实验8 污水中噬菌体的分离与效价测定
噬菌体的分离与纯化
大肠埃希氏杆菌噬菌体的分离与纯化【实验目的】1.培养自主查阅资料，自行设计、整理实验方案，自己安排实验的能力。
2.通过综合性大实验进一步掌握微生物实验的基本原理和技术、培养无菌意识。
3.培养互助协作的团队精神和分析解决问题的能力。
4.掌握从污水中分离和纯化大肠埃希氏菌噬菌体的原理。
5.掌握噬菌体的分离与纯化以及用双层琼脂平板法培养噬菌体的方法。
【实验原理】1.凡有寄主细胞存在的地方，一般都能找到其相应的噬菌体。
粪便和阴沟污水等往往是各种肠道细菌尤其是大肠杆菌的栖居地，故常能从其中分离到各肠杆菌噬菌菌株的相应噬菌体。
2.从自然界分离某一噬菌体的一般方法是：（1）培养寄主细胞（大肠杆菌）；（2）采集含有相应寄主细胞的噬菌体（阴沟污水）；（3）将样品内的细胞进行富集培养；（4）制备噬菌体裂解液；（5）检测噬菌体是否存在；（6）噬菌体的纯化及效价测定。
3.培养基的配制（配方）与灭菌（1）3×牛肉膏蛋白胨培养液：牛肉膏9克，蛋白胨30克，NaCl 15克，自来水1000ml,Ph 7.2-7.4.（2）牛肉膏蛋白胨培养液：牛肉膏3克，蛋白胨10克，NaCl 5克，自来水1000ml,Ph 7.2-7.4.（3）牛肉膏蛋白胨固体培养基：牛肉膏3克，蛋白胨10克，NaCl 5克，琼脂条20克，自来水1000 ml，Ph 7.2-7.4。
（4）牛肉膏蛋白胨琼脂半固体培养基：牛肉膏3克，蛋白胨10克，NaCl 5克，琼脂条7克，自来水1000ml,Ph 7.2-7.4。
封好做好标记于121℃灭菌20min备用【实验材料及器皿】1.菌种：大肠埃希氏菌。
2.噬菌体样品：矛坡的阴沟污水3.培养基：3×牛肉膏蛋白胨培养液，牛肉膏蛋白胨培养液，牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，牛肉膏蛋白胨琼脂半固体培养基。
4.仪器：离心机，恒温水浴锅，冰箱，恒温培养箱，高压灭菌锅，酒精灯，量筒，微量移液器及枪头，火柴，接种针，标记笔，无菌涂布棒，培养皿，试管，三角瓶，电热炉，玻璃棒，牛皮纸，纱布，PH试纸，橡皮筋。
噬菌体的效价测定
裂解 成熟
增殖
侵入 吸附
⑤
★烈性噬菌体与温和噬菌体旳生活史比较：
裂解性循环 屡次循环
溶原性循环
自发或诱导
同步复制 整合
⑥★溶源性菌株旳检验：
措施：在合适旳培养基中培养待测菌样→→在对 数期进行紫外线照射，诱导原噬菌体复制→→进 一步培养→→过滤培养物，去处活菌体→→滤液 与指示菌混合、倒平板（或将滤液加到敏感性指 示菌旳液体培养物中）→→观察是否有噬菌斑出 现（或使菌液变清）.
★一步生长（One-step growth)
成 熟 的 噬 菌 体 粒 子 ， 除 M13 等 少 数 噬 菌 体 外 ，均 借宿主细胞裂解而释放。细菌的裂解导致一种肉眼可 见 的培养物溶解。 噬菌体的这种生长 (繁 殖 )方 式 称 为 一步生长。
如果只观察一个被感染的细胞，噬菌体数目的增 殖过程将是一条垂直于时间的直线：
A mob of bacteriophage attacking E. coli
The oval object that stretches diagonally across the micrograph top-to-bottom is a single bacterium. The much smaller and far more numerous round guys, practically paving the surface of the bacterium, are the bacteriophage heads.
●敏感性指示菌——遇溶源菌裂解后所释放旳温和噬菌体 会裂解性生活周期旳非溶源性菌株，这些菌株能够从自然 界或菌种库中取得。
⑦★溶源菌有下列特征：
☆可稳定遗传，即溶源菌旳子细胞一般也是溶原性 旳。 ☆自发裂解和诱发裂解（具有产生噬菌体旳潜在能 力） ☆具有抗同原噬菌体感染旳“免疫性” ☆溶源性细菌旳复愈 ☆取得新旳生理特征（溶源性转变） ☆不足转导
噬菌体效价的测定
（4）为什么选用双层琼脂平板法测定噬菌体效价？
七.实验关键问题，注意事项及实验要求
1.关键问题：稀释，温度，倒板
2.注意事项：移液器使用及登记，
3.实验要求
4.预习报告（写清具体实验步骤），试管清洗，Tip回收，实验室卫生，保持安静，结果观察请于实验后第二日观察。
5.实验报告要求（清晰简洁，记录关键内容）
6.实验过程，实验报告及实验考核综合评定此次实验成绩。
八.物品准备
1.ER2738菌液：每组～10ml（注意保持无噬菌体污染）
2.M13KE：每组一只（1ml）
3.稀释用培养基：无菌水替代（TBS）
4.实验操作无需在超净台进行（原因，另外是否所有测定滴度的实验都可以）
5.EP管，Tip头用量
噬菌体效价的测定
一.目的要求
1.学习噬菌体效价测定的基本方法。
2.掌握双层琼脂平板法测定噬菌体效价的基本方法。
二、基本原理:
噬菌体的效价就是一毫升培养液中所含活噬菌体的数量。效价测定的方法，一般应用双层琼脂平板法。由于在含有特异宿主细菌的琼脂平板上，一个噬菌体产生一个噬菌斑，因此，能进行噬菌体的计数。但因噬菌斑计数方法其实际效率难以接近100%(一般偏低，因为有少数活噬菌体可能未引起感染)，所以为了准确地表达病毒悬液的浓度(效价或滴度)一般不用病毒粒子的绝对数量而是用噬菌斑形成单位(Plaque-forming units,简写成pfu)表示。
(2)凝固后，倒置37℃培养。记录培养时间
5．观察平板中的噬菌斑，将每一稀释度的噬菌斑数目记录于实验报告表格内，并选取 30～300个噬菌斑的平板计算每毫升未稀释的原液的噬菌体数（效价）。
噬菌体的检查及效价测定
【转贴】【加密0】噬菌体的检查及效价测定噬菌体的检查及效价测定[日期：2004-12-22] 来源：作者：孔庆学[字体：大中小]1 目的1.1 了解噬菌体效价的含义及其测定原理。
1.2 学会检查噬菌体的方法。
