腺病毒载体工艺平台介绍.pptx
腺病毒载体工艺平台介绍(PPT37张)
LMP2
CDC病毒病所委托 源兴承担药学研究
2019/4/11
基因药物研发中心
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新药申报三方面研究内容 • 药学研究 • 药效研究 • 安全评价
2019/4/11
基因药物研发中心
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药学研究主要内容 • • • • • • • 上游构建及鉴定 细胞/毒种研究及三级库建立 原液工艺研究 制剂工艺研究 检测方法及质量标准研究 稳定性研究 试制三批样品
2019/4/11
基因药物研发中心
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管理制度 • 建立了300多个SOP、SMP等标准程 序和规章管理制度，按照GMP要求 严格规范管理。
2019/4/11
基因药物研发中心
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研发中心工艺平台
• 研发中心工艺产业化平台是通用型腺病毒载体药 物生产工艺和质量标准研究的药学技术平台，中 试生产工艺水平达到了国内同行业先进水平，可 以在产量及质量上满足腺病毒载体药物临床前和 临床用样品制备的要求。 • 本工艺拥有自主知识产权，可作为腺病毒载体新 药研发及生产的技术基础。 • 5L细胞罐收获物经纯化后产量能达到E15VP/批， 注射液制剂工艺达到了小容量水针1万支/批的生 产能力。 • 产品纯度大于98%，比滴度大于3.3%，各项质检 结果都能达到FDA对腺病毒类生物制品的质量标 准要求。
20211122?基因药物研发中心研发中心已完成申报临床所需药学研究的品种品种代号研究单位研究时间治疗性重组hbv腺病毒疫2004年3月至2005年11月治疗性hiv腺病毒载体疫苗h302005年12月至2007年8月治疗性重组腺病毒eb病毒潜伏膜抗原疫苗lmp2cdc病毒病所委托源兴承担药学研究2007年9月至2008年10月20211122?基因药物研发中心新药申报三方面研究内容安全评价20211122?基因药物研发中心药学研究主要内容试制三批样品20211122?基因药物研发中心细胞及毒种研究毒种检定代次及遗传稳定性研究20211122?基因药物研发中心建细胞库原始细胞细胞来源于atcc主细胞库质量控制工作细胞库质量控制细胞扩增细胞扩增20211122?基因药物研发中心工作种子批病毒扩增原始种子批主种子批鉴定检病毒扩增20211122?基因药物研发中心原液工艺流程参数及技术指标sepharosefastflow分子筛层析回收率3批平均重组腺病毒种子罐收获物超滤浓缩液source30q阴离子交换柱层析层析收集液6000rpm离心20min500k膜超滤浓缩10倍细胞种子细胞罐扩增5l罐细胞培养病毒扩增
腺病毒PPT课件
——具有日程表的病毒
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五、病毒感染的结果及其免疫性
所致疾病：胃肠炎与腹泻。“3岁”以上儿童。 免疫性：感染后获得中和抗体，对同型病 毒的感染有保护作用，免疫力持久。
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+ 腺病毒载体的特点
+ ①用它制备成疫苗或表达载体安全性好；②对其结构及 特性的研究较深入，容易复制，操作简单；③重组的腺 病毒载体可获得较高的滴度；④腺病毒无需整合进宿主 细胞基因组中，目的基因在宿主细胞基因组外游离状态 下表达，整合突变致癌可能性小，基因毒性低；⑤有较 大的宿主范围，可感染分裂期及非分裂期细胞；⑥腺病 毒载体可以插入7.5kb的外源基因，容量较大；⑦相对稳 定，经得起纯化、浓缩。
病毒基因独立、高效复制 “以量取胜”
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置换
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+ 2、引物 病毒复制所用的引物为蛋白质引物。 可从任一末端开始
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+ 3、原料（操纵蛋白和核苷酸）
腺病毒在感染宿主细胞后即产生一 种蛋白（E1A蛋白），使感染细胞从 “休息状态”进入到DNA复制周期，为 病毒复制储备原料。
综上，腺病毒mRAN的选择传递和翻译 都是严格按照时间日程完成的。
因该病毒最初来自腺体，故命名为腺 病毒 (Adenovirus)。
是一群分布十分广泛，能引起呼吸道、肠粘 膜上皮细胞溶解性感染；可在淋巴样和腺样细胞 中引起潜伏感染，在啮齿动物细胞中引起转化感 染。少数几种腺病毒对实验动物→致癌（12、18 型），有潜在致癌性。
pAAV-hSyn-RFP腺病毒载体说明(图)
pAAV-‐hSyn-‐RFP编号 载体名称 北京华越洋VECT10040 pAAV-‐hSyn-‐RFPpAAV-‐hSyn-‐RFP载体基本信息：载体名称: pAAV-‐hSyn-‐RFP质粒类型: 腺病毒载体；荧光报告载体高拷贝/低拷贝: 高拷贝克隆方法: 限制性内切酶，多克隆位点启动子: human S ynapsin 1载体大小: 5909 b p5' 测序引物及序列: -‐-‐3' 测序引物及序列: SP6 5'ATTTAGGTGACACTATAG 3'载体标签: -‐-‐载体抗性: 氨苄青霉素筛选标记: 红色荧光蛋白DsRedExpress克隆菌株: Stbl3 或 NEB S tble宿主细胞（系）: 神经细胞备注: pAAV-‐hSyn-‐RFP载体含有human s ynapsin 1 启动子，适合在神经细胞中表达。
稳定性: 稳表达组成型/诱导型: 组成型病毒/非病毒: 腺病毒pAAV-‐hSyn-‐RFP载体质粒图谱和多克隆位点信息：pAAV-‐hSyn-‐RFP载体序列：ORIGIN1 G TGGATAACC G TATTACCGC C TTTGAGTGA G CTGATACCG C TCGCCGCAG C CGAACGACC61 G AGCGCAGCG A GTCAGTGAG C GAGCGAGCG C GCAGAGAGG G AGTGGCCAA C TCCATCACT 121 A GGGGTTCCT T GTAGTTAAT G ATTAACCCG C CATGCTACT T ATCTACGTA G CCATGCTCT181 A GAGGATCCT T CGAAAAGCT T CTGCAGAGG G CCCTGCGTA T GAGTGCAAG T GGGTTTTAG 241 G ACCAGGATG A GGCGGGGTG G GGGTGCCTA C CTGACGACC G ACCCCGACC C ACTGGACAA 301 G CACCCAACC C CCATTCCCC A AATTGCGCA T CCCCTATCA G AGAGGGGGA G GGGAAACAG 361 G ATGCGGCGA G