腺苷

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腺苷A2ARs的作用是比较模糊的。 A2ARs激活已涉及到促进痛觉和镇痛的作用。 在外周腺苷A2ARs的激活似乎促进痛觉 (Doak and Sawynok, 1995) 然而，在三个研究中，腺苷A2AR激动剂鞘内注射在急性伤害性疼痛模型，炎 性疼痛模型和神经性疼痛模型中有镇痛作用（李和Yaksh ， 1996年，潘和 Sawynok ， 1998年和Suh等人，1997 ） 。 越来越多的文献表明体内腺苷受体激动剂A2AR对周围的免疫细胞有强效抗炎 作用，其中包括抑制促炎性细胞因子和增强抗炎细胞因子，白细胞介素-10 （IL- 10 ）的产生（ Haskó和Cronstein ，2004）。 有一点是肯定的：腺苷A2ARs是Gαs偶联受体，激活腺苷酸环化酶从而增加环 磷酸腺苷（ cAMP）的产生（ Haskó等人， 2007）是一致的。 此外，已证实大鼠腰椎脊髓背角的胶质神经元中存在腺苷A2ARs并且A2AR激动 剂的抑制NMDA诱导的电流通过，因此，腺苷A2AR配位体可以在脊髓水平调节 疼痛的处理（ Guntz等人，2008）。 发现， ZM241385扭转在10和11天由运动引起的止痛作用，当评估运动24小时 时，小幅度的腺苷A2AR活化是必要的。

他们被留在肢体3小时作为最初描述较大的O形圈的。 O型圈总是 定位在刚好接近内踝，其应用标准是将后爪尽量塞入100微升微量 移液器头后， O形圈从微量移液器头外滑下（即有较大的一端切4 毫米）。（说得不明白，再看看）
假手术组小鼠接受完全相同的步骤，不同的是O形环未被切断，这 样它仅松散地包围脚踝，未阻塞右后爪血流。

因此腺苷可以超出细胞内嘌呤分解代谢途径。 过量的(腺苷)移出细胞，积聚在细胞外间隙与血液。 高水平的腺苷通过嘌呤途径调控细胞外腺苷受体，并影响血管生成、血流
量、收缩压、呼吸、血浆去甲肾上腺素和肾上腺素的水平，从而对人体的
运动表现出复杂的适应性反应。
2.3腺苷在人类血液中半衰期大约10秒，通过四种腺苷受体（ARS）A1、 A2A、 A2B和A3 (均为G-蛋白偶联受体)发挥作用。 2.4腺苷通过腺苷激酶转变成ATP ，而过量的则通过腺苷脱氨酶经过嘌呤 分解代谢途径转化成肌苷，次黄嘌呤，黄嘌呤，最终成为尿酸。
8.实验2：腺苷受体参与的高强度的运动减轻 异常性疼痛
• 探讨高强度游泳运动减轻疼痛时腺苷受体的作用，运动或 非运动动物在运动开始前20分钟进行生理盐水（10毫升/ 公斤，IP）或咖啡因（10毫克/千克，IP，Sawynok等人， 2010）预处理，连续五天。在这个实验中，利用下列组 （N = 8）： • （1）假手术组+NS， • （2）IR +NS+ 非运动， • （3）IR +咖啡因+ 非运动， • （4）IR +NS+运动， • （5）IR +咖啡因+运动。 • 如上所述（见“机械性异常性疼痛的测量 ”）对机械性 异常性疼痛进行评估。
9.实验3：高强度运动诱导的A1R和A2AR亚型 参与抗痛觉超敏
• 评估腺苷A1R亚型可能参与运动诱发的镇痛，非运动或运 动动物进行重复的溶剂(NS) （10毫升/公斤，IP）或选择 性腺苷A1R拮抗剂（黄嘌呤，0.1毫克/千克，IP， Nascimento et al., 2010）预处理。在这个实验中，应 用下列分组（N = 8）： • （1）假手术组+溶剂， • （2）IR +溶剂+ 非运动， • （3）IR + DPCPX+ 非运动， • （4）IR +溶剂+运动，并 • （5）IR + DPCPX+运动。
2 理论依据及实验设计
2.5 以往研究表明：