1.3 掌握用双层琼脂平板法测定噬菌体效价的操作技能。
2 原理噬菌体是一类专性寄生于细菌和放线菌等微生物的病毒，其个体形态极其微小，用常规微生物计数法无法测得其数量。
当烈性噬菌体侵染细菌后会迅速引起敏感细菌裂解，释放出大量子代噬菌体，然后它们再扩散和侵染周围细胞，最终使含有敏感菌的悬液由混浊逐渐变清，或在含有敏感细菌的平板上出现肉眼可见的空斑──噬菌斑。
了解噬菌体的特性，快速检查、分离，并进行效价测定，对在生产和科研工作中防止噬菌体的污染具有重要作用。
检样可以是发酵液、空气、污水、土壤等（至于无法采样而需检查的对象，可以用无菌水浸湿的棉花涂拭表面作为检查样品）。
为了易于分离可先经增殖培养，使样品中的噬菌体数量增加。
采用生物测定法进行噬菌体检查，约需12h左右，因而不能及时判断是否有噬菌体污染。
通过快速检查可大致确定是否有噬菌体污染，以采取必要的防治措施。
根据正常发酵（培养）液离心后菌体沉淀，上清液蛋白含量很少，加热后仍然清亮；而侵染有噬菌体的发酵（培养）液经离心后其上清液中因含有自裂解菌中逸出的活性蛋白，加热后发生蛋白质变性，因而在光线照射下出现丁达尔效应而不清亮。
此法简单、快速，对发酵液污染噬菌体的判断亦较准确。
但不适于溶源性细菌及温合噬菌体的诊断，对侵染噬菌体较少的一级种子培养液也往往不适用。
噬菌体的效价即１mL样品中所含侵染性噬菌体的粒子数。
效价的测定一般采用双层琼脂平板法。
由于在含有特异宿主细菌的琼脂平板上，一般一个噬菌体产生一个噬菌斑，故可根据一定体积的噬菌体培养液所出现的噬菌斑数，计算出噬菌体的效价。
此法所形成的噬菌斑的形态、大小较一致，且清晰度高，故计数比较准确，因而被广泛应用。
污水中分离的大肠杆菌噬菌体和金黄色葡萄球菌噬菌体生物学特性分析
污水中分离的大肠杆菌噬菌体和金黄色葡萄球菌噬菌体生物学特性分析污水中分离的大肠杆菌噬菌体和金黄色葡萄球菌噬菌体生物学特性分析摘要：噬菌体是一类能感染细菌并繁殖于其内的病毒，分为两种类型：单链DNA噬菌体和双链DNA噬菌体。
本研究从污水中分离出大肠杆菌噬菌体和金黄色葡萄球菌噬菌体，并分析了它们的生物学特性。
结果表明，大肠杆菌噬菌体能感染大肠杆菌并通过细菌溶菌酶破坏宿主细胞；金黄色葡萄球菌噬菌体能感染金黄色葡萄球菌并通过感染细菌释放DNA进行繁殖。
噬菌体具有尺寸小、繁殖快、寿命短等特点，对细菌种群结构和微生物生态系统具有重要影响。
关键词：噬菌体；大肠杆菌；金黄色葡萄球菌；污水；生物学特性一、引言污水中存在大量的微生物，其中许多是病原菌，对人类健康和环境安全造成潜在威胁。
噬菌体是一类天然存在于环境中的细菌病毒，具有感染细菌并繁殖于其内的特性。
本研究旨在分离和鉴定污水中的大肠杆菌噬菌体和金黄色葡萄球菌噬菌体，并分析它们的生物学特性，以期为噬菌体的应用和研究提供基础。
二、材料与方法1. 样品采集：从污水处理站收集污水样品，经过预处理后分别筛选出大肠杆菌和金黄色葡萄球菌阳性样品。
2. 噬菌体分离：对阳性样品进行稀释，利用双层琼脂糖平板进行噬菌体分离。
3. 鉴定噬菌体：通过电镜观察噬菌体颗粒形态和尺寸，并利用PCR对其DNA进行测序分析。
4. 生物学特性分析：包括对噬菌体寿命、寄主特异性、体外稳定性等进行分析。
三、结果与讨论1. 大肠杆菌噬菌体的生物学特性通过电镜观察发现，大肠杆菌噬菌体呈现典型的噬菌体形态，头部为多面体，尾部为纤维状。
其尺寸约为50-100纳米。
PCR 测序结果显示，大肠杆菌噬菌体的DNA序列与已知的大肠杆菌噬菌体基因组高度一致。
大肠杆菌噬菌体具有一定的寿命，根据实验结果可知，它们在寄主细胞内繁殖的速度较快，在几个小时内即可释放新的噬菌体颗粒，继续感染其他细菌。
噬菌体感染过程中，通过产生细菌溶菌酶等酶类分解宿主细胞，使细菌裂解释放出来。
噬菌体裂解液的制备、噬菌体效价测定及转导
4、转导频率的测定
向一支空试管中加入 0.5mL E. coli K12S，在 37℃恒温培养箱中培养 10min。用牛肉膏 蛋白胨液体培养基将原液稀释至 10-3、10-4，每个稀释度用 0.2mL 裂解液涂两个平板，在 37℃恒温箱中培养 48h，观察结果并计算转导频率： 转导子/mL = 每皿平均转导子数 ∗ 稀释度 ∗ 2 0.2mL
2、噬菌体效价的测定 将噬菌体裂解液活化后，取 0.5mL，用 4.5mL/管的牛肉膏蛋白胨液体培养基进行 10 倍 系列稀释至稀释到原液的 10-4。 将素琼脂培养基融化后向每个试管中加入 4mL50℃的素琼脂 液体，并向每支试管中加入 0.5mL E. coli K12S，振荡使之混合均匀，再分别取 10-2、10-3、 10-4 三个稀释度的噬菌体菌悬液 0.5mL 介入素琼脂试管中。前后揉搓，使之混匀，立即倒在 含有牛肉膏蛋白胨固体培养基的平板上。 倒置与 37℃恒温培养箱中培养 24h。 噬菌体效价计
噬菌体裂解液经紫外线照射诱导后，使得原噬菌体从细菌染色体上脱离而进入裂解周期， 在宿主细菌细胞内进行复制和组装，形成大量完整的噬菌体粒子。细菌被裂解，释放出游离 的噬菌体粒子，通过离心获得噬菌体裂解液。噬菌体的效价是指 1ml 噬菌体裂解液中所含 噬菌体的数目。在含有敏感宿主菌的琼脂平板上，噬菌体产生肉眼可见的噬菌斑，根据噬菌 斑形成单位，进行噬菌体效价测定。 转导分为两种类型，即为普遍性转导和局限性转导。本实验为局限性转导，以双重溶源 性细菌 E.coli K12F(λ )gal+为供体，经紫外线（UV）诱导，在噬菌体裂解液中，将含有两种 类型的噬菌体， （λ 和λ dg） ，λ dg 是缺陷噬菌体，其基因组上带有宿主菌的发酵半乳糖的 基因（gal） ，当缺陷性噬菌体λ dg 再次侵染敏感菌大肠杆菌 K12S 时，会将发酵半乳糖的基 因转移到 S 菌，使 S 菌获得 gal 基因，从而使得 S 菌获得发酵半乳糖的能力，利用转导子在 EMB 培养基上发酵半乳糖的特征进行转导频率的计算和分析。
噬菌体效价的测定
3、稀释噬菌体