GCGCGTGCG C ACTGCCAGC T TCAGCACCG C GGACAGTGC C TTCGCCCCC 421 G CCTGGCGGC G CGCGCCACC G CCGCCTCAG C ACTGAAGGC G CGCTGACGT C ACTCGCCGG 481 T CCCCCGCAA A CTCCCCTTC C CGGCCACCT T GGTCGCGTC C GCGCCGCCG C CGGCCCAGC541 C GGACCGCAC C ACGCGAGGC G CGAGATAGG G GGGCACGGG C GCGACCATC T GCGCTGCGG 601 C GCCGGCGAC T CAGCGCTGC C TCAGTCTGC G GTGGGCAGC G GAGGAGTCG T GTCGTGCCT 661 G AGAGCGCAG T CGAGGCGCG C CGAGCTCGG A TCCTGAGAA C TTCAGGGTG A GTCTATGGG 721 A CCCTTGATG T TTTCTTTCC C CTTCTTTTC T ATGGTTAAG T TCATGTCAT A GGAAGGGGA781 G AAGTAACAG G GTACACATA T TGACCAAAT C AGGGTAATT T TGCATTTGT A ATTTTAAAA841 A ATGCTTTCT T CTTTTAATA T ACTTTTTTG T TTATCTTAT T TCTAATACT T TCCCTAATC901 T CTTTCTTTC A GGGCAATAA T GATACAATG T ATCATGCCT C TTTGCACCA T TCTAAAGAA961 T AACAGTGAT A ATTTCTGGG T TAAGGCAAT A GCAATATTT C TGCATATAA A TATTTCTGC1021 A TATAAATTG T AACTGATGT A AGAGGTTTC A TATTGCTAA T AGCAGCTAC A ATCCAGCTA1081 C CATTCTGCT T TTATTTTAT G GTTGGGATA A GGCTGGATT A TTCTGAGTC C AAGCTAGGC1141 C CTTTTGCTA A TCATGTTCA T ACCTCTTAT C TTCCTCCCA C AGCTCCTGG G CAACGTGCT1201 G GTCTGTGTG C TGGCCCATC A CTTTGGCAA A GCACGTGAA T TCGAAGATC T GGCCGCCTC1261 G GCCTCTAGA A CTAGTGGAT C CCCCGGGCT G CAGGAATTC G ATGCTACCG G TCGCCACCA1321 T GGCCTCCTC C GAGGACGTC A TCAAGGAGT T CATGCGCTT C AAGGTGCGC A TGGAGGGCT 1381 C CGTGAACGG C CACGAGTTC G AGATCGAGG G CGAGGGCGA G GGCCGCCCC T ACGAGGGCA 1441 C CCAGACCGC C AAGCTGAAG G TGACCAAGG G CGGCCCCCT G CCCTTCGCC T GGGACATCC 1501 T GTCCCCCCA G TTCCAGTAC G GCTCCAAGG T GTACGTGAA G CACCCCGCC G ACATCCCCG1561 A CTACAAGAA G CTGTCCTTC C CCGAGGGCT T CAAGTGGGA G CGCGTGATG A ACTTCGAGG 1621 A CGGCGGCGT G GTGACCGTG A CCCAGGACT C CTCCCTGCA G GACGGCTCC T TCATCTACA1681 A GGTGAAGTT C ATCGGCGTG A ACTTCCCCT C CGACGGCCC C GTAATGCAG A AGAAGACTA 1741 T GGGCTGGGA G GCCTCCACC G AGCGCCTGT A CCCCCGCGA C GGCGTGCTG A AGGGCGAGA 1801 T CCACAAGGC C CTGAAGCTG A AGGACGGCG G CCACTACCT G GTGGAGTTC A AGTCCATCT 1861 A CATGGCCAA G AAGCCCGTG C AGCTGCCCG G CTACTACTA C GTGGACTCC A AGCTGGACA 1921 T CACCTCCCA C AACGAGGAC T ACACCATCG T GGAGCAGTA C GAGCGCGCC G AGGGCCGCC 1981 A CCACCTGTT C CTGTAGCGG C CAAATGAAT T CCCAAACCG T ACGGGAAAC G GCCCTATTC2041 T ATAGTGTCA C CTAAATGCT A GAGCTCGCT G ATCAGCCTC G ACTGTGCCT T CTAGTTGCC2101 A GCCATCTGT T GTTTGCCCC T CCCCCGTGC C TTCCTTGAC C CTGGAAGGT G CCACTCCCA2161 C TGTCCTTTC C TAATAAAAT G AGGAAATTG C ATCGCATTG T CTGAGTAGG T GTCATTCTA2221 T TCTGGGGGG T GGGGTGGGG C AGGACAGCA A GGGGGAGGA T TGGGAAGAC A ATAGCGCGG 2281 C CGCTCTAGA G 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pShuttle-‐CMVpAAV-‐Syn-‐Rluc pAAV-‐hSyn-‐RFPpAAV-‐CMV-‐iRFP pAAV-‐UbCpDC415 pAAV-‐CAG-‐FlucpAAV-‐LacZ pNTAP-‐Shuttle-‐BpDC316 pDC516pAAV-‐CA pDC416pNTAP-‐Shuttle-‐C pDC311pDC512 pAAV-‐hrGFPpDC411 pAAV-‐RCpAdTrack pacAd5 C MVK-‐NpA pAdEasy-‐1 pDC315pAAV-‐MCS pShuttlepHelper pBApo-‐CMV-‐neo pShuttle-‐CMV-‐lacZ pBApo-‐CMVpAAV-‐TRE-‐Syn-‐Fluc pBApo-‐CMV-‐PurpAAV-‐minCMV-‐mCherry。
Get格雅 重组腺病毒理论 ppt课件
An ideal gene delivery should include:
Protecting DNA against nuclease degradation; Transporting DNA to the target cells; Facilitating transport of DNA across the plasma membrane; Promoting the import of DNA into the nucleus.
