主要荧光素一览表
卫生资格检验技师知识点归纳
卫生资格检验技师知识点归纳为适应我国人事制度的改革，由人事部与卫生部共同组织实施了卫生专业技术资格考试。
接下来应届毕业生店铺为大家编辑整理了卫生资格检验技师知识点归纳，希望对大家有所帮助。
荧光色素许多物质都可产生荧光现象，但并非都可用作荧光色素。
只有那些能产生明显的荧光并能作为染料使用的有机化合物才能称为免疫荧光色素或荧光染料。
常用的荧光色素有：1.异硫氰酸荧光素(fluoresceinisothiocyanate，FITC)为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水或酒精等溶剂。
分子量为389.4，最大吸收光波长为490——495nm，最大发射光波长520——530nm，呈现明亮的黄绿色荧光，结构式如下：有两种同分异结构，其中异构体Ⅰ型在效率、稳定性、与蛋白质结合能力等方面都更好，在冷暗干燥处可保存多年，是应用最广泛的荧光素。
其主要优点是：①人眼对黄绿色较为敏感，②通常切片标本中的绿色荧光少于红色。
2.四乙基罗丹明(rhodamine，RIB200)为橘红色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮。
性质稳定，可长期保存。
结构式如下：最大吸收光波长为570nm，最大发射光波长为595～600nm，呈橘红色荧光。
3.四甲基异硫氰酸罗丹明(tetramethylrhodamineisothiocyanate，TRITC)结构式如下：最大吸引光波长为550nm，最大发射光波长为620nm，呈橙红色荧光。
与FITC的翠绿色荧光对比鲜明，可配合用于双重标记或对比染色。
其异硫氰基可与蛋白质结合，但荧光效率较低。
免疫荧光原理免疫学的基本反应是抗原-抗体反应。
由于抗原抗体反应具有高度的特异性，所以当抗原抗体发生反应时，只要知道其中的一个因素，就可以查出另一个因素。
免疫荧光技术就是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体(或抗原)上，与其相应的抗原(或抗体)结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。
直接法：将标记的特异性荧光抗体，直接加在抗原标本上，经一定的温度和时间的染色，用水洗去未参加反应的多余荧光抗体，室温下干燥后封片、镜检。
常见荧光素
常见荧光素：（1）异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate, FITC) ：FITC纯品为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水和酒精溶剂。
有两种异构体，其中异构体Ⅰ型在效率、稳定性与蛋白质结合力等方面都更优良。
FITC分子量为389.4，最大吸收光波长为490～495nm，最大发射光波长为520～530nm，呈现明亮的黄绿色荧光。
FITC在冷暗干燥处可保存多年，是目前应用最广泛的荧光素。
其主要优点是人眼对黄绿色较为敏感，通常切片标本中的绿色荧光少于红色。
（2）四乙基罗丹明(rhodamine, RB200) ：RB200为橘红色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮，性质稳定，可长期保存。
最大吸收光波长为570nm，最大发射光波长为595～600nm，呈现橘红色荧光。
（3）四甲基异硫氰酸罗丹明(tetramethyl rhodamine isothiocynate, TRITC)：TRITC为罗丹明的衍生物，呈紫红色粉末，较稳定。
最大吸收光波长为550nm，最大发射光波长为620nm，呈现橙红色荧光，与FITC的翠绿色荧光对比鲜明，可配合用于双重标记或对比染色。