取1mL含噬菌体液加入到 9mL牛肉 膏蛋白胨培养液中，采用10倍稀释法， 分别制备噬菌体稀释液（10-5、 10-6 、 10-7 ）。
4、噬菌体与大肠杆菌敏感菌混合
将已加有大肠杆菌敏感菌9皿平板 （ 10-5 、 10-6 、 10-7各3皿）中，分别 加入0.1mL噬菌体稀释液，混合后放置5 分钟。
混匀（动作？）
37℃培养5小时或 室温培养12小时
观察结果计数
教科书介绍方法的操作步骤
噬菌体稀释液 大肠杆菌培养液
0.1ml
0.9ml
混匀吸附5min
45~48℃溶化好牛肉膏 蛋白胨半固体培养基
4ml
搓动混匀后倒于 有底层的平板中
铺平
37 ℃培养5~6 小时，观察计数
思考题
1、记录结果，并进行统计分析。
实验内容三 噬菌体效价的测定
一、噬菌体效价测定的方法 （梯度稀释）
▪ 斑点试验法 ▪ 液体稀释试管法——以不长菌判断（澄清） ▪ 双层平板法——最常用，优点较多 ▪ 单层平板法 ▪ 载玻片法——快速 ▪ 其它病毒的效价（计数）测定——空斑计数、
电子显微镜直接计数、免疫学间接测定（凝 集、ELISA——酶标仪）
实验内容二 噬菌体知识介绍
一、几个重要概念
1、噬菌体： ▪ 是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等
微生物的病毒，分布极广，个体很小， 在光学显微镜下看不见，需用电镜观察。 ▪ 不同的噬菌体在电镜下有三种形态：蝌 蚪形、微球形和丝形。大多数噬菌体呈 蝌蚪形，由头部和尾部两部分组成。
2、噬菌斑：
在混浊的细菌菌面（菌苔）上形成的透 明区域，是由噬菌体不断侵染宿主细胞 裂解形成的，其形状、大小不等。
噬菌体的分离
按前面方法制备噬菌体裂解液
6.计数（效价测定） 计数（效价测定） 计数 在平板中倒入50℃下层培养基10-15mL,冷凝 用0.9mL无菌肉汤将噬菌体裂解液做10倍系列稀释 在4mL 48℃上层培养基中加入0.1mL噬菌体稀释液和菌液 0.9mL，用双手前后搓动 使混匀，立即倒入下层平板上 将平板倒置于37℃培养12-16h,统计噬菌斑数目
37℃，24h
3.制备噬菌体裂解液 制备噬菌体裂解液
方法1：离心法： 离心3000转/分，15min. 氯仿（0.5mL/10mL上清液） 振荡5min 离心3000转/分，15min.
增值混合液
方法2：过滤法：P142
离心4000转/分，15min.
上清液
离心4000转/分，15min.
0.22µm无菌过滤器过滤
计算噬菌体效价 噬菌体效价=pfu数×稀释倍数×10 噬菌体效价 数 稀释倍数×
报告要求 1、P143：1.结果 2、 P143：思考题（2）、（3）、（4）、 （5）、（6） 3. P145：1.结果 4.P145：2.思考题 （1）、（2）（3）、（4）
步 祝 你 进
?1个噬菌体与1个宿主细菌可构成1个感染单位中心采集样品增殖噬菌体制备噬菌体裂解液检验噬菌体纯化增值计数保藏配制3倍料培养基制备菌悬液双层平板法制备噬菌体裂解液三技术路线无菌试验五实验内容大肠杆菌噬菌体的分离纯化和计数枯草芽孢杆菌噬菌体的分离纯化和计数任选一种每45人为一个实验小组2周时间完成4ml无菌水大肠杆菌菌悬液大肠杆菌斜面1
大肠杆菌噬菌体分离 枯草芽孢杆菌噬菌体分离
大肠杆菌斜面 4mL无菌水
枯草芽孢杆菌斜面 4mL无菌水
大肠杆菌菌悬液
枯草芽孢杆菌菌悬液
2.增殖噬菌体 增殖噬菌体 污水200mL 大肠杆菌菌悬液2mL 感染噬菌体发酵液200mL 枯草芽孢杆菌菌悬液2mL
鸡源粪肠球菌噬菌体的分离及生物学特性初步分析
·研究论文·Chinese Journal of Animal Infectious Diseases中国动物传染病学报摘 要：为将噬菌体应用于防控与治疗鸡源粪肠球菌感染提供依据，本研究从养殖场污水中分离鸡源粪肠球菌噬菌体，利用双层平板培养法纯化分离噬菌体，10倍倍比稀释噬菌体滤液，观察噬斑测定其效价和最佳感染复数，绘制其一步生长曲线，点斑法测定其宿主谱；检测温度、紫外线照射、pH 等对噬菌体活性影响；负染法透射电镜观察噬菌体形态。
结果显示，从污水中分离出3株（EFC1、EFC2、EFC3）裂解粪肠球菌噬菌体，效价分别为6×108、6×109、2×1010 PFU/mL ，最佳MOI 分别为1、0.01、0.001，噬菌体感染潜伏期为80~120 min ，暴发期为10~20 min ，裂解量为3~71 PFU 。
3株噬菌体能裂解多株鸡源粪肠球菌，热稳定性较好，不耐受高于50℃的环境温度，对紫外线敏感，适应pH 宽（4~12）；电镜观察噬菌体为蝌蚪形，属于有尾噬菌体目长尾噬菌体科。
噬菌体对鸡源粪肠球菌的生长均具有一定抑杀作用，有望成为防控耐药粪肠球菌的抗生素替代产品。
关键词：鸡源粪肠球菌；噬菌体；生物学特性中图分类号： S852.61文献标志码：A文章编号：1674-6422（2023）06-0053-08Isolation and Preliminary Analysis of Biological Characteristics of Chicken-DerivedEnterococcus faecalis Phages收稿日期：2021-05-25基金项目：河北省科技厅农业高质量发展关键共性技术攻关专项（19226609D）作者简介：王琦，女，硕士，主要从事畜禽安全生产与控制通信作者：刘娜，E-mail：****************鸡源粪肠球菌噬菌体的分离及生物学特性初步分析王 琦1，刘彦威1,2,3，刘 娜1,2,3，刘利强1,2,3，崔国林1,2,3，邓云贵1，刘东海1，李 想1（1.河北工程大学生命科学与食品工程学院，邯郸056038；2.河北省禽病工程技术研究中心，邯郸056038；3.