In vivo gene transfer for ocular diseases. A. An aAAV) vector is injected into the subretinal space using a surgical procedure. B. Gene transfer of RPE-65 (色素表皮细胞特异的65kDa蛋白)to the retina restored light sensitivity in patients with Leber's congenital amaurosis (LCA) (from Proc Natl Acad Sci USA 105(39):15112-7,2021. C. A similar protocol for AAV-mediated Lopsin corrected color blindness in squirrel monkeys.
DNA: large molecular weight; Sensitive to nucleases
The key problem remains gene delivery
DNA entering to cell, three major obstacles
细胞生物学作业 腺病毒载体介绍
具有共同或重叠序列的两种ＤＮＡ分 子，通过共转染转移到某一生物体内， 在一系列与同源重组有关的酶的作用 下，将一个DNA分子转移到另一个DNA 分子中去
腺病毒载体优势
宿主范围广，对人致病性低
在增值和非增值细胞中感染和表达色体中，无插入致突变性 能在悬浮液中扩增 能同时表达多个基因
基因E1a： 对其他基因的转录有阻遏作用，复制所必需的基因
早期基因
基因E2： 晚期基因表达的反式因子和病毒复制必需的因子 其他
晚期基因：产生病毒的结构蛋白
腺病毒侵染人体过程
腺病毒纤毛结 节区粘附到细 胞表面的柯萨 奇/腺病毒受体
→
五邻体基底部 的三肽（RGD） 与细胞表面整 合素结合，通 过内吞作用进 入细胞
→
外包装壳蛋白解 体，病毒粒子穿 过细胞质靠近细 胞核
↓
病毒粒子经细 胞质通过核孔 将遗传物质转 入细胞核，
腺病毒载体构建方法
体外连接法 同源重组法 ：在真核细胞中进行同源重组
在原核细胞中进行同源重组
体外连接法：将外源目的基因亚克隆 到腺病毒基因组的一个片段上，在体 外与腺病毒的基因组相连，重新构成 一个完整的腺病毒ＤＮＡ，转染敏感 细胞。 不足：腺病毒基因组上适用于克隆酶 切位点有限，限制了该法的利用。
腺病毒载体
腺病毒简介 腺病毒载体构建方法 腺病毒载体优势 腺病毒载体应用前景
腺病毒简介
腺病毒是一种没有包膜的直径为 70～90 nm的颗粒，由240个六邻体 和12个五邻体，其中五邻体位于顶 角处，从每个顶角壳粒的基底伸出 一根纤毛突起，末端有一个结节区， 衣壳里是线状双链DNA分子
DNA分子特点： 其两端各有一个100一165 ntLTR序列
腺病毒载体应用前景
完全获得腺病毒载体系统及其应用于生物制品的研制与生产
完全获得腺病毒载体系统及其应用于生物制品的研制与生产随着生物技术的不断发展，生物制品市场的需求也越来越大。
而腺病毒载体系统则成为了生物制品制造的重要工具。
腺病毒载体系统是一种基因转染载体，可以非常有效地将目标基因转移到细胞内，因此被广泛应用于基因疗法、疫苗研制以及基于细胞的生产等领域。
本文将探讨腺病毒载体系统的完全获得、优化和应用于生物制品的研制与生产。
一、完全获得腺病毒载体系统为了完全获得腺病毒载体系统，首先需要对其进行深入的研究。
腺病毒载体系统是由腺病毒中的一部分基因组成，包含重复序列、转录启动子、增强子、终止子等元件。
在一般情况下，腺病毒载体系统的搭建需要遵循以下步骤：1. 选择适当的宿主细胞：在腺病毒载体系统中，宿主细胞起着至关重要的作用。
不同的宿主细胞能够对基因转染的效率、腺病毒带有的基因数量、细胞自身的表达差异等方面产生重要影响。
因此，应该根据目的选择具有适当表达水平和生长特性的宿主细胞。
2. 将目标基因插入载体：选择编码目标蛋白的基因，并将其插入到腺病毒载体的多克隆位点中。
插入的基因需要正确地排列，以确保其能够被成功表达。
3. 选择适当的表达元件：包括启动子、增强子、终止子等元件需要根据需要进行选择。
4. 将重复序列和帮助子元件与载体连接：重复序列有助于增加腺病毒载体的包装限制，提高转染效率。
帮助子元件通过形成三级结构，能够促进转录起始。
5. 将腺病毒包装系统插入载体：腺病毒包装系统包含三个基因：序列调节子、pHelper及pAd产物。
这些基因通过相互作用，使得目标载体被包装在腺病毒颗粒中。
二、腺病毒载体系统的优化虽然腺病毒载体系统已经成为生物制品制造的重要工具，但是其效率和规模仍然存在着诸多问题。
因此，研究人员对其进行了深入的优化，以提高其产量和转染效率。
1. 提高病毒感染效率：通过多种方法，如改进病毒包装系统、改变载体序列比例、优化细胞筛选等，都可以提高病毒感染的效率。
2. 提高载体内目标基因的表达：通过改进目标基因的调节序列、优化质粒拓扑结构等手段，提高目标基因的表达量和质量。
pBHGloxdelE13cre腺病毒载体说明(图)
pBHGloxdelE13cre编号 载体名称 北京华越洋VECT10032 pBHGloxdelE13crepBHGloxdelE13cre载体基本信息：载体名称: pBHGloxdelE13cre质粒类型: 哺乳细胞表达；腺病毒载体高拷贝/低拷贝: -‐-‐启动子: CMV克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶载体大小: 34707bp5' 测序引物及序列: -‐-‐3' 测序引物及序列: -‐-‐载体标签: -‐-‐载体抗性: 氨苄青霉素(Ampicillin)筛选标记: -‐-‐备注: -‐-‐稳定性: -‐-‐组成型: -‐-‐病毒/非病毒: 腺病毒pBHGloxdelE13cre载体质粒图谱和多克隆位点信息pBHGloxdelE13cre其他腺病毒表达载体：pNTAP-‐Shuttle-‐B pAAV-‐CAG-‐RFP pAAV-‐CaMKIIa-‐EGFP pCTAP-‐Shuttle-‐A pAAV-‐CMV-‐Rluc pNTAP-‐Shuttle-‐A pAAV-‐CAG-‐GFP pBHGloxdelE13cre pCTAP-‐Shuttle-‐C pDC511pDC515 pDC312pAdTrack-‐CMV pAAV-‐IRES-‐hrGFP pShuttle-‐IRES-‐hrGFP-‐1 pShuttle-‐CMV-‐EGFP-‐C pacAd5 