实验8 污水中噬菌体的分离与效价测定

每个初次分离的噬菌斑可能含有多种噬菌 体，要获得单一的噬菌体，必需进行噬菌 体的纯化。
肉眼如何判定噬菌体是否已经 纯化？
噬菌体效价的测定（以下开始自己做）
仔细观察提供的平皿，选取边缘清晰的单个噬菌斑 用灭菌移液器枪头轻轻挑取噬菌体斑到装有1ml培养 液的1.5ml Eppendrof管中，震荡2-3分钟。 采用1ml 针筒吸取1ml 混合液，于0.22um滤膜过滤。 滤液收集在一个新的无菌1.5ml Eppendrof管中，获 得噬菌体滤液的原液。 每组取7个1.5ml 的Eppendrof离心管，分别标注 10-1、 10-2、 至 10-7。 每个Eppendrof离心管分别各加900ul LB，从噬菌体滤 液中取100ul 于10-1离心管中，混匀后，取100ul 于 10-2离心管中，依次类推10倍倍比递减稀释至-7。 （一个移液枪头用到底）
效价指1ml培养液中所含有活的噬菌体的数量 采用双层琼脂平板法，进行噬菌斑的计数，计 量单位为pfu，即plaque forming unit(噬菌斑 形成单位）。 获得的噬菌体滤液作10倍的倍比递减稀释 取每个稀释度噬菌体0.1ml加入0.9ml的指示菌， 混匀后，加入到上层琼脂，倾注平皿，选择30 －300个pfu的平皿计算每毫升未稀释的噬菌体 原液的效价。

p39 (1) 、 (2)、 (4) 、 (5)
下次实验 实验 动物病毒的培养
37 °C 18小时观察结果 记录噬菌斑的数量 选择30－300个pfu的平皿计算每毫升未稀 释的噬菌体原液的效价。 与先前的噬菌体裂解液的稀释度相对应， 计算噬菌体的含量
要 求
星期三(四） 12：00观察结果 描述噬菌斑特征，并计数
（包括噬菌斑的分布数量、形态特征）
实验报告
实验目的 实验原理 实验步骤 结果与分析 思考题
操作程序
另取4支无菌的Eppendrof离心管，分别标记10-6 、 105、10-4、 10-3（注意次序），从上述相对应的各稀释管 中分别取300ul 噬菌体液，然后各管加300ul 指示菌， 37 °C温箱15min。（每组可以使用4个移液枪头，注 意次序，不能混淆 ） 取上层琼脂，融化并孵育在48°C（已经融化），每人 1支，加入上述10-6 、 10-5、10-4、 10-3其中一个稀释 度的噬菌体与细菌的混悬液，轻轻混匀5min。（特别 注意琼脂不能离开水浴时间太长，否则琼脂会凝固，但 琼脂不能太烫，不能剧烈振荡） 立即倒入底层琼脂平板，室温5－10分钟，待上层凝固 后，将平板倒置，作好标记。
问题
如果采用这种方法，看不到抑菌圈，可以 说明的是哪些情况？ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
如何进行噬菌体的纯化
挑取单一清晰可见的单个噬菌斑，接种液 体培养基，并加入相同指示菌，重复上述 从加入氯仿开始的各个试验步骤，得到噬 菌斑 重复多次，可以得到由一个噬菌体的后代 形成的噬菌斑，即获得了纯化的噬菌斑。 观测噬菌斑的特征
如何测定噬菌体的效价
实验七
污水中噬菌体的分离、纯化与效 价测定
实验目的
掌握噬菌体分离的基本原理和方法 学会观察噬菌斑 了解噬菌体纯化、效价测定方法
基本原理
噬菌体是专性寄生物，必需寄生细菌才能繁殖，伴随 细菌的分布而分布，只要有细菌的地方，就有噬菌体 噬菌体颗粒可以在环境中独立存活，但不能繁殖 噬菌体对宿主的寄生通常具有特异性 温和噬菌体和烈性噬菌体 烈性噬菌体在液体中，可以使浑浊的菌液变为澄清 烈性噬菌体在固体琼脂平板，可以形成透明的噬菌斑 利用噬菌体斑的特征可以分离、纯化、效价滴定
噬菌斑的形成
在固体琼脂培养基上，噬菌体感染细菌后， 在宿主细胞内进行核酸和蛋白质的生物合成，最后 装配成噬菌体完整的颗粒，通过裂解宿主细胞释放 出来，使感染的细菌不能生长，从而形成肉眼可以 观察到的透明或浑浊的空斑，称为噬菌斑。
噬菌体的初次分离
将可能含有宿主菌的材料在液体培养基 中过夜培养，然后将液体培养液过滤除 菌，滤液备用。 将宿主菌涂布在平板表面，自然干燥。 取滤液10μl滴在平板上，过夜培养，如 果有针对该宿主菌的噬菌体，则可以看 到透亮的抑菌圈。
噬菌体的分离操作程序
于100ml 3倍浓缩肉汤加入污水样本200ml和大肠杆菌 指示菌2ml 37°C培养8小时 取上述混悬液5ml接种到20ml的新鲜的LB液体培养基， 并加入125ul丝裂霉素，37 °C培养18小时。 无菌取上述培养液1ml于1.5ml Eppendrof管中，加 入200ul氯仿后振荡15min，4 °C 4000g离心20min， 上清过滤，取滤液。 培养指示菌大肠杆菌MC1061 18小时 将细菌涂布在平板培养基表面，然后将滤液滴加到平 板表面，过夜培养，观察结果。