突出部分，由于着这两个相邻的突出片段有一部分具有同源性能够互补，所以DNA片段退火，互补的序列重新配对连接。
然后，在空缺的部分DNA聚合酶以另一条DNA 单链为模板，沿3' 方向将对应的脱氧核苷酸连接到单链上，填补缺口。
最后，连接酶将两条DNA 单链黏合起来，密封裂缝。
这样具有重叠区域的DNA片段就组装成一整条DNA分子了。
下面是组装的示意图。
材料（MATERIALS）试剂（REAGENTS）NAD，H2O ，1 M MgCl2，1 M DTT，10 mM dNTP mix，1 M Tris-HCl pH 7.5，50% PEG-8000，2.7 mg/ mL Tag ligase，0.85 μg/ mL T5_ExO，Phusion(1×)、LB培养基、抗生素（据载体而定）、LB平板（相应抗性）实验前准备（SETUP）于冰水浴中配制如下反应体系。
如果不慎将液体粘在管壁，可通过短暂离心使其沉入管底。
4x isothermal assembly bufferNAD 20 mgH2O 300 μL1 M MgCl2300 μL1 M DTT 300 μL10 mM dNTP mix 600 μL1 M Tris-HCl pH 7.5 3 mL50% PEG-8000 3 mL加水到7.5 mL，每管分500 μL存于-20°C 或-80°C冰箱,够3000个反应2× assembly mix: best combination:100 reaction 1 mL2.7 mg/ mL Tag ligase 10 μL0.85 μg/ mL T5_ExO 100 μLPhusion(1× ) 25 μL4× G.A. buffer 500 μL加水365 μL，存于-20°C冰箱，有效期1年。
分子克隆
3. 简并序列（degenerate ｓｅｑ ｕｅｎｃｅ）又称“松弛”特异识别， 即识别位点中某些核苷酸可以被其他 核苷酸替换。 ↓
如：ＡｖａⅡ：5，—Ｇ ＧＡ／ＴＣＣ—3， 3，—ＣＣＴ／ＡＧ Ｇ—5， ↑ ４.非回文结构： ↓ 如：ＭｂｏⅡ：5，—ＧＡＡＧＡＮ８—3， 3，—ＣＴＴＣＴＮ７—5， ↑
Ⅲ型RE；由两种亚基组成。需Mg++， ATP为辅助因子；切割位点靠近识别 序列但较难预测。一般在25~27bp范 围内切割。现已报道4种。
I、Ⅲ型RE酶同时具有限制(剪切)与修 饰(甲基化)两种功能并依赖于ATP， 切割DNA链的位置远离识别序列，因 此I型和Ⅲ型酶在DNA重组技术中都 不常用。
５.在酶反应缓冲体系中均添加有 二硫苏糖醇或β-巯基乙醇，以稳 定酶活性防止氧化。 ６.在具体试验操作时应在低温或 冰浴条件下完成。
二、DNA聚合酶 DNA polymerase
分子克隆常用的DNA聚合酶： 依赖DNA的大肠杆菌DNA聚合酶I。 Klenow片段。 T4噬菌体DNA聚合酶。 T7噬菌体DNA聚合酶。 经修饰的T7噬菌体DNA聚合酶。（测序 酶） 耐热DNA聚合酶。 依赖RNA 的DNA聚合酶。（逆转录酶）
4.切割后产生平头或粘性末端。
5.Ⅱ型RE酶只需Mg2+， 不需ATP。
Ⅱ型酶切割双链DNA可产生两种不同的切口 1. 平头末端(blunt end) 即在识别序列的 对称轴上进行切割，例如Hae Ⅲ识别序列 为5’-GGCC-3’，其切点在G与C之间； 2. 粘性末端(cohesive end) 即在识别序 列的两个对称点切开DNA双链，产生末端 带有单链尾巴的切口。粘性末端又可分为 两种：从DNA分子5’端切割产生5’端突出 的粘性末端称为5’粘性末端．如EcoRI； 从3’端切割产生3’端突出的粘性末端称为3’ 粘性末端，如Pst I。
分子克隆技术
Transformation
Culture in the medium containing antibiotic
E.Coli without vector die
E.Coli with vector grow
PCR
RT-PCR RTase
基因克隆需要一些工具酶。
Taq DNA Pol
Target DNA fragment
获取目的基因片段的几种方法：
（一）体外扩增法
1、DNA聚合酶链式反应（PCR）
2、逆转录-PCR（RT-PCR）NA的体外扩增 1、PCR
基本程序：
模板的变性 引物的退火 新链的延伸
如何利用PCR技术获得目的基因片段？
1、确定目的基因
G C T T A A A A T T C G
nick
Annealing
G A A T T C C T T A A G
nick
Sealed
T4 DNA ligase
Sealed
G A A T T C C T T A A G
T4 DNA连接酶连接单链切口：
应用T4 DNA连接酶时需注意的问题：
（1）低温操作。连接酶对温度非常敏感，很容 易失活。 （2）连接时，可根据厂家的建议选择最佳温度 和时间，一般16oC连接需要12-16小时。
CT……….. GA………. CC……….. GG………. GATCC…. G….
