腺苷

游泳测试计划
6.机械性异常疼痛的测量
• 如前文所述的机械异常性疼痛测定（努奇等人， 2012;。马丁斯等人，2012）。这个试验是在封闭 玻璃圆筒（20厘米直径），内有抬高的金属丝网 平台，以使小鼠访后爪腹面接触。右后爪用0.4克恒定压力的von Frey纤毛刺激（Stoelting，芝 加哥，美国）。响应频率为10个反用被取为异常 性疼痛的行为。机械性刺激的反应（爪子后退的 数目）被记录，并表示为退缩反应的百分率（马 丁斯等人，2012）。机械异常性疼痛分别于IR前 （基线），7天后，以及高强的游泳训练后30分钟 和24小时评估，连续五天。另外，机械性疼痛阈 值在最后一个运动后48小时进行评估。
４.制备CRPS-I动物模型
• 慢性局部缺血后疼痛（CPIP）是使用啮齿动物后肢3小时 的缺血再灌注损伤改进的动物CRPS–I模型. • 参照文献制备CPIP动物模型。(Millecamps et al,2010;努奇
等,2012)
• CPIP动物模型通过长时间后爪缺血再灌注（IR）产生。

水合氯醛麻醉小鼠， 将1.2毫米内径的弹性O型环放在右后肢刚好接近踝关节处。 O形 圈的尺寸松紧应刚好产生缺血。
8.实验2：腺苷受体参与的高强度的运动减轻 异常性疼痛
• 探讨高强度游泳运动减轻疼痛时腺苷受体的作用，运动或 非运动动物在运动开始前20分钟进行生理盐水（10毫升/ 公斤，IP）或咖啡因（10毫克/千克，IP，Sawynok等人， 2010）预处理，连续五天。在这个实验中，利用下列组 （N = 8）： • （1）假手术组+NS， • （2）IR +NS+ 非运动， • （3）IR +咖啡因+ 非运动， • （4）IR +NS+运动， • （5）IR +咖啡因+运动。 • 如上所述（见“机械性异常性疼痛的测量 ”）对机械性 异常性疼痛进行评估。
有充分证据表明A1R的激活在神经性和炎症性疼痛模型中产生镇痛作用 （ Sawynok ， 2013 ） 。 缺乏A1R小鼠表现出增加的伤害性反应增加。另一方面，应用A1R拮抗剂后 没有显示出镇痛效果，证实A1R在镇痛作用中的重要性（Wu等，2005）。 A1RS参与抑制痛觉在脊髓，轴索上和外周神经的传导（ Sawynok ， 1998 年和Sawynok ， 1999） 。 本研究表明，咖啡因的全身给药通过具有相当的亲和力阻滞腺苷A1RS和 A2ARs（ Fredholm型等人， 1999） ， DPCPX ，一种选择性腺苷A1受体拮抗剂，能够反转运动诱导的镇痛 ，显 示A1R激活是必要的。但是，我们不能确定黄嘌呤作用的位点。在今后将研究 哪些位点（通过鞘内或足底内注射黄嘌呤的）对生产运动依赖的A1RS止痛作 用是必要的。
9.实验3：高强度运动诱导的A1R和A2AR亚型 参与抗痛觉超敏
9.2为区分腺苷A2AR可能参与运动性镇痛，非运动或运动动 物用溶剂（10毫升/公斤，IP）或选择性腺苷A2AR拮抗剂 （ZM241385，3毫克/千克，IP，纳西门托等人，2010）进行 预处理。在这个实验中，应用下列分组（N = 8）： （1）假手术组+溶剂， （2）IR +溶剂+ 非运动， （3）IR + ZM241385+ 非运动， （4）IR +溶剂+运动， （5）IR + ZM241385+运动。 如上所述（见机械性异常性疼痛的测量）对机械性异常 性疼痛进行评估。
我们假设：高强度运动产生的镇痛作用可能通过腺苷受体 的活化来介导。 本研究拟通过药理干预的手段，验证腺苷系统在该模型中 的作用机制。
3 实验程序
3.1动物：雄性瑞士小鼠（25-35克） 3.2药物：
二甲基亚砜（DMSO） 水合氯醛， 咖啡因， erythro-9-(2-hydroxy-3nonyl) 腺嘌呤（EHNA） 盐酸纳洛酮 DPCPX， ZM241385
10.实验3：高强度运动导致的抗异常性疼痛 中腺苷脱氨酶的抑制效应
• 为调查运动诱导的抗异常性疼痛中腺苷脱氨酶抑制剂的效 果，游泳锻炼前4小时对非运动或运动动物进行预处理溶 剂（10ml/kg，IP）或腺苷脱氨酶抑制剂，erythro-9-(2hydroxy-3nonyl)腺嘌呤（EHNA，5毫克/公斤，IP，剂量 是由在实验室进行了初步试验确定）。在这个实验中，应 用下列分组（N = 8）： • （1）假手术组+溶剂， • （2）IR +溶剂+ nonexercise， • （3）IR + EHNA+ nonexercise， • （4）IR +溶剂+运动， • （5）IR + EHNA+ exercise. • IR前（基线）、，IR之后7天，游泳运动后0.5，1，2，4， 6，24和30小时对机械性异常性疼痛进行评估。
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腺苷A2ARs的作用是比较模糊的。 A2ARs激活已涉及到促进痛觉和镇痛的作用。 在外周腺苷A2ARs的激活似乎促进痛觉 (Doak and Sawynok, 1995) 然而，在三个研究中，腺苷A2AR激动剂鞘内注射在急性伤害性疼痛模型，炎 性疼痛模型和神经性疼痛模型中有镇痛作用（李和Yaksh ， 1996年，潘和 Sawynok ， 1998年和Suh等人，1997 ） 。 越来越多的文献表明体内腺苷受体激动剂A2AR对周围的免疫细胞有强效抗炎 作用，其中包括抑制促炎性细胞因子和增强抗炎细胞因子，白细胞介素-10 （IL- 10 ）的产生（ Haskó和Cronstein ，2004）。 有一点是肯定的：腺苷A2ARs是Gαs偶联受体，激活腺苷酸环化酶从而增加环 磷酸腺苷（ cAMP）的产生（ Haskó等人， 2007）是一致的。 此外，已证实大鼠腰椎脊髓背角的胶质神经元中存在腺苷A2ARs并且A2AR激动 剂的抑制NMDA诱导的电流通过，因此，腺苷A2AR配位体可以在脊髓水平调节 疼痛的处理（ Guntz等人，2008）。 发现， ZM241385扭转在10和11天由运动引起的止痛作用，当评估运动24小时 时，小幅度的腺苷A2AR活化是必要的。
9.实验3：高强度运动诱导的A1R和A2AR亚型 参与抗痛觉超敏
• 评估腺苷A1R亚型可能参与运动诱发的镇痛，非运动或运 动动物进行重复的溶剂(NS) （10毫升/公斤，IP）或选择 性腺苷A1R拮抗剂（黄嘌呤，0.1毫克/千克，IP， Nascimento et al., 2010）预处理。在这个实验中，应 用下列分组（N = 8）： • （1）假手术组+溶剂， • （2）IR +溶剂+ 非运动， • （3）IR + DPCPX+ 非运动， • （4）IR +溶剂+运动，并 • （5）IR + DPCPX+运动。