因其荧光淬灭慢，也可用于单独标记染色。
（4）镧系：镧系螯合物某些3价稀土镧系元素如铕（Eu3）、铽（Tb3）、铈（Ce3）等的螯合物经激发后也可发射特征性的荧光，其中以Eu3 应用最广。
Eu3螯合物的激发光波长范围宽，发射光波长范围窄，荧光衰变时间长，最适合用于分辨荧光免疫测定。
（5）藻红蛋白（P-phycoerythrin，PE）：PE是在红藻中所发现的一种可进行光合作用的自然荧光色素，分子量为240kD的蛋白，最大吸收峰为564 nm，当使用488 nm激光激发时其发射荧光峰值约为576 nm，对于单激光器的流式细胞仪来说，推荐使用585±21nm的带通滤光片，双激光器的流式细胞仪推荐使用575±13nm的带通滤光片。
荧光染料波长查询
荧光染料波长查询
荧光染料是一种能够吸收光能并发射出更长波长的荧光的染料。
每种荧光染料都有其特定的吸收和发射波长。
以下是一些常见的荧光染料及其对应的吸收和发射波长：
1. 荧光素（Fluorescein）：
- 吸收波长：494-495 nm
- 发射波长：518-520 nm
2. 罗丹明B（Rhodamine B）：
- 吸收波长：540-550 nm
- 发射波长：565-580 nm
3. 二甲基琼脂绿（Ethidium Bromide）：
- 吸收波长：518-530 nm
- 发射波长：605-625 nm
4. 亚甲基蓝（Methylene Blue）：
- 吸收波长：600-660 nm
- 发射波长：660-740 nm
需要注意的是，荧光染料的波长可能因厂商和实验条件而略有差异。
因此，在具
体实验中，最好参考相关荧光染料的技术说明书或与供应商联系以获取准确的波长信息。
流式细胞分析中的荧光素你选择对了吗？
流式细胞分析中的荧光素你选择对了吗？流式细胞技术（flow cytometry，FCM）是利⽤流式细胞仪进⾏的⼀种单细胞定量分析和分选技术。
流式细胞术是单克隆抗体及免疫细胞化学技术、激光和电⼦计算机科学等⾼度发展及综合利⽤的⾼技术产物。
当前，流式细胞分析已成为科研发展的⼀个热点，它应⽤⼴泛，主要⽤于：1.测定细胞内 DNA 的变异系数2.DNA 倍体分析3.借助于荧光染料进⾏细胞内蛋⽩质和核酸的定量研究4.快速进⾏细胞分选和细胞收集5.医学应⽤：免疫功能研究各种⼲细胞的检测，癌症病⼈的多药耐药性，细胞功能及代谢动⼒学研究，⾎⼩板分析（⼼⾎管疾病），流式细胞术与分⼦⽣物学研究6.应⽤于外周⾎内⽪细胞测定、调节性 T 细胞等尖端领域流式技术借助于荧光染料进⾏细胞内蛋⽩质和核酸的定量研究，正是科研中所应⽤的重要技术之⼀。
⽽荧光素则⾸当其冲成为科研⼈员荧光标记研究的选择。
常⽤的荧光素及其特性1.藻红蛋⽩（PE）R-PE/B-PE：是⽤于⽣物学检测的超灵敏荧光染料。
它们⽐传统的有机荧光团灵敏度⾼ 100 倍。
其标记的抗体适⽤于所有配备 488nm 氩离⼦激光器的流式细胞仪；PE的最⼤发射波长为 575nm，在流式细胞仪的 FL2 通道检测。
产品货号 Cat#25562.PE-TexasRedPE-Texas Red 是流式细胞仪中常⽤的的试剂。
是由 PE 和 TexasRed（TR）组合⽽成的 Tandem 荧光素。
其主要吸收峰位于 565nm，发射峰位于 600nm。
其标记的抗体适⽤于所有配备 488nm 氩离⼦激光器的流式细胞仪；PE-TR 的最⼤发射波长为615nm，在流式细胞仪的 FL3 通道检测。
产品货号 Cat#26193.碘化丙啶（PI）碘化丙啶（PI）属于与溴化⼄锭相同的化学类别。
与溴化⼄锭的情况⼀样，其与荧光结合后的荧光增强 20-30 倍。
荧光激发最⼤值红移 30-40nm，荧光发射最⼤蓝移15nm 左右。
常用荧光探针小结
-
11
DAPI (magenta) bound to the minor groove of DNA (green and blue).