邯郸市动物医学重点实验室，邯郸056038）2023,31(6):53-60Abstract: To provide a basis for the application of bacteriophages in the prevention, control and treatment of chicken-derived Enterococcusfaecalis infection, chicken-derived E. faecalis phages were isolated from farm sewage. The isolated bacteriophages were then purified and separated using a double-layer plate culture method, The phage fi ltrates were 10-fold serially diluted for titration and MOI determination as well as one-step growth curve and host spectrum by spot method. The effects of temperature, UV irradiation, pH on phage activity were also examined in the study. Phage morphology was observed under transmission electron microscopy (TEM) with negative staining. The results showed that three phages (EFC1, EFC2, EFC3) isolated from sewage lysed E. faecalis with titers of 6×108, 6×109, 2×1010 PFU/mL and the optimal MOI at 1, 0.01, 0.001. Moreover, this experiment also determined the incubation period at 80-120 min for phage infection, the burst period for 10-20 min, and the amount of lysis at 3-71 PFU. Three phages were capable of lysing multiple strains of E. faecalis of chicken origin and heat stable but did not tolerate ambient temperatures above 50℃. These phages were sensitive to UV light and adapted to a wide pH4-pH12). Morphological examination under electron microscopy showed that the phages were tadpole shaped, which belonged to the family ofCaudovirales , Siphoviridae. In addition, these bacteriophages had a certain inhibitory effect on the growth of chicken-derived E. faecalis , which might serve as an alternative antibiotic product for the prevention and control of drug-resistant strains.Key words: Chicken-derived Enterococcus faecalis ; Phage; Biological characteristics W ANG Qi 1, LIU Yanwei 1,2,3, LIU Na 1,2,3, LIU Liqiang 1,2,3, CUI Guolin 1,2,3, DENG Y ungui 1,LIU Donghai 1, LI Xiang 1(1. College of Life Science and Food Engineering, Hebei University of Engineering, Handan 056038, China; 2. Hebei Engineering ResearchCenter for Poultry Diseases, Handan 056038, China; 3. Handan Key Laboratory of Veterinary Medicine, Handan 056038, China)· 54 ·中国动物传染病学报2023年12月粪肠球菌是存在于人与动物肠道中的正常菌群，也是重要的机会致病菌。
噬菌体裂解液的制备和菌种的保藏、噬菌体效价的测定、细菌转导测定、凝聚反应、沉淀反应
凝集反应是指颗粒型抗原与相应抗体混合时，在电解质的影响下，形成肉眼可见的凝集块。电解质的作用主要是消除抗原-抗体复合物表面的电荷，使其失去同种电荷相斥的作用，抗原-抗体复合物失稳而相互凝聚。温度升高加速分子运动使凝集反应速度加快，一般反应在37℃或56℃水浴中进行。发生明显凝集反应（反应强度为++）的最高稀释度的倒数值为该免疫血清的效价。凝集反应试验可分为玻片凝集试验和试管凝集试验。前者的优点是简便快速，是鉴定传染病标本细菌的重要手段。后者是一种定量方法，可利用已知抗原鉴定相应抗体的效价。
2、细菌转导的测定
转导可以分为两种类型，即普遍性转导和局限性转导。本实验为局限性转导，以双重溶原性细菌E. coli K12 F(λ)gal-为供体，经紫外线（UV）诱导，在噬菌体裂解液中将含有两种类型的噬菌体（λ和λdg）。λdg是缺陷噬菌体，其基因组上带有宿主菌的发酵半乳糖的基因(gal)，当缺陷型噬菌体λdg再次侵染敏感菌大肠杆菌K12 S时，会将发酵半乳糖的基因转移到S菌，使S菌获得基因gal，从而使S菌获得发酵半乳糖的能力。利用转导子在EMB培养基上发酵半乳糖的特征进行转导频率的计算和分析。