9.2-‐100 pacAd5 C MV-‐GFP pAAV-‐Syn-‐Rluc pCMV-‐MCS pShuttle-‐IRES-‐hrGFP-‐2 pShuttle-‐CMV pAAV-‐Syn-‐Rluc pAAV-‐hSyn-‐RFP pAAV-‐CMV-‐iRFP pAAV-‐UbCpDC415 pAAV-‐CAG-‐Fluc pAAV-‐LacZ pNTAP-‐Shuttle-‐B pDC316 pDC516pAAV-‐CA pDC416pNTAP-‐Shuttle-‐C pDC311pDC512 pAAV-‐hrGFPpDC411 pAAV-‐RC pAdTrack pacAd5 C MVK-‐NpA pAdEasy-‐1 pDC315pAAV-‐MCS pShuttlepHelper pBApo-‐CMV-‐neo pShuttle-‐CMV-‐lacZ pBApo-‐CMVpAAV-‐TRE-‐Syn-‐Fluc pBApo-‐CMV-‐Pur pAAV-‐minCMV-‐mCherry。
腺病毒载体工艺平台介绍
腺病毒载体工艺平台介绍腺病毒载体是一种常用的基因传递工具，被广泛应用于基因治疗和基因工程研究领域。
为了应对不同研究需求和提高载体表达效率，许多研究人员和企业建立了腺病毒载体工艺平台，以帮助加速基因传递和基因治疗的研究进展。
腺病毒载体工艺平台是一种综合的研究和生产系统，主要包括以下几个方面：1. 载体构建：利用分子生物学技术，将感兴趣的基因序列插入腺病毒基因组的合适位点。
在载体构建过程中，可以根据需要选择不同的载体类型、启动子、响应元件等，以调控基因的表达水平和时机。
2. 载体包装：通过与辅助质粒（helper plasmid）共转染细胞，使细胞内形成完整的腺病毒基因组，并通过细胞内重组事件来复制和包装腺病毒颗粒。
载体包装的过程中，通常需要参考文献中的方法和优化步骤，以获得高效的包装效率。
3. 病毒扩增：将包装好的腺病毒载体接种到适宜的宿主细胞中，通过培养和扩增过程，使腺病毒繁殖并增加至足够的浓度。
扩增过程中要注意控制细胞的生长状态、感染剂量和细胞培养条件，以获得高产量和活性的腺病毒。
4. 病毒纯化：通过离心、超滤和柱层析等技术手段，从扩增培养物中纯化腺病毒颗粒。
纯化过程中，可以采用单步或多步骤的方法来去除杂质、浓缩和提纯腺病毒。
5. 固定化：对腺病毒进行固定化处理，可用于获得更稳定、可储存和长期使用的腺病毒制剂。
常用的固定化方法包括酶解固定化、化学固定化、冻干固定化等。
6. 质量检测：对纯化的腺病毒产品进行质量鉴定，包括病毒滴度测定、细胞感染测定、基因表达水平测定等。
同时，还可以进行病毒颗粒观察、基因序列测定、重组蛋白表达等验证实验。
腺病毒载体工艺平台的建立有助于提高基因治疗和基因工程研究的效率和可靠性。
通过系统、规范和高效的工艺流程，可以大幅度减少研究人员在载体构建、病毒包装和纯化等环节上的工作量，同时提高腺病毒的产量和纯度。
这为基因治疗的临床应用以及基因工程研究提供了可靠的技术支持。
腺病毒载体工艺平台是基因治疗和基因工程研究中不可或缺的一部分。
腺病毒载体操作手册簿中文版解析汇报
word腺病毒载体操作手册中文版AdEasyTM操作手册目录第一章简介 1第二章应用重组腺病毒的优点 2第三章 AdEasyTM 技术 33.1 技术概况 33.2 AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程 3第四章主要流程 44.1 将基因克隆入AdEasyTM转移载体4 4.1.1 克隆的一般原如此 4 4.1.2 构建重组AdEasyTM转移载体 54.2 细菌内AdEasyTM重组子的产生 5 4.2.1 共转化的一般原如此5 4.2.2 共转化方法 5 4.2.3 预期结果54.3 AdEasyTM重组质粒的筛选和扩增 64.4 AdEasyTM重组子转染QBI-293A细胞 6 4.4.1 细胞铺板 6 4.4.2 磷酸钙转化技术 7第五章常用技术 85.1 QBI-293A细胞培养 8 5.1.1QBI-293A细胞的初始培养 8 5.1.2 QBI-293A细胞的维持培养和增殖 8 5.1.3 QBI-293A细胞的冻存 85.2 QBI-293A细胞的转染和病毒空斑的产生9 5.2.1 感染QBI-293A细胞 9 5.2.2 病毒空斑形成 9 5.2.3 琼脂糖覆盖被感染细胞 95.3 MOI测定 105.4 腺病毒感染力测定 10 5.4.1 X-Gal染色 115.5 重组腺病毒的筛选和纯化11 5.5.1 挑选最优重组腺病毒：表达和基因输送 11 5.5.2 病毒空斑挑选和小量扩增12 5.5.3 Western杂交 13 5.5.4 Southern 杂交和点杂交 13 5.5.5 病毒裂解产物PCR14 5.5.6 免疫测定 14 5.5.7 功能测定145.6 病毒颗粒在QBI-293A细胞中的大量扩增155.7 两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒16 5.7.1 不连续密度梯度离心 17 5.7.2 连续密度梯度离心 17 5.7.3 病毒溶液去盐和浓集 175.8 病毒滴度测定 18 5.8.1 O.D.260 nm (VP/ml) 19 5.8.2 空斑测定法 20 5.8.3 50%组织培养感染剂量法 20第六章疑难解答 226.1 QBI-293A细胞培养 226.2 感染力测定 226.3 转移载体克隆 236.4 在BJ5183细胞中共转化和重组246.5 转染QBI-293A细胞 256.6 筛选和测定256.7 在QBI-293A细胞中表达 266.8 重组腺病毒的扩增 266.9 纯化 266.10 病毒滴度测定 27缩写英文全称中文全称Ad Adenovirus 腺病毒Ad5 Adenovirus serotype 5 血清5型腺病毒AdV Adenoviral Vector 腺病毒载体Amp Ampicillin 氨苄青霉素β-Gal β-Galactosidase β-半乳糖苷酶bp Base Pair 碱基对BSA Bovine Serum Albumin 小牛血清白蛋白cDNA plementary DNA 互补DNAcccDNA Closed Circular Coiled DNA 闭环螺旋DNACPE Cytopathic Effect 细胞病理效应CsCl Cesium Chloride 氯化铯DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMEM培养基DMSO