ATP和腺苷通过作用于轴索、脊髓和外周部位调节痛觉传导，并可 能在炎性和神经性疼痛中发挥重要作用。 高强度的游泳运动可通过激活阿片和血清素受体减轻小鼠疼痛相 关的行为。 腺苷和肌苷的镇痛作用与腺苷A1R和A2AR亚型有关。
2.6鉴于：
①高强度的运动增加血液中的腺苷和肌苷的浓度。 ②腺苷受体激活诱导的镇痛。
CRPS-I在高强度游泳运动后分别在30分钟和24小时进行von-frey测试，
运动前20分钟咖啡因和纳洛酮干预后的效果
运动前20分钟DPCPX和ZM241385 干预后的效果
运动前给予腺苷脱氨酶抑制剂（EHNA）后的效果
14.讨论
以前的研究已经表明，腺苷可能通过影响血管生成，红细胞生成素 生产，血流量，收缩期血压，呼吸，血浆去甲肾上腺素和肾上腺素的 水平对身体的适应性应答产生显著作用（ Simpson and Phillis, 1992; Marshall , 2007） 。然而，运动导致的腺苷释放对控制疼痛 的可能影响是未知的。这次研究结果证实了以前报告（贝门特和 Sluka ， 2005年， Kuphal等人， 2007年和斯塔格等人， 2011） ， 证实了在啮齿类动物中的运动性镇痛，并从观察高强度的游泳运动在 神经病理性疼痛模型中的止痛作用（ Cobianchi等人， 2010）扩展 到另一个疼痛模型（ CRPS -I ） 。咖啡因和黄嘌呤的处理逆转由运 动产生的止痛作用，提示A1R的参与效果是必要的。 ZM241385或纳洛酮治疗也逆转运动诱导的镇痛作用 ，但ZM的作用 是在较小的幅度。腺苷脱氨酶抑制剂（ EHNA ）的动物的治疗提高了 运动性镇痛。

5.高强度游泳运动方案
5.1高强度的游泳锻炼方式由 Mazzardo-Martins等进行了描述 （2010年） 。 5.2此实验设计团队过去曾经表明，该方式在最后一天的最后 30分钟运动后使乳酸的血中浓度增加到7.84 ± 1.40 mmol / L，表明这是一种高强度的运动。 5.3动物被放置在一个有8隔间的塑料盒子中（ 170 ×100毫 米），内充35升37摄氏度的水。（ 8毫升）液体香皂加入水 中以降低表面张力，并消除‘’浮动‘’行为。每次训练后， 动物用一块毛巾轻柔干燥。 5.4对照组（ 非运动）让小鼠每天游泳仅30秒，并毛巾干燥。
４.制备CRPS-I动物模型
• 慢性局部缺血后疼痛（CPIP）是使用啮齿动物后肢3小时 的缺血再灌注损伤改进的动物CRPS–I模型. • 参照文献制备CPIP动物模型。(Millecamps et al,2010;努奇
等,2012)
• CPIP动物模型通过长时间后爪缺血再灌注（IR）产生。