他们被留在肢体3小时作为最初描述较大的O形圈的。 O型圈总是 定位在刚好接近内踝，其应用标准是将后爪尽量塞入100微升微量 移液器头后， O形圈从微量移液器头外滑下（即有较大的一端切4 毫米）。（说得不明白，再看看）
假手术组小鼠接受完全相同的步骤，不同的是O形环未被切断，这 样它仅松散地包围脚踝，未阻塞右后爪血流。
7.实验1：高强度游泳运动对CRPS-Ⅰ的影响
7.1为了表示高强度运动对IR所造成的机械异常痛的影响， 运动方案在IR后7天实施。我们选择IR后7天，因为此时有 三种疼痛的条件的组合： • （1）炎症， • （2）持续的缺血状态， • （3）继发性神经损伤（ Millecamps and Coderre, 2008）。 7.2运动程序包括连续五天游泳锻炼（30分钟），一天一次。 在这个实验中，利用下列分组（N = 8）： • （1）假手术组， • （2）IR +非运动， • （3）IR +运动组。 • 如上所述对机械性异常性疼痛进行评估（见''测量痛觉异 常''）。
2 理论依据及实验设计
2.5 以往研究表明：

ATP和腺苷通过作用于轴索、脊髓和外周部位调节痛觉传导，并可 能在炎性和神经性疼痛中发挥重要作用。 高强度的游泳运动可通过激活阿片和血清素受体减轻小鼠疼痛相 关的行为。 腺苷和肌苷的镇痛作用与腺苷A1R和A2AR亚型有关。
2.6鉴于：
①高强度的运动增加血液中的腺苷和肌苷的浓度。 ②腺苷受体激活诱导的镇痛。
高强度百度文库游泳运动降低CRPS-I动物模型 的神经性疼痛:腺苷系统参与的证据
１实验目的
1.1 探讨腺苷系统在通过运动减轻CRPS-I动物模型 的疼痛中的机制。 1.2 分析阿片受体在该模型中的作用。
2 理论依据及实验设计
2.1在运动过程中会有高速率的ATP分解，这会导致组织内高腺苷水平。 2.2多种细胞均可产生腺苷，包括：神经元、心肌、骨骼肌。
12.统计分析
12.1 各组结果的平均值（SEM）表示为平 均 值±标准误差。 12.2 使用双向方差分析重复测量，用Bonferroni多 重比较，作为事后测试行为测试进行比较。差异以P <0.05的值被认为是显著。
13.结果
13.1重复高强度游泳运动会减少crps-I的机械性异 常疼痛 13.2当与基线应答相比，IR后第7天小鼠进行呈显着 的机械性异常性疼痛。当与非运动组（图2A）相比， 第7，8，9，10和11天30分钟的高强度的后产生了显 著减少机械性异常疼痛（P <0.05）。 • 与IR + 非运动组（图2B）进行比较，连续五天高 强度的运动后24小时也减少了机械痛。