Dimethyl Sulfoxide 二甲基亚砜DTT Dithiothreitol 二硫苏糖醇EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid 乙二胺四乙酸EtBr Ethidium Bromide 溴化乙锭FBS Fetal Bovine Serum 胎牛血清Hr Hour 小时ITR Inverted Terminal Repeat 反向末端重复Kan Kanamycin 卡那霉素kb Kilobases 千碱基对KDa KiloDaltons 千道尔顿LB Luria-Bertani ( broth ) LB培养基MCS Multiple Cloning Site 多克隆位点Min Minute 分钟MOI Multiplicity of Infection (Virus/Cell ) 感染复数mRNA Messenger RNA 信使RNAMWCO MOIecular Weight Cut-off PAGE PolyAcrylamide Gel Electrophoresis 聚丙烯凝胶电泳PBS Phosphate Buffered Saline 磷酸盐缓冲液PFU Plaque Forming Unit 空斑形成单位pi Post Infection 感染后RCA Replication petent Adenovirus 增殖性腺病毒RITR Right Inverted Terminal Repeat 右侧反向末端重复SDS Sodium Dodecyl Sulfate 十二烷基硫酸钠TBE Tris Borate/EDTA 三羟甲基氨基甲烷硼酸盐/乙二胺四乙酸TCID50 Tissue Culture Infectious Dose 50 50%组织培养感染剂量TCP Total Cellular Protein 细胞总蛋白TE Tris/EDTA TE溶液wt Wild Type 野生型X-Gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Galactopyranoside 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷第一章简介当今基因输送技术的开展日趋复杂，一些治疗药物〔生长激素、干扰素、抗病毒和抗癌复合物〕和诊断性蛋白〔单克隆抗体〕的设计、开展与合成需要更高效的基因输送工具。
(整理)腺病毒载体操作手册1407-R2
腺病毒载体操作手册一、实验流程制备腺病毒穿梭质粒，分别高纯度无内毒素抽提腺病毒穿梭质粒和骨架质粒，共转染293A细胞，转染后6h更换为完全培养基，培养十几天，在中间四五天左右更换一次新鲜培养基，然后收集细胞和1ml培液置于15ml离心管后，液氮/37度冻融三次（冻-融要彻底），2000rpm离心5分钟，取上清即为病毒液初代原液。
连续三代反复扩增收集病毒后，行病毒的大量扩增，然后通过CsCl密度梯度离心-透析联用法纯化病毒。
二、实验材料（一）腺病毒载体、包装细胞和菌株该病毒包装系统为两质粒系统，组成为穿梭质粒（包括pHBAd-CMV-IRES-GFP,pHBAd-CMV-IRES-RFP,pHBAd-U6-GFP, pHBAd-U6-RFP）和骨架质粒pBHGlox（delta）E1,3Cre。
其中穿梭质粒pHBAd-CMV-IRES-GFP和pHBAd-U6-GFP能表达绿色荧光蛋白（GFP）。
pHBAd-CMV-IRES-RFP和pHBAd-U6-RFP能表达红色荧光蛋白（RFP）。
1、载体信息1) 腺病毒克隆载体图谱如下：各载体用途如下表：2）骨架质粒信息如下：2、细胞株293A，腺病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，经培养生长增殖形成单层细胞,生长培养基为DMEM(含10% FBS)。
3、菌株大肠杆菌菌株DH5α。
用于扩增腺病毒载体和腺病毒骨架载体质粒。
三、包装细胞293A细胞的培养（一）293A细胞的冻存293A细胞来源于一个用作空斑测定的亚克隆，具有易使用和易转染的特性。
该细胞株对于高细胞密度很敏感，当细胞超过70%汇合时，一些细胞可能会丢失它们的表型。
若细胞密度持续在70%以下，QBI-293A细胞则能连续培养3~4个月维持原有细胞特性。
若以购买得到的293A作为第一代，则30代内能得到最佳结果。
随着传代的次数增加，293A细胞会出现生长状态下降、突变等。
为了防止此类现象的出现，我们需要在开始就对细胞进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持续性。
病毒载体概述ppt课件
Helper virus +helper plasmid
Host cell +vector DNA
rep cap
Recombinant helper virus (rHSV-repcap)
proviral cell
图4 双因素系统生产重组AAV病毒示意图
7
无病毒基因的病毒载体
被包装的DNA/RNA中不含任何病毒编码基因，只保留其复制和 包装所必需的顺式作用元件。获得的重组病毒颗粒具有野生型病 毒的外壳/外膜和感染性，但不表达病毒蛋白。
嵌合型病毒载体（hybrid viral vector）：
指将不同病毒的基因元件进行组合，形成的重组杂合病毒。如腺 病毒与 AAV 病毒的杂合体病毒，既具有腺病毒的感染性和基因组特性 （双链线状 DNA），又具有 AAV 病毒的染色体整合性（Lieber A et al. 1999）。各种病毒基因元件组合形成新的杂合载体的报道层出不穷，如 单纯疱疹病毒扩增子与 AAV 病毒杂合载体（Johnston KM et al. 1997）、 腺病毒与 EB 病毒复制子杂合载体（Tan BT et al. 1999）腺病毒与反转 录病毒杂合载体（Caplen NJ et al. 1999）等，不一而足。这些杂合载体 使重组病毒的特性多样化，以适应不同基因转移目的的需要。
12பைடு நூலகம்
重组病毒的生产和纯化
小量制备和纯化
场所
实验室
细胞培养 培养瓶 细胞裂解 反复冻融 病毒分离 离心
病毒纯化 密度梯度超速离心
制剂
缓冲液
保存
低温
大量制备和纯化
中试车间 转瓶、细胞工厂、发酵罐 机械法或化学法裂解 离心、超滤、萃取 浓缩、柱层析 配方
pAAV-MCS腺病毒载体说明(图)