1.取0.5mLE.coli K12S,37C预热10分钟
2.取0.5mL裂解液,37C预热10分钟
3.把上述S菌和裂解液混合均匀，37C预热10分钟
4.用牛液把混合液稀释至10-3及10-4
5.取10-3及10-4稀释度0.2mL涂布EMB平板,于37C培养至少48hr,观察结果
3、凝集反应
按图加抗原和抗体及对照，静置5~10min，先用肉眼观察，后用显微镜在低倍镜下观察。
[实验材料]
菌种：大肠杆菌E.coliK12 Fgal+（双重溶源菌，含有λ噬菌体和缺陷型噬菌体λdg的基因组，发酵半乳糖）；大肠杆菌E. coliK12Sgal-（非溶源菌，对噬菌体敏感，不发酵半乳糖）
大肠杆菌噬菌体的分离纯化及效价的测定
噬菌体的分离纯化及效价的测定1 目的1.1 了解噬菌体效价的含义及其测定原理。
1.2 学会检查噬菌体的方法。
1.3 掌握用双层琼脂平板法测定噬菌体效价的操作技能。
2 原理噬菌体是一类专性寄生于细菌和放线菌等微生物的病毒，其个体形态极其微小，用常规微生物计数法无法测得其数量。
当烈性噬菌体侵染细菌后会迅速引起敏感细菌裂解，释放出大量子代噬菌体，然后它们再扩散和侵染周围细胞，最终使含有敏感菌的悬液由混浊逐渐变清，或在含有敏感细菌的平板上出现肉眼可见的空斑──噬菌斑。
了解噬菌体的特性，快速检查、分离，并进行效价测定，对在生产和科研工作中防止噬菌体的污染具有重要作用。
检样可以是发酵液、空气、污水、土壤等（至于无法采样而需检查的对象，可以用无菌水浸湿的棉花涂拭表面作为检查样品）。
为了易于分离可先经增殖培养，使样品中的噬菌体数量增加。
采用生物测定法进行噬菌体检查，约需12h左右，因而不能及时判断是否有噬菌体污染。
通过快速检查可大致确定是否有噬菌体污染，以采取必要的防治措施。
根据正常发酵（培养）液离心后菌体沉淀，上清液蛋白含量很少，加热后仍然清亮；而侵染有噬菌体的发酵（培养）液经离心后其上清液中因含有自裂解菌中逸出的活性蛋白，加热后发生蛋白质变性，因而在光线照射下出现丁达尔效应而不清亮。
此法简单、快速，对发酵液污染噬菌体的判断亦较准确。
但不适于溶源性细菌及温合噬菌体的诊断，对侵染噬菌体较少的一级种子培养液也往往不适用。
噬菌体的效价即１mL样品中所含侵染性噬菌体的粒子数。
效价的测定一般采用双层琼脂平板法。
由于在含有特异宿主细菌的琼脂平板上，一般一个噬菌体产生一个噬菌斑，故可根据一定体积的噬菌体培养液所出现的噬菌斑数，计算出噬菌体的效价。
此法所形成的噬菌斑的形态、大小较一致，且清晰度高，故计数比较准确，因而被广泛应用。
3 材料3.1菌种敏感指示菌（大肠杆菌）、大肠杆菌噬菌体(从阴沟或粪池污水中分离)。
3.2培养基二倍肉膏蛋白胨培养液，上层肉膏蛋白胨半固体琼脂培养基（含琼脂0.7%，试管分装，每管５mL），下层肉膏蛋白胨固体琼脂培养基（含琼脂2%），1%蛋白胨水培养基。
水生微生物实验法
《水生微生物实验法》——噬菌体的分离录入时间:2010-9-13 13:58:30 来源：青岛海博噬菌体广泛分布于自然界中，凡有细菌存在的地方，就有可能有其相应的噬菌体出现，那末就可能从海水、淡水和污水中，甚至是海泥或海产品中分离到噬菌体．1 ．水中噬菌体的分离常用的方法有滤菌器过滤法和加热法两种。
（1）过滤法：取水样300 毫升．加到100 毫升四倍浓度肉汤蛋白胨培养基内，再加入要分离的噬菌体的相应幼龄（如肠道细菌，经6-8小时培养）菌液3-4 毫升。
在37℃孵育18-24 小时后，以每分钟2000转速离正沉淀30 分钟．上清液经赛氏滤菌器过滤，滤液鉴定．（2）加热法：由于使用滤菌器过滤，常能吸附一部分噬菌体．若液体内噬菌体数量不多时，较难分离成功。
而加热法是根据噬菌体的耐热性较一般无芽胞细菌高，故用较高的温度将大部分细菌杀死，噬菌体仍保存着，经过多次反复，使液体中的噬菌体数量增多．最后经过滤器的液体则含有众多的噬菌体。
分离过程如下：将5-10 毫升污水加至10-20加毫升肉汤内，混合后加热56 ℃小时或60℃半小时，取出离心（每分钟1500转）沉淀10 分钟。
取上清液2-4 毫升加于5-10 毫升肉汤培养基中，再加幼龄的相应菌液0.5毫升，在37℃培养18-20 小时，重新加温，离心沉淀，取上清液加于肉汤中，加菌液、培养。
如此反复3-4 次，最后经赛氏滤菌器过滤，滤液供鉴定。
2 ．噬菌体的鉴定将已知菌密密地涂布于肉汤蛋白胨琼脂平板表面上，取待测的噬菌体液滴于平板上，每板分成三等分，每份1 滴．在37℃下培养24小时后．检查有无透明菌斑出现，以说明滤液中是否含有已知菌的相应噬菌体．3 ．从贝类中分离纯化噬菌体现已知有100多种病毒可从人或动物肠道，或其他分泌物中排泄出来．而污染水源，而贝类动物及其他功物能聚集人类致病性病毒．不少学者报道在海水、海洋浮游生物、海产贝类和污水中发现，并分离出病毒。
实验十二 噬菌体效价的测定
实验十二噬菌体效价的测定一、实验目的1、学习并掌握噬菌体效价的测定原理。
2、学习并掌握双层琼脂平板法测定噬菌体效价。
二、实验原理噬菌体属于细菌病毒，它不具备完整的细胞结构，只能通过寄主细胞完成自我复制。
因此人类只有通过电子显微镜才可观察到它们的形态结构。
但由于噬菌体侵染细菌细胞后，可导致寄主细胞裂解死亡，并在琼脂培养基表面形成是菌斑，所以人们可以此来判断噬菌体的存在。
当烈性噬菌体侵染敏感细菌后,会迅速引起敏感细菌裂解，释放出大量子代噬菌体，然后它们再扩散和侵染周围细胞，结果就会在菌苔上形成一个具有一定形状、大小、边缘和透明度的肉眼可见噬菌斑(plague)。
噬菌体的效价：１mL样品中所含侵染性噬菌体的粒子数。
其测定常用双层琼脂平板法。
由此得到的噬菌斑形态、大小较一致且清晰度高，计算准确。
根据不同稀释度平板上出现的噬菌斑数目，即可算出原液噬菌体的效价。
双层琼脂平板的配制：底层平板（1.5~2％琼脂的LB培养基10ml)，将适当稀释的噬菌体与培养至对数期的受体菌混合，保温吸附，加入45°左右的半固体琼脂糖，迅速混匀铺平板作为上层。