…..A …..TTCGA
…..G …..CTTAASticky endAGCTT…. A….
AATTC…. G….
有两种粘性末端：
1）5-端突出的粘性末端
5 ………GAATTC……… 3 3 …… CTTAAG……… 5
分子克隆技术（质粒DNA和DNA插入片段的制备、连接反应以及重组质粒的转化）
分子克隆技术（质粒DNA和DNA插入片段的制备、连接反应以及重组质粒的转化）克隆（Clone）是指通过无性繁殖过程所产生的与亲代完全相同的子代群体。
分子克隆（Molecular Cloning）是指由一个祖先分子复制生成的和祖先分子完全相同的分子群，发生在基因水平上的分子克隆称基因克隆（DNA克隆）。
其基本原理是：将编码某一多肽或蛋白质的基因（外源基因）组装到细菌质粒（质粒是细菌染色体外的双链环状DNA分子）中，再将这种质粒（重组质粒）转入大肠杆菌体内，这样重组质粒就随大肠杆菌的增殖而复制，从而表达出外源基因编码的相应多肽或蛋白质。
由于质粒具有不相容性，即同一类群的不同质粒常不能在同一菌株内稳定共存，当细胞分裂时就会分别进入到不同的子代细胞中，所以来源于一个菌株的质粒是一个分子克隆，而随质粒复制出的外源基因也就是一个分子克隆。
（一）质粒DNA的制备质粒是存在于细菌染色体外的能独立复制的双链闭环DNA分子，它能赋予细菌（宿主细胞）某些特定的遗传表型。
质粒并非细菌生长所必需，但由于其编码一些对宿主细菌有利的酶类，从而使宿主细菌具有抵抗不利自身生长的因素如抗药性等的能力。
目前发现的质粒主要分为F质粒（性质粒），R质粒（抗药性质粒），E.coli质粒（大肠杆菌肠毒素质粒）。
根据质粒在一个细胞周期内产生拷贝的数量，可将质粒分为严紧型（低拷贝，复制1-2次）和松弛型（高拷贝，复制10-200次）。
由于质粒的不相容性细菌经分裂后就只留下了拷贝数较高的一种质粒，例如R1和R2两种抗药性质粒同属于一类，由于不相容性使它们不能共存于同一细菌中，但不同类群的质粒可以在一个细菌中共存。
质粒存在于细菌中，所以制备质粒DNA时，首先应将含有质粒的细菌在含有相应抗生素的液体培养基中生长至对数期,使质粒在细菌中得到扩增。
通过离心收集细菌，经碱裂解细菌，使质粒和细菌染色体DNA变性，然后再加中和液，使溶液PH值恢复到中性，这样质粒DNA又可以复性至天然双链构象状态，而细菌染色体DNA不能或很难复性所以仍处在变性状态，这些变性的染色体DNA与变性蛋白质缠绕在一起，易被离心去处，而质粒DNA仍存在于水相中，再用无水乙醇沉质粒DNA，最后经离心即可得到质粒DNA。
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PCR反应体系(Takara PrimeSTAR)
PrimeSTAR Max Premix（2×） 25μL
Primer 1
1μL
Primer 2
1μL
ddH2O
22.5μL
Template
0.5μL
Total
50μL
*建议模版量小于10ng (尤其是模板为含目的基因片段的质粒)
PCR仪设置
98℃
10s
55℃
5s 30-35Cycles
72℃
30s/kb
72℃
30s/kb
12℃
+∞
*扩增条带特异时无需切胶回收， 可直接用DNA纯化试剂盒纯化
.
同源反应体系（Vazyme产品）
同源反应体系(标准版)
ddH2O
Up to 10 μl
5×CE II Buffer 线性化克隆载体 插入片段扩增产物
2 μl 25～100 ng 10～100 ng
分子克隆之同源克隆方法
第一部分---从头合成质粒
✓ 单片段克隆 ✓ 多片段克隆
第二部分---已有质粒改造
✓ 突变 ✓ 缺失 ✓ 插入
.
从头合成质粒 之
单片段克隆
.
单片段克隆流程图
从cDNA做PCR获取包含目 的基因CDS序列的片段
含目的基因片段的质粒
用含有质粒同源序列的引物做PCR扩增 出含质粒同源序列的目的基因片段
5’
质粒同源序列
PCR扩增出含质粒同源序列的目的基因片段
5’
.
3’
3’
5’
PCR产物纯化
目的载体线性 化（PCR或酶 切）及纯化
5’ 3’
3’ 5’
单片段克隆原理图二
+
线性化载体
3’--->5’外切酶活性
同源反应示意图
3’ 5’
5’ 3’
目的质粒
.