因此腺苷可以超出细胞内嘌呤分解代谢途径。 过量的(腺苷)移出细胞，积聚在细胞外间隙与血液。 高水平的腺苷通过嘌呤途径调控细胞外腺苷受体，并影响血管生成、血流
量、收缩压、呼吸、血浆去甲肾上腺素和肾上腺素的水平，从而对人体的
运动表现出复杂的适应性反应。
2.3腺苷在人类血液中半衰期大约10秒，通过四种腺苷受体（ARS）A1、 A2A、 A2B和A3 (均为G-蛋白偶联受体)发挥作用。 2.4腺苷通过腺苷激酶转变成ATP ，而过量的则通过腺苷脱氨酶经过嘌呤 分解代谢途径转化成肌苷，次黄嘌呤，黄嘌呤，最终成为尿酸。

5.高强度游泳运动方案
5.1高强度的游泳锻炼方式由 Mazzardo-Martins等进行了描述 （2010年） 。 5.2此实验设计团队过去曾经表明，该方式在最后一天的最后 30分钟运动后使乳酸的血中浓度增加到7.84 ± 1.40 mmol / L，表明这是一种高强度的运动。 5.3动物被放置在一个有8隔间的塑料盒子中（ 170 ×100毫 米），内充35升37摄氏度的水。（ 8毫升）液体香皂加入水 中以降低表面张力，并消除‘’浮动‘’行为。每次训练后， 动物用一块毛巾轻柔干燥。 5.4对照组（ 非运动）让小鼠每天游泳仅30秒，并毛巾干燥。
11.实验4：高强度运动诱发的阿片受体参与 抗异常性疼痛
• 体育锻炼的止痛作用主要是由阿片系统介导的。为验证内 源性阿片样物质对游泳练习的止痛作用的贡献，我们测试 了纳洛酮的效果。非运动或运动动物用生理盐水（10毫升 /公斤，IP）或纳洛酮（1毫克/千克，IP，非选择性阿片 受体拮抗剂）（Mazzardo-Martins et al., 2010; Martins et al.,2012).）进行预处理 。在这个实验中， 利用下列分组（N = 8）： • （1）假手术组+溶剂， • （2）IR +溶剂+ 非运动， • （3）IR +纳洛酮+ 非运动， • （4）IR +溶剂+运动， • （5）IR +纳洛酮+运动。 • 如上所述（参见“机械性异常性疼痛的测定”）对机械性 异常性疼痛进行评估。
CRPS-I在高强度游泳运动后分别在30分钟和24小时进行von-frey测试，
运动前20分钟咖啡因和纳洛酮干预后的效果
运动前20分钟DPCPX和ZM241385 干预后的效果
运动前给予腺苷脱氨酶抑制剂（EHNA）后的效果
14.讨论
以前的研究已经表明，腺苷可能通过影响血管生成，红细胞生成素 生产，血流量，收缩期血压，呼吸，血浆去甲肾上腺素和肾上腺素的 水平对身体的适应性应答产生显著作用（ Simpson and Phillis, 1992; Marshall , 2007） 。然而，运动导致的腺苷释放对控制疼痛 的可能影响是未知的。这次研究结果证实了以前报告（贝门特和 Sluka ， 2005年， Kuphal等人， 2007年和斯塔格等人， 2011） ， 证实了在啮齿类动物中的运动性镇痛，并从观察高强度的游泳运动在 神经病理性疼痛模型中的止痛作用（ Cobianchi等人， 2010）扩展 到另一个疼痛模型（ CRPS -I ） 。咖啡因和黄嘌呤的处理逆转由运 动产生的止痛作用，提示A1R的参与效果是必要的。 ZM241385或纳洛酮治疗也逆转运动诱导的镇痛作用 ，但ZM的作用 是在较小的幅度。腺苷脱氨酶抑制剂（ EHNA ）的动物的治疗提高了 运动性镇痛。