计算公式：噬菌体效价(pfu/ml)=噬菌斑数×稀释倍数×10；（这里的10为换算单位，即实验中用到100μl噬菌体原液，换算成1000μl，即1ml时，要乘以10）三、操作步骤流程图流程步骤目的1、制备9套LB 固体培养基底层平板将融化并冷却至45℃左右的LB培养基倒入无菌培养皿，每皿约10~12ml.水平放置，凝固后做好稀释度标记。
1、提供细菌生长营养物质2、提供更加平整的平面2、制备噬菌体稀释液取0.5mL噬菌体原液于4.5mL无菌水中得到10-1稀释液。
再取0.5ml10-1稀释液于4.5ml缓冲液中得到10-2稀释液。
同理再制备10-3稀释液，并在试管上标记备用。
（稀释过程应充分混匀）通过连续稀释使单个噬菌体吸附一个大肠杆菌细胞。
3、制备受体菌细胞将感受态大肠杆菌接种于50ml LB培养液，经过夜培养，离心收集菌体细胞，悬浮于20ml10mM MgSO4中备用。
实验8 污水中噬菌体的分离与效价测定
问题
如果采用这种方法，看不到抑菌圈，可以 说明的是哪些情况？
如何进行噬菌体的纯化
挑取单一清晰可见的单个噬菌斑，接种液 体培养基，并加入相同指示菌，重复上述 从加入氯仿开始的各个试验步骤，得到噬 菌斑 重复多次，可以得到由一个噬菌体的后代 形成的噬菌斑，即获得了纯化的噬菌斑。 观测噬菌斑的特征
如何测定噬菌体的效价
每个初次分离的噬菌斑可能含有多种噬菌 体，要获得单一的噬菌体，必需进行噬菌 体的纯化。
肉眼如何判定噬菌体是否已经 纯化？
噬菌体效价的测定（以下开始自己做）
仔细观察提供的平皿，选取边缘清晰的单个噬菌斑 用灭菌移液器枪头轻轻挑取噬菌体斑到装有1ml培养 液的1.5ml Eppendrof管中，震荡2-3分钟。 采用1ml 针筒吸取1ml 混合液，于0.22um滤膜过滤。 滤液收集在一个新的无菌1.5ml Eppendrof管中，获 得噬菌体滤液的原液。 每组取7个1.5ml 的Eppendrof离心管，分别标注 10-1、 10-2、 至 10-7。 每个Eppendrof离心管分别各加900ul LB，从噬菌体滤 液中取100ul 于10-1离心管中，混匀后，取100ul 于 10-2离心管中，依次类推10倍倍比递减稀释至-7。 （一个移液枪头用到底）
实验七
污水中噬菌体的分离、纯化与效 价测定
实验目的
掌握噬菌体分离的基本原理和方法 学会观察噬菌斑 了解噬菌体纯化、效价测定方法
基本原理
噬菌体是专性寄生物，必需寄生细菌才能繁殖，伴随 细菌的分布而分布，只要有细菌的地方，就有噬菌体 噬菌体颗粒可以在环境中独立存活，但不能繁殖 噬菌体对宿主的寄生通常具有特异性 温和噬菌体和烈性噬菌体 烈性噬菌体在液体中，可以使浑浊的菌液变为澄清 烈性噬菌体在固体琼脂平板，可以形成透明的噬菌斑 利用噬菌体斑的特征可以分离、纯化、效价滴定
噬菌体分离实验报告
1. 学习噬菌体的分离方法。
2. 掌握噬菌体纯化技术。
3. 了解噬菌体形态和生物特性的观察。
二、实验原理噬菌体是一种感染细菌的病毒，具有高度的特异性。
噬菌体分离实验是通过在含有细菌的培养基上加入噬菌体，观察噬菌体对细菌的裂解作用，从而分离出纯化的噬菌体。
三、实验材料1. 实验组：大肠杆菌（Escherichia coli）菌种、噬菌体培养液、琼脂平板、无菌镊子、无菌滴管等。
2. 对照组：大肠杆菌菌种、无菌水、琼脂平板、无菌镊子、无菌滴管等。
四、实验步骤1. 制备培养基：将大肠杆菌菌种接种于牛肉膏蛋白胨培养基，37℃培养18小时。
2. 分离噬菌体：取一定量的噬菌体培养液，加入适量的无菌水进行稀释，取一定量的稀释液加入琼脂平板中，轻轻摇匀。
3. 制备平板：将制备好的培养基倒入平板中，待凝固后，用无菌镊子取适量的大肠杆菌菌液均匀涂布在平板表面。
4. 孵育平板：将平板倒置，37℃恒温培养24小时。
5. 观察结果：观察平板上的菌落，找出裂解斑，即噬菌体感染后的菌落。
6. 纯化噬菌体：用无菌镊子夹取裂解斑边缘的菌落，接种于新的琼脂平板中，37℃恒温培养24小时。
7. 观察纯化结果：观察平板上的菌落，若出现单菌落，则表明噬菌体已纯化。
8. 观察噬菌体形态和生物特性：将纯化的噬菌体培养液置于透射电镜下观察，观察噬菌体的形态。
同时，进行噬菌体的吸附实验、裂解实验等，了解噬菌体的生物特性。
1. 分离噬菌体：平板上出现裂解斑，表明噬菌体已成功分离。
2. 纯化噬菌体：平板上出现单菌落，表明噬菌体已纯化。
3. 噬菌体形态：透射电镜下观察到噬菌体呈长圆柱形，具有尾丝。
4. 噬菌体生物特性：吸附实验和裂解实验均表明噬菌体具有感染大肠杆菌的能力。
六、实验讨论1. 实验过程中，要注意无菌操作，避免污染。
2. 噬菌体分离实验的关键是裂解斑的观察，裂解斑的出现表明噬菌体已成功分离。
3. 噬菌体纯化过程中，要注意纯化程度的判断，避免杂菌污染。
噬菌体效价的测定方法
噬菌体效价的测定方法噬菌体效价的测定方法1. 引言噬菌体效价的测定方法是研究噬菌体杀菌能力的重要手段。
本文将详细介绍几种常用的噬菌体效价测定方法。
2. 噬菌体效价测定方法斑点法斑点法是最常用的测定噬菌体效价的方法之一。
具体步骤如下：1.准备一系列浓度递减的噬菌体溶液。
2.在琼脂平板上均匀涂敷被测细菌悬浮液。
3.取一定体积的已知浓度的噬菌体溶液滴在已涂敷的平板上，静置一段时间。
4.观察液滴周围是否出现菌落溶解区，根据出现溶解区的数量和大小，推断噬菌体的效价。
流式细胞术法流式细胞术法是一种快速测定噬菌体效价的方法，适合大规模实验。
具体步骤如下：1.准备一系列浓度递减的噬菌体溶液。
2.将被测细菌悬浮液加入流式细胞仪中，通过光散射和荧光信号检测细菌的状态。
3.依据细菌的状态判断噬菌体的效价。
确定感染能力的法确定感染能力的法是一种精确测定噬菌体效价的方法，可以测定细菌在固定时间内被噬菌体感染的能力。
具体步骤如下：1.准备一系列浓度递减的噬菌体溶液。
2.将细菌与噬菌体溶液接触一定时间后，离心沉淀细菌。
3.通过对沉淀细菌进行计数或直接培养识别，确定细菌被感染的数量。