pAAV-‐MCS编号 载体名称北京华越洋VECT10024 pAAV-‐MCSpAAV-‐MCS载体基本信息：载体名称: pAAVMCS， pAAV-‐MCS, p AAV M CS质粒类型: 腺病毒相关载体表达水平: 高启动子: CMV克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶载体大小: 4650 b p5' 测序引物及序列: CMV-‐F: 5'-‐CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-‐3'3' 测序引物及序列: hGH-‐PA-‐R: C CAGCTTGGTTCCCAATAGA载体标签: -‐-‐载体抗性: 氨苄备注: -‐-‐稳定性: /组成型: -‐-‐病毒/非病毒: 腺病毒pAAV-‐MCS载体质粒图谱和多克隆位点信息pAAV-‐MCS载体序列:ORIGIN1 C CTGCAGGCA G CTGCGCGCT C GCTCGCTCA C TGAGGCCGC C CGGGCAAAG C CCGGGCGTC 61 G GGCGACCTT T GGTCGCCCG G CCTCAGTGA G CGAGCGAGC G CGCAGAGAG G GAGTGGCCA 121 A CTCCATCAC T AGGGGTTCC T GCGGCCGCA C GCGTGGAGC T AGTTATTAA T AGTAATCAA 181 T TACGGGGTC A TTAGTTCAT A GCCCATATA T GGAGTTCCG C GTTACATAA C TTACGGTAA 241 A TGGCCCGCC T GGCTGACCG C CCAACGACC C CCGCCCATT G ACGTCAATA A TGACGTATG 301 T TCCCATAGT A ACGTCAATA G GGACTTTCC A TTGACGTCA A TGGGTGGAG T ATTTACGGT 361 A AACTGCCCA C TTGGCAGTA C ATCAAGTGT A TCATATGCC A AGTACGCCC C CTATTGACG 421 T CAATGACGG T AAATGGCCC G CCTGGCATT A TGCCCAGTA C ATGACCTTA T GGGACTTTC 481 C TACTTGGCA G TACATCTAC G TATTAGTCA T CGCTATTAC C ATGGTGATG C GGTTTTGGC 541 A GTACATCAA T GGGCGTGGA T AGCGGTTTG A CTCACGGGG A TTTCCAAGT C TCCACCCCA 601 T TGACGTCAA T GGGAGTTTG T TTTGCACCA A AATCAACGG G ACTTTCCAA A ATGTCGTAA 661 C AACTCCGCC C CATTGACGC A AATGGGCGG T AGGCGTGTA C GGTGGGAGG T CTATATAAG 721 C AGAGCTCGT T TAGTGAACC G TCAGATCGC C TGGAGACGC C ATCCACGCT G TTTTGACCT 781 C CATAGAAGA C ACCGGGACC G ATCCAGCCT C CGCGGATTC G AATCCCGGC C GGGAACGGT 841 G CATTGGAAC G CGGATTCCC C GTGCCAAGA G TGACGTAAG T ACCGCCTAT A GAGTCTATA 901 G GCCCACAAA A AATGCTTTC T TCTTTTAAT A TACTTTTTT G TTTATCTTA T TTCTAATAC961 T TTCCCTAAT C TCTTTCTTT C AGGGCAATA A TGATACAAT G TATCATGCC T CTTTGCACC1021 A TTCTAAAGA A TAACAGTGA T AATTTCTGG G TTAAGGCAA T AGCAATATT T CTGCATATA 1081 A ATATTTCTG C ATATAAATT G TAACTGATG T AAGAGGTTT C ATATTGCTA A TAGCAGCTA 1141 C AATCCAGCT A CCATTCTGC T TTTATTTTA T GGTTGGGAT A AGGCTGGAT T ATTCTGAGT1201 C CAAGCTAGG C CCTTTTGCT A ATCATGTTC A TACCTCTTA T CTTCCTCCC A CAGCTCCTG1261 G GCAACGTGC T GGTCTGTGT G CTGGCCCAT C ACTTTGGCA A AGAATTGGG A 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GGTATTTCA 2101 C ACCGCATAC G TCAAAGCAA C CATAGTACG C GCCCTGTAG C GGCGCATTA A GCGCGGCGG 2161 G TGTGGTGGT T ACGCGCAGC G TGACCGCTA C ACTTGCCAG C GCCCTAGCG C CCGCTCCTT 2221 T CGCTTTCTT C CCTTCCTTT C TCGCCACGT T CGCCGGCTT T CCCCGTCAA G CTCTAAATC2281 G GGGGCTCCC T TTAGGGTTC C GATTTAGTG C TTTACGGCA C CTCGACCCC A AAAAACTTG 2341 A TTTGGGTGA T GGTTCACGT A GTGGGCCAT C GCCCTGATA G ACGGTTTTT C GCCCTTTGA 2401 C GTTGGAGTC C ACGTTCTTT A ATAGTGGAC T CTTGTTCCA A ACTGGAACA A CACTCAACC 2461 C TATCTCGGG C TATTCTTTT G ATTTATAAG G GATTTTGCC G ATTTCGGCC T ATTGGTTAA2521 A AAATGAGCT G ATTTAACAA A AATTTAACG C GAATTTTAA C AAAATATTA A CGTTTACAA2581 T TTTATGGTG C ACTCTCAGT A CAATCTGCT C TGATGCCGC A TAGTTAAGC C AGCCCCGAC2641 A CCCGCCAAC A CCCGCTGAC G CGCCCTGAC G GGCTTGTCT G CTCCCGGCA T CCGCTTACA2701 G ACAAGCTGT G ACCGTCTCC G