水合氯醛麻醉小鼠， 将1.2毫米内径的弹性O型环放在右后肢刚好接近踝关节处。 O形 圈的尺寸松紧应刚好产生缺血。
ห้องสมุดไป่ตู้
游泳测试计划
6.机械性异常疼痛的测量
• 如前文所述的机械异常性疼痛测定（努奇等人， 2012;。马丁斯等人，2012）。这个试验是在封闭 玻璃圆筒（20厘米直径），内有抬高的金属丝网 平台，以使小鼠访后爪腹面接触。右后爪用0.4克恒定压力的von Frey纤毛刺激（Stoelting，芝 加哥，美国）。响应频率为10个反用被取为异常 性疼痛的行为。机械性刺激的反应（爪子后退的 数目）被记录，并表示为退缩反应的百分率（马 丁斯等人，2012）。机械异常性疼痛分别于IR前 （基线），7天后，以及高强的游泳训练后30分钟 和24小时评估，连续五天。另外，机械性疼痛阈 值在最后一个运动后48小时进行评估。
有充分证据表明A1R的激活在神经性和炎症性疼痛模型中产生镇痛作用 （ Sawynok ， 2013 ） 。 缺乏A1R小鼠表现出增加的伤害性反应增加。另一方面，应用A1R拮抗剂后 没有显示出镇痛效果，证实A1R在镇痛作用中的重要性（Wu等，2005）。 A1RS参与抑制痛觉在脊髓，轴索上和外周神经的传导（ Sawynok ， 1998 年和Sawynok ， 1999） 。 本研究表明，咖啡因的全身给药通过具有相当的亲和力阻滞腺苷A1RS和 A2ARs（ Fredholm型等人， 1999） ， DPCPX ，一种选择性腺苷A1受体拮抗剂，能够反转运动诱导的镇痛 ，显 示A1R激活是必要的。但是，我们不能确定黄嘌呤作用的位点。在今后将研究 哪些位点（通过鞘内或足底内注射黄嘌呤的）对生产运动依赖的A1RS止痛作 用是必要的。
12.统计分析
12.1 各组结果的平均值（SEM）表示为平 均 值±标准误差。 12.2 使用双向方差分析重复测量，用Bonferroni多 重比较，作为事后测试行为测试进行比较。差异以P <0.05的值被认为是显著。
13.结果
13.1重复高强度游泳运动会减少crps-I的机械性异 常疼痛 13.2当与基线应答相比，IR后第7天小鼠进行呈显着 的机械性异常性疼痛。当与非运动组（图2A）相比， 第7，8，9，10和11天30分钟的高强度的后产生了显 著减少机械性异常疼痛（P <0.05）。 • 与IR + 非运动组（图2B）进行比较，连续五天高 强度的运动后24小时也减少了机械痛。
11.实验4：高强度运动诱发的阿片受体参与 抗异常性疼痛
• 体育锻炼的止痛作用主要是由阿片系统介导的。为验证内 源性阿片样物质对游泳练习的止痛作用的贡献，我们测试 了纳洛酮的效果。非运动或运动动物用生理盐水（10毫升 /公斤，IP）或纳洛酮（1毫克/千克，IP，非选择性阿片 受体拮抗剂）（Mazzardo-Martins et al., 2010; Martins et al.,2012).）进行预处理 。在这个实验中， 利用下列分组（N = 8）： • （1）假手术组+溶剂， • （2）IR +溶剂+ 非运动， • （3）IR +纳洛酮+ 非运动， • （4）IR +溶剂+运动， • （5）IR +纳洛酮+运动。 • 如上所述（参见“机械性异常性疼痛的测定”）对机械性 异常性疼痛进行评估。
9.实验3：高强度运动诱导的A1R和A2AR亚型 参与抗痛觉超敏
9.2为区分腺苷A2AR可能参与运动性镇痛，非运动或运动动 物用溶剂（10毫升/公斤，IP）或选择性腺苷A2AR拮抗剂 （ZM241385，3毫克/千克，IP，纳西门托等人，2010）进行 预处理。在这个实验中，应用下列分组（N = 8）： （1）假手术组+溶剂， （2）IR +溶剂+ 非运动， （3）IR + ZM241385+ 非运动， （4）IR +溶剂+运动， （5）IR + ZM241385+运动。 如上所述（见机械性异常性疼痛的测量）对机械性异常 性疼痛进行评估。
我们假设：高强度运动产生的镇痛作用可能通过腺苷受体 的活化来介导。 本研究拟通过药理干预的手段，验证腺苷系统在该模型中 的作用机制。
3 实验程序
3.1动物：雄性瑞士小鼠（25-35克） 3.2药物：
二甲基亚砜（DMSO） 水合氯醛， 咖啡因， erythro-9-(2-hydroxy-3nonyl) 腺嘌呤（EHNA） 盐酸纳洛酮 DPCPX， ZM241385
10.实验3：高强度运动导致的抗异常性疼痛 中腺苷脱氨酶的抑制效应
• 为调查运动诱导的抗异常性疼痛中腺苷脱氨酶抑制剂的效 果，游泳锻炼前4小时对非运动或运动动物进行预处理溶 剂（10ml/kg，IP）或腺苷脱氨酶抑制剂，erythro-9-(2hydroxy-3nonyl)腺嘌呤（EHNA，5毫克/公斤，IP，剂量 是由在实验室进行了初步试验确定）。在这个实验中，应 用下列分组（N = 8）： • （1）假手术组+溶剂， • （2）IR +溶剂+ nonexercise， • （3）IR + EHNA+ nonexercise， • （4）IR +溶剂+运动， • （5）IR + EHNA+ exercise. • IR前（基线）、，IR之后7天，游泳运动后0.5，1，2，4， 6，24和30小时对机械性异常性疼痛进行评估。
7.实验1：高强度游泳运动对CRPS-Ⅰ的影响
7.1为了表示高强度运动对IR所造成的机械异常痛的影响， 运动方案在IR后7天实施。我们选择IR后7天，因为此时有 三种疼痛的条件的组合： • （1）炎症， • （2）持续的缺血状态， • （3）继发性神经损伤（ Millecamps and Coderre, 2008）。 7.2运动程序包括连续五天游泳锻炼（30分钟），一天一次。 在这个实验中，利用下列分组（N = 8）： • （1）假手术组， • （2）IR +非运动， • （3）IR +运动组。 • 如上所述对机械性异常性疼痛进行评估（见''测量痛觉异 常''）。
高强度的游泳运动降低CRPS-I动物模型 的神经性疼痛:腺苷系统参与的证据
１实验目的
1.1 探讨腺苷系统在通过运动减轻CRPS-I动物模型 的疼痛中的机制。 1.2 分析阿片受体在该模型中的作用。
2 理论依据及实验设计
2.1在运动过程中会有高速率的ATP分解，这会导致组织内高腺苷水平。 2.2多种细胞均可产生腺苷，包括：神经元、心肌、骨骼肌。