4.根据感染数量和噬菌体浓度计算噬菌体的效价。
3. 结论本文介绍了斑点法、流式细胞术法和确定感染能力的法三种常用的噬菌体效价测定方法。
这些方法各有优缺点，研究者可以根据实际需求选择合适的方法进行噬菌体效价的测定。
4. 斑点法的优点和缺点优点•斑点法操作简单，易于掌握。
•可以同时测定多个噬菌体效价，提高效率。
•结果直观，通过观察菌落溶解区可以准确判断噬菌体效价。
缺点•斑点法需要较长的时间来观察菌落溶解区的形成，耗时较长。
•结果的定量分析相对不准确，只能通过观察溶解区数量和大小来推测效价。
•受到环境因素的影响较大，如温度、湿度等。
5. 流式细胞术法的优点和缺点优点•流式细胞术法速度快，可对大量样本进行高通量分析。
•结果定量准确，可以精确地获得细菌的状态信息。
[资料]噬菌体的分离与纯化
![[资料]噬菌体的分离与纯化](https://img.taocdn.com/s3/m/429fc13c3069a45177232f60ddccda38376be189.png)
大肠埃希氏杆菌噬菌体的分离与纯化【实验目的】1.培养自主查阅资料，自行设计、整理实验方案，自己安排实验的能力。
2.通过综合性大实验进一步掌握微生物实验的基本原理和技术、培养无菌意识。
3.培养互助协作的团队精神和分析解决问题的能力。
4.掌握从污水中分离和纯化大肠埃希氏菌噬菌体的原理。
5.掌握噬菌体的分离与纯化以及用双层琼脂平板法培养噬菌体的方法。
【实验原理】1.凡有寄主细胞存在的地方，一般都能找到其相应的噬菌体。
粪便和阴沟污水等往往是各种肠道细菌尤其是大肠杆菌的栖居地，故常能从其中分离到各肠杆菌噬菌菌株的相应噬菌体。
2.从自然界分离某一噬菌体的一般方法是：（1）培养寄主细胞（大肠杆菌）；（2）采集含有相应寄主细胞的噬菌体（阴沟污水）；（3）将样品内的细胞进行富集培养；（4）制备噬菌体裂解液；（5）检测噬菌体是否存在；（6）噬菌体的纯化及效价测定。
3.培养基的配制（配方）与灭菌（1）3×牛肉膏蛋白胨培养液：牛肉膏9克，蛋白胨30克，NaCl 15克，自来水1000ml,Ph 7.2-7.4.（2）牛肉膏蛋白胨培养液：牛肉膏3克，蛋白胨10克，NaCl 5克，自来水1000ml,Ph 7.2-7.4.（3）牛肉膏蛋白胨固体培养基：牛肉膏3克，蛋白胨10克，NaCl 5克，琼脂条20克，自来水1000 ml，Ph 7.2-7.4。
（4）牛肉膏蛋白胨琼脂半固体培养基：牛肉膏3克，蛋白胨10克，NaCl 5克，琼脂条7克，自来水1000ml,Ph 7.2-7.4。
封好做好标记于121℃灭菌20min备用【实验材料及器皿】1.菌种：大肠埃希氏菌。
2.噬菌体样品：矛坡的阴沟污水3.培养基：3×牛肉膏蛋白胨培养液，牛肉膏蛋白胨培养液，牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，牛肉膏蛋白胨琼脂半固体培养基。
4.仪器：离心机，恒温水浴锅，冰箱，恒温培养箱，高压灭菌锅，酒精灯，量筒，微量移液器及枪头，火柴，接种针，标记笔，无菌涂布棒，培养皿，试管，三角瓶，电热炉，玻璃棒，牛皮纸，纱布，PH试纸，橡皮筋。
噬菌体效价及转导实验
噬菌体效价测定及转导姓名学号：系别：生命科学学院生物科学专业班号：实验日期：4月26日、5月3日同组同学：实验目的1.学习噬菌体效价测定的方法2.了解转导原理、学习转导实验方法实验材料菌种：E. coli K12 F、E. coli K12S、噬菌体裂解液培养基：牛肉膏蛋白胨液体培养基、 EMB培养基、牛肉膏蛋白胨固体培养基实验原理1.噬菌体的效价就是一毫升培养液中所含活噬菌体的数量。
效价测定的方法，一般应用双层琼脂平板法。
由于含有特异宿主细菌的琼脂平板上，一个噬菌体产生一个噬菌斑2.噬菌体的悬浮液是由双重溶源菌（内含一个λ及一个λdg两种噬菌体）裂解而来的，因此λ及λdg两种噬菌体是等量的。
3. λ噬菌体能够侵染大肠杆菌并能使其裂解，因此能够形成噬菌斑；λdg噬菌体能够侵染大肠杆菌但不能使其裂解，因此不能够形成噬菌斑4.噬菌体效价/噬菌体数/ml=每皿平均噬菌斑数*稀释倍数/0.5ml*2 （λdg不能够形成噬菌斑且其数量与λ相等，因此计算时乘以2）5. λdg是缺陷型噬菌体，其基因组上带有宿主菌的发酵半乳糖的基因。
当λdg侵染S菌的时候，就能够使得S菌具有发酵半乳糖的能力，因此菌落也会显现出发酵半乳糖的特征（菌落有金属光泽）。
6.转导子数/ml=每皿平均转导子数*稀释倍数/0.1ml*2 （因为裂解液为0.5ml，所以要乘以2）；转导频率=转导子/ml./噬菌体效价*100%实验步骤一、噬菌体效价的测定1）熔化100mlEMB固体培养基、100ml牛肉膏蛋白胨固体培养基2将熔化的EMB培养基中加入6.5ml的0.1%的美蓝和2ml的2%的伊红3）用100ml熔化的EMB培养基倒六个平板。
编号EMB1-EMB64）用100ml熔化的牛肉膏蛋白胨固体培养基倒4个平板。
编号牛固1-牛固5）水浴加热5管素琼脂，溶解后置于50摄氏度下保温。
6）稀释裂解液：取0.5ml裂解液，加入到4.5ml牛肉膏蛋白胨液体培养基，稀释成了10^-1的稀释液，以此方法，再稀释到10^-2、10^-3、10^-4.并做好标记。
噬菌体的分离和鉴定
噬菌体的分离和鉴定部分菌株对应的噬菌体分离过程步骤：1、噬菌体分离(1) 以新鲜鸽粪4g 加入100ml 普通液体培养基内，放入37 ℃温箱培养24h。
(2) 次日从中取出10ml70 ℃加热30min ,离心2000r/ 10min ,上清液用滤器过滤后保存于4 ℃冰箱备用。
(3) 在普通琼脂平板底面分别注明1、2、3 号。
(4)在1 号平板接种事先培养好的6h 幼龄菌乙型副伤寒杆菌一接种环；2 号平板接种幼龄菌福氏痢疾杆菌一接种环;3 号平板接种幼龄菌大肠杆菌一接种环,各平板的细菌密集涂布于琼脂平板表面。
(5) 再用无菌接种环取鸽粪培养滤液一接种环,分别滴加于3 个已接种细菌的平板中央,放入37 ℃温箱孵育24h。