GGAGCTGCA T GTGTCAGAG G TTTTCACCG T CATCACCGA 2761 A ACGCGCGAG A CGAAAGGGC C TCGTGATAC G CCTATTTTT A TAGGTTAAT G TCATGATAA 2821 T AATGGTTTC T TAGACGTCA G GTGGCACTT T TCGGGGAAA T GTGCGCGGA A CCCCTATTT 2881 G TTTATTTTT C TAAATACAT T CAAATATGT A TCCGCTCAT G AGACAATAA C CCTGATAAA2941 T GCTTCAATA A TATTGAAAA A GGAAGAGTA T GAGTATTCA A CATTTCCGT G TCGCCCTTA3001 T TCCCTTTTT T GCGGCATTT T GCCTTCCTG T TTTTGCTCA C CCAGAAACG C TGGTGAAAG3061 T AAAAGATGC T GAAGATCAG T TGGGTGCAC G AGTGGGTTA C ATCGAACTG G ATCTCAACA 3121 G CGGTAAGAT C CTTGAGAGT T TTCGCCCCG A AGAACGTTT T CCAATGATG A GCACTTTTA3181 A AGTTCTGCT A TGTGGCGCG G TATTATCCC G TATTGACGC C GGGCAAGAG C AACTCGGTC 3241 G CCGCATACA C TATTCTCAG A ATGACTTGG T TGAGTACTC A CCAGTCACA G AAAAGCATC3301 T TACGGATGG C ATGACAGTA A GAGAATTAT G CAGTGCTGC C ATAACCATG A GTGATAACA 3361 C TGCGGCCAA C TTACTTCTG A CAACGATCG G AGGACCGAA G GAGCTAACC G CTTTTTTGC 3421 A CAACATGGG G GATCATGTA A CTCGCCTTG A TCGTTGGGA A CCGGAGCTG A ATGAAGCCA 3481 T ACCAAACGA C GAGCGTGAC A CCACGATGC C TGTAGCAAT G GCAACAACG T TGCGCAAAC 3541 T ATTAACTGG C GAACTACTT A CTCTAGCTT C CCGGCAACA A TTAATAGAC T GGATGGAGG3601 C GGATAAAGT T GCAGGACCA C TTCTGCGCT C GGCCCTTCC G GCTGGCTGG T 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pAAV-‐minCMV-‐mCherry。
腺病毒载体治疗技术进展
腺病毒载体治疗技术进展腺病毒载体（Adeno-associated virus，AAV）治疗技术是一种近年来快速发展的基因治疗技术，它利用AAV这种天然存在而又不会引起人体免疫反应的病毒作为载体，将需要治疗的基因序列植入到人体细胞中，达到治疗疾病的目的。
经过多年的实践和研究，AAV治疗技术已成为基因治疗领域最重要的技术之一，对多种罕见遗传疾病、神经退行性疾病、癌症等疾病的治疗取得了重要的进展。
一、AAV的优势AAV作为一种病毒，有着天然存在且不会引起人体免疫反应的特点，因此成为了基因治疗的一种理想载体。
AAV的基因序列较小，仅为4.7kb，但可以携带外来基因序列，且其在非细胞因子诱导的条件下高效地感染到人体细胞，对多种细胞和组织类型具有广泛的适应性。
AAV的稳定性也很高，对于外界环境的影响不敏感，而且其整合到人体细胞的基因组中的概率非常低，也减少了潜在的基因毒性。
二、AAV治疗技术的现状目前，AAV治疗技术在多个领域有着广泛的应用和研究。
其中最重要的是在罕见遗传病的治疗方面，比如肌肉萎缩症、糖原贮积病、囊性纤维化、黑色素瘤等多种遗传疾病。
此外，AAV治疗技术也在神经系统疾病、心血管疾病、器官损伤修复、癌症等领域的治疗和研究中得到了广泛的应用。
一些治疗在临床前试验中已经显示出了显著的治疗效果，例如在亚致死疾病疗法方面，AAV治疗技术已经显示出显著的效果。
例如，肌肉萎缩症等病种的治疗效果均已显著地提高，并且这种治疗方法也成为了其他疾病治疗的借鉴。
而对于一些不可治愈的疾病，AAV的基因治疗方法则为疾病的管理和控制提供了有效的手段。
三、AAV治疗技术的难点虽然AAV治疗技术取得了一些研究上的成果以及一些临床应用的效果，但技术仍有很多的难点需要克服。
AAV载体的设计和构建是其中一个重要的难点，因为AAV载体所能携带的基因序列往往受到构建载体的限制。
此外，AAV载体的制备和净化也是技术难点之一，因为AAV所需的纯度非常高，同时纯化的方法也非常复杂。
(2021)腺病毒载体构建完美版PPT
AdEasy腺病毒载体系统
稳定 性高
腺病毒粒子相对稳定，插入外源基因的病毒基因组在 连续传代中保持不变，易于用重组DNA技术操作。
宿主范 可转入分裂后的非分裂细胞中发挥作用，可以感染处
围广
于分裂状态的细胞。
感染 性
强
可经不同途量 改建腺病毒基因部分缺失载体的克隆容量可达10kb， 大 腺病毒基因完全缺失载体克隆容量可达37kb。
腺病毒载体大多以5型（Ad5）、2型（Ad2）为基础
重组系统由2种质粒 构成：一、包含全 部（或右侧大部分） 腺病毒基因组DNA 的大质粒，即骨架 质粒
二、小的穿梭质粒，其带有 目的基因的表达盒以及表达 盒两侧的与大质粒上的目的 基因拟插入部位同源序列 （左右臂）
ITR Ψ E1a/E1b E2 E3 E4 ITR 统需要一个腺病毒突变体作为辅助病毒。 ，一般常用Ad5型腺病毒） E4蛋白调节有效的晚期基因转录
E2蛋白涉及AdDNA复制 E3蛋白对抗宿主的抗病毒防御系统 E4蛋白调节有效的晚期基因转录
腺病毒分类
第一代腺病毒载体：一般将E1或E3基因缺失的腺病毒载体成为一代
载体。此类型载体在未纯化时可引发机体产生较 强的炎症反应和免疫反应，纯化后可安全使用， 体内表达周期可达4周。（科研、临床应用最广 泛 ，一般常用Ad5型腺病毒）
•腺病毒可见于人、鸡、牛、狗、鼠、猪和猴中，并各自具 有严格的寄主特异性，不感染他种动物。对人类可引起感冒 症状、呼吸系统不适等。
腺病毒 是一种大分子线性双链无包膜DNA病毒。它 通过 受体介导的内吞作用进入细胞内，然后腺病 毒基因组转移至细胞核内，保持在染色体外，不整 合进入宿主细胞基因组中.