PCR反应体系(以Takara PrimeSTAR为例)
同源反应示意图
目的质粒
第三轮及之后. PCR线性化示意图
PCR反应体系(以Takara PrimeSTAR为例)
PCR反应体系(Takara PrimeSTAR)
PrimeSTAR Max Premix（2×） 25μL
Primer 1
1μL
Primer 2
1μL
ddH2O
22.5μL
3’ 5’ 5’ 3’
+
3’ 5’
突变位点设计在同源序列内
3’ 5’
5’
3’
3’
5’
线性化载体
同源反应
目的质粒
.
PCR反应体系(以Takara PrimeSTAR为例)
PCR反应体系(Takara PrimeSTAR)
PrimeSTAR Max Premix（2×） 25μL
Primer 1
1μL
用包含同源序列的引物做PCR 扩增出含同源序列的片段1
片段1 PCR产物 纯化
片段2
+ PCR产物
纯化
片段3
+ PCR产物
纯化
+… +
目的载体线性化 （PCR或酶切） 及纯化
同源反应
目的质粒
.
转化
多片段克隆原理图（方法一）---更适用于单个位置突变数较多
引物设计
5’ 3’
3’ 5’
5’ 多个片段PCR 3’ 及其产物纯化
6μl
Exnase® II
1 μl
Total
10μl
*已线性化质粒： pCDH‐EF1‐MCS‐IRES‐neo PCDNA3.1+ pcDNA6myc-His_A pDsRed-Monomer-C1 pEGFP-N1 pGEX-6P-1 …
.
从头合成质粒 之
多片段克隆
.
多片段克隆流程图
从cDNA PCR获取包含目的片段1 含目的片段1的质粒
.
同源反应体系（Vazyme产品）
同源反应体系(标准版)
多片段克隆同源反应体系（标准版）
ddH2O 5×CE MultiS Buffer 线性化克隆载体
插入片段扩增产物1 插入片段扩增产物2 插入片段扩增产物3 …… Exnase® MultiS Total
Up to 10 μl 2 μl
[0.01 × 片段碱基对数] ng (0.15 pmol) [0.01 × 片段碱基对数] ng (0.15 pmol) [0.01 × 片段碱基对数] ng (0.15 pmol) [0.01 × 片段碱基对数] ng (0.15 pmol)
已有质粒改造 之
突变
.
质粒突变流程图
以质粒为模版用包含同源序列的 引物做PCR，扩增得到线性质粒
PCR产物纯化 同源反应 目的质粒 转化
.
质粒突变原理图一
引物（实线） 需突变区域（渐变色）
第一轮PCR示意图
第二轮PCR示意图
第二轮PCR线. 性化示意图
质粒突变原理图二
第三轮及之后PCR示意图
Primer 2
1μL
ddH2O
22.5μL
Template
0.5μL
Total
50μL
*建议模版量小于10ng (尤其是模板为含目的基因片段的质粒)
PCR仪设置
98℃
10s
55℃
5s 30-35Cycles
72℃
30s/kb
72℃
30s/kb
12℃
+∞
*扩增条带特异时无需切胶回收， 可直接用DNA纯化试剂盒纯化
1 μl 10μl
.
*同源反应37℃ 30min，后置于冰上 5min
*同源反应产物全部用于转化 100μL感受态细菌 (慢病毒载体需要用Stbl3感受态)
*同源反应产物可保存于-20℃
*已线性化质粒： pCDH‐EF1‐MCS‐IRES‐neo PCDNA3.1+ pcDNA6myc-His_A pDsRed-Monomer-C1 pEGFP-N1 pGEX-6P-1 …
目的载体线 性化பைடு நூலகம்PCR 或酶切）及 纯化
3’ 5’ 5’ 3’
+
突变位点设计在同源序列内
3’
5’
5’
3’
3’
5’
线性化载体
同源反应
目的质粒
.
多片段克隆原理图（方法二）---适用于仅多片段融合或单个位置仅一个点突变
引物设计
5’
3’
5’ 多个片段PCR 3’
及其产物纯化
目的载体线 性化（PCR 或酶切）及 纯化
Exnase® II
1 μl
Total
10μl
同源反应体系(简便版)
*同源反应37℃ 30min，后置于冰上 5min
*同源反应产物全部用于转化 100μL感受态细菌 (慢病毒载体需要用Stbl3感受态)
*同源反应产物可保存于-20℃
5×CE II Buffer
2 μl
线性化克隆载体
1μl
插入片段扩增产物
PCR产物纯化
+
目的载体线性化（PCR 或酶切）及纯化
同源反应 目的质粒 . 转化
单片段克隆原理图一
cDNA
5’
CDS区域
AAA… 3’
PCR获取包含目的基因CDS序列的片段
与基因互补序列 （18-27bp）
5’
正向引物(实线) 3’
目的基因片段
质粒同源序列 （15-20bp）
目的基因片段 质粒
3’ 反向引物(实线)