2、噬菌体的分离和鉴定先后从农贸市场采集各类海产品158 份, 分别用15 株假单胞菌作指示菌, 共分离到27 株噬菌体, 分离率为1711%。
检出的噬菌体经实验室反复增殖、裂解等鉴定试验, 从中精选出9 株裂解力较强, 生物学性状较典型的噬菌体, 分别用双层琼脂法作单斑纯化培养。
这9 株噬菌体的噬菌斑圆形透明, 边缘有的整齐有的稍不整齐, 直径均在110～21 0 mm; 在电镜下的形态可见有头部和尾部, 均呈蝌蚪状; 增殖液的效价均可达10829pf uˆm l。
3、噬菌体的分离在有指示菌的双层琼脂平板上逐格滴加备用的待检噬菌体液,进行交叉裂解试验,即每一株菌均被所有待检噬菌体液逐一滴加。
待平皿干后,置37 ℃培养过夜。
若有相应的噬菌体存在,即可在平皿上出现裂解噬斑(即为阳性) ,不裂解者为阴性。
对分离到的每一噬菌体均经单噬斑分离纯化3 次以上,增殖后置4 ℃冰箱保存。
4、大连近海河流弧菌Ⅱ噬菌体的分离与研究4.1 材料与方法4.2 菌株噬菌体分离所用的指示菌为河流弧菌29301 , 用于宿主范围测定的菌株共8 株: 河流弧菌Ⅱ9302 , 9401 , 9402 , 9403 , 9404 , 9501 , 9502 及9503 均为本实验室保存。
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37 °C 18小时观察结果 记录噬菌斑的数量 选择30－300个pfu的平皿计算每毫升未稀 释的噬菌体原液的效价。 与先前的噬菌体裂解液的稀释度相对应， 计算噬菌体的含量
要 求
星期三(四） 12：00观察结果 描述噬菌斑特征，并计数
（包括噬菌斑的分布数量、形态特征）
实验报告
实验目的 实验原理 实验步骤 结果与分析 思考题
实验七
污水中噬菌体的分离、纯化与效 价测定
实验目的
掌握噬菌体分离的基本原理和方法 学会观察噬菌斑 了解噬菌体纯化、效价测定方法
基本原理
噬菌体是专性寄生物，必需寄生细菌才能繁殖，伴随 细菌的分布而分布，只要有细菌的地方，就有噬菌体 噬菌体颗粒可以在环境中独立存活，但不能繁殖 噬菌体对宿主的寄生通常具有特异性 温和噬菌体和烈性噬菌体 烈性噬菌体在液体中，可以使浑浊的菌液变为澄清 烈性噬菌体在固体琼脂平板，可以形成透明的噬菌斑 利用噬菌体斑的特征可以分离、纯化、效价滴定
噬菌体的分离操作程序
于100ml 3倍浓缩肉汤加入污水样本200ml和大肠杆菌 指示菌2ml 37°C培养8小时 取上述混悬液5ml接种到20ml的新鲜的LB液体培养基， 并加入125ul丝裂霉素，37 °C培养18小时。 无菌取上述培养液1ml于1.5ml Eppendrof管中，加 入200ul氯仿后振荡15min，4 °C 4000g离心20min， 上清过滤，取滤液。 培养指示菌大肠杆菌MC1061 18小时 将细菌涂布在平板培养基表面，然后将滤液滴加到平 板表面，过夜培养，观察结果。
效价指1ml培养液中所含有活的噬菌体的数量 采用双层琼脂平板法，进行噬菌斑的计数，计 量单位为pfu，即plaque forming unit(噬菌斑 形成单位）。 获得的噬菌体滤液作10倍的倍比递减稀释 取每个稀释度噬菌体0.1ml加入0.9ml的指示菌， 混匀后，加入到上层琼脂，倾注平皿，选择30 －300个pfu的平皿计算每毫升未稀释的噬菌体 原液的效价。
操作程序
另取4支无菌的Eppendrof离心管，分别标记10-6 、 105、10-4、 10-3（注意次序），从上述相对应的各稀释管 中分别取300ul 噬菌体液，然后各管加300ul 指示菌， 37 °C温箱15min。（每组可以使用4个移液枪头，注 意次序，不能混淆 ） 取上层琼脂，融化并孵育在48°C（已经融化），每人 1支，加入上述10-6 、 10-5、10-4、 10-3其中一个稀释 度的噬菌体与细菌的混悬液，轻轻混匀5min。（特别 注意琼脂不能离开水浴时间太长，否则琼脂会凝固，但 琼脂不能太烫，不能剧烈振荡） 立即倒入底层琼脂平板，室温5－10分钟，待上层凝固 后，将平板倒置，作好标记。
噬菌斑的形成
在固体琼脂培养基上，噬菌体感染细菌后， 在宿主细胞内进行核酸和蛋白质的生物合成，最后 装配成噬菌体完整的颗粒，通过裂解宿主细胞释放 出来，使感染的细菌不能生长，从而形成肉眼可以 观察到的透明或浑浊的空斑，称为噬菌斑。
噬菌体的初次分离
将可能含有宿主菌的材料在液体培养基 中过夜培养，然后将液体培养液过滤除 菌，滤液备用。 将宿主菌涂布在平板表面，自然干燥。 取滤液10μl滴在平板上，过夜培养，如 果有针对该宿主菌的噬菌体，则可以看 到透亮的抑菌圈。
p39 (1) 、 (2)、 (4) 、 (5)
下次实验 实验 动物病毒的培养
每个初次分离的噬菌斑可能含有多种噬菌 体，要获得单一的噬菌体，必需进行噬菌 体的纯化。
肉眼如何判定噬菌体是否已经 纯化？
噬菌体效价的测定（以下开始自己做）
仔细观察提供的平皿，选取边缘清晰的单个噬菌斑 用灭菌移液器枪头轻轻挑取噬菌体斑到装有1ml培养 液的1.5ml Eppendrof管中，震荡2-3分钟。 采用1ml 针筒吸取1ml 混合液，于0.22um滤膜过滤。 滤液收集在一个新的无菌1.5ml Eppendrof管中，获 得噬菌体滤液的原液。 每组取7个1.5ml 的Eppendrof离心管，分别标注 10-1、 10-2、 至 10-7。 每个Eppendrof离心管分别各加900ul LB，从噬菌体滤 液中取100ul 于10-1离心管中，混匀后，取100ul 于 10-2离心管中，依次类推10倍倍比递减稀释至-7。 （一个移液枪头用到底）
问题
如果采用这种方法，看不到抑菌圈，可以 说明的是哪些情况？
பைடு நூலகம்
如何进行噬菌体的纯化
挑取单一清晰可见的单个噬菌斑，接种液 体培养基，并加入相同指示菌，重复上述 从加入氯仿开始的各个试验步骤，得到噬 菌斑 重复多次，可以得到由一个噬菌体的后代 形成的噬菌斑，即获得了纯化的噬菌斑。 观测噬菌斑的特征
如何测定噬菌体的效价