腺病毒的基因及其功能
ITR Ψ E1a/E1b E2 E3 E4 ITR
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2020/9/15
基因药物研发中心
11
管理制度
• 建立了300多个SOP、SMP等标准程 序和规章管理制度，按照GMP要求 严格规范管理。
2020/9/15
基因药物研发中心
12
研发中心工艺平台
• 研发中心工艺产业化平台是通用型腺病毒载体药 物生产工艺和质量标准研究的药学技术平台，中 试生产工艺水平达到了国内同行业先进水平，可 以在产量及质量上满足腺病毒载体药物临床前和 临床用样品制备的要求。
• 本工艺拥有自主知识产权，可作为腺病毒载体新 药研发及生产的技术基础。
• 5L细胞罐收获物经纯化后产量能达到E15VP/批， 注射液制剂工艺达到了小容量水针1万支/批的生 产能力。
细胞罐扩增
5L罐细胞培养，病毒扩增： DO60%,37℃,pH7.2, 耗糖40g/d接种病毒，MOI为20
罐 收获物
6000RPM离 心20min 500K膜超滤浓缩10倍
超滤浓缩液 SOURCE 30Q 阴离子交换柱层析
层析收集液 Sepharose 6 Fast Flow 分子筛层析
原液
H30产量
17
建细胞库
原始细胞
细胞扩增
主细胞库
细胞扩增
工作细胞库
细胞来源于ATCC
质量控制 质量控制
2020/9/15
基因药物研发中心
18
建毒种库
原始种子批
病毒扩增
主种子批
病毒扩增
工作种子批
鉴定检 测
质量控 制
质量控 制
2020/9/15
基因药物研发中心
19
原液工艺流程、参数及技术指标
细胞种子
重组腺病 毒种子
• 上游构建及鉴定 • 细胞/毒种研究及三级库建立 • 原液工艺研究 • 制剂工艺研究 • 检测方法及质量标准研究 • 稳定性研究 • 试制三批样品
2020/9/15
基因药物研发中心
16
细胞及毒种研究
• 细胞检定、传代稳定性研究 • 毒种检定、代次及遗传稳定性研究
2020/9/15
基因药物研发中心
• 产品纯度大于98%，比滴度大于3.3%，各项质检 结果都能达到FDA对腺病毒类生物制品的质量标 准要求。
2020/9/15
基因药物研发中心
13
研发中心已完成申报临床所需药学研究的 品种
品种
治疗性重组 HBV腺病毒疫 苗
代号
CHB3
研究单位
源兴
治疗性HIV腺病 H30
毒载体疫苗
源兴
研究时间
2004年3月至 2005年11月
（3批平均）
460ml 1.1×1015 VP
回收率
（3批平均）
53%
2020/9/15
基因药物研发中心
20
细胞罐工艺
细胞复苏培养
罐细胞培养
罐细胞染毒
毒种制备
罐病毒培养
纯化
2020/9/15
基因药物研发中心
21
细胞罐葡萄糖消耗监控曲线图
日糖耗(g)
图2 六罐实验日糖耗曲线 70
60 50
40
30
8
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基因药物研发中心
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研发中心生产系统组织图
总经理
生产总监
工艺开发部 （10人）
质控部 （5人）
设备工程部 （4人）
细胞病毒培养
纯化
制剂分装
清洁辅助
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基因药物研发中心
物控部 （3人）
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研发队伍
• 打造了一支技术过硬的研发队伍，能 够保证工艺水平及产品质量稳定。
源兴基因药物研发中心
腺病毒载体工艺平台介绍
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研发中心厂房及设备
源兴基因药物研发中心建筑面积1900多平方 米，其中符合国家GMP要求的洁净厂房面积1600 多平方米，包括原液生产车间、制剂生产车间、 质量控制实验室以及研发实验室。
研发中心配置了NBS细胞罐、AKTA纯化系统、 高速冷冻离心机、切向流超滤系统、二氧化碳培 养箱、生物安全柜、分析型HPLC系统、PCR仪、 电泳仪、酶标仪、超声波破碎仪、超声波西林瓶 清洗机、隧道式灭菌烘箱、液体灌装加塞机、轧 盖机、凝胶扫描成像系统、超纯水仪、多效蒸馏 水机等仪器设备。
能够满足腺病毒载体药物研发、生产和质量 控制的要求。
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2005年12月 至2007年8月
治疗性重组腺 病毒EB病毒潜 伏膜抗原疫苗
LMP2
CDC病毒病所委托 源兴承担药学研究
2007年9月至 2008年10月
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新药申报三方面研究内容
• 药学研究 • 药效研究 • 安全评价
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药学研究主要内容
20 10
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
培养天数(天)
B0704日糖耗(g) B0802日糖耗(g)
B0705日糖耗(g) B0803日糖耗(g)
B0706日糖耗(g) B0804日糖耗(g)
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细胞罐产毒浓度曲线
Manual run 1:1_Conc
罐内病毒VP浓度(HPLC峰面积)
图4 EGFR三罐病毒培养期VP浓度曲线
700000
600000
500000
400000 300000
200000
100000 0
0 4 6 30 48 72 96 120 144
1
2
3
4
5
6
7
8
9
病毒培养时间(小时)
B0704病毒培养期VP浓度(HPLC峰面积) B0804日收获病毒VP(HPLC峰面积)
B0803日收获病毒vp(HPLC峰面积) 感染时间(小时)
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细胞罐病毒收获曲线
日收获病毒VP(e14)
图3 EGFR三罐实验日糖耗&日收获病毒比较
8
7
6
5
4 3
2
1
0
1
2
3
4
5
6
病毒培养时间(天)
B0704日收获病毒VP(e14) B0804日收获病毒VP(e14)
B0803日收获病毒vp(e14)
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纯化工艺
罐病毒收获液
离心 超滤浓缩
酶切 离子交换层析
分子筛层析
原液
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纯化图谱
mAU 800
Manual run 1:1_UV1_280nm
Manual run 1:1_UV2_260nm
Manual run 1:1_Cond