DAPI can be used for fixed cell staining, the concentration of DAPI needed for live cell staining is generally very high and rarely used for live cells. Though it was not shown to have mutagenicity to E. coli, it is labelled as a known mutagen in manufacturer information. As it is a DNA binding compound it is likely to have some low level mutagenic properties and care should be taken in its handling and disposal.
-
1
Exitation λmax: 495 nm; Emission λmax: 519 nm; Solvent pH:8.00
-
2
Immunocytochemistry/Immunofluorescence-alpha Tubulin antibody [DM1A] (FITC) (ab64503)
ac413230010rb200也称丽丝胺罗丹明b无定形褐红色粉末不溶于水易溶于酒精和丙酮性质稳定可长期保存最大吸收光谱为570nm呈明亮的橙色荧光因与fitc的黄绿色有明显区别故被广泛用于对比染色或用于两种不同颜色的荧光抗体的双重染色
常见荧光染料及用途
常见荧光染料及用途《常见荧光染料及用途》荧光染料是一种能够吸收可见光或紫外光，并在吸收能量的激发下发射可见光的化学物质。
它们的应用非常广泛，涵盖了许多领域，例如生物医学、材料科学、环境监测等。
以下介绍几种常见的荧光染料及其主要用途。
1. 墨水蓝(BR)：墨水蓝是一种具有强烈蓝色荧光的染料，常用于生物实验中的DNA染色。
它与DNA结合后能发出强烈的荧光信号，从而在实验中方便地观察和分析DNA的存在和定位。
2. 罗丹明B(RhB)：罗丹明B是一种红色荧光染料，广泛用于组织切片和细胞染色。
它能够与细胞核和胞浆中的核酸结合，以显示细胞和组织的结构，帮助科研人员研究细胞分裂和组织结构变化。
3. 草酸罗丹明G(OG)：草酸罗丹明G是一种绿色荧光染料，主要应用于蛋白质和核酸的定量分析。
在分光光度计中配合荧光检测器使用，可以精确测定溶液中蛋白质和核酸的浓度。
4. 罗丹明110(Rh110)：罗丹明110是一种黄绿色荧光染料，常用于细胞活性检测。
通过与细胞内的酶或细胞膜结合，罗丹明110可以用来评估细胞的活力和存活情况，特别适用于细胞毒性测试和细胞增殖研究。
5. 荧光素(FITC)：荧光素是一种与生物相容性极高的荧光染料，常用于免疫染色和分子生物学实验。
它能与抗体特异性结合，在免疫组化和流式细胞术中用于检测蛋白质的表达以及细胞表面标记。
以上只是常见的荧光染料中的几种，它们的应用还远不止于此。
随着科学技术的不断进步，新型的荧光染料不断问世，为各个领域的研究提供了更多更有力的工具。
通过荧光染料的运用，科学家们能够更好地理解和研究生物、物质和环境，进一步推动科学的发展。
干货满满！荧光染料大总结！
干货满满！荧光染料大总结！荧光显微镜技术的基本原理是借助荧光剂让细胞成分呈现高度具体的可视化效果，比如在目的蛋白后面连一个通用的荧光蛋白—GFP。
在组织样本中，目的基因无法进行克隆，则需要用免疫荧光染色等其他技术手段来观察目的蛋白。
为此，就需要利用抗体，这些抗体连接各种不同的荧光染料，直接或间接地与相应的靶结构相结合。
此外，借助荧光染料，荧光显微镜技术不只局限于蛋白质，它还可以对核酸、聚糖等其他结构进行染色，即便钙离子等非生物物质也可以检测出来。
本文就对几种常用的荧光剂进行了具体的介绍。
免疫荧光 (IF)在荧光显微镜技术中，可以通过两种方式观察到你的目的蛋白：利用内源荧光信号，即通过克隆手段，用遗传学方法将荧光蛋白与目的蛋白相连；或利用荧光标记的抗体特异性结合目的蛋白。
有些生物学问题采用第二种方法会更有用或更有必要。
比如，组织学样品无法使用荧光蛋白，因为通常来说，标本都是从无法保存荧光蛋白的生物体中获取。
此外，当有一个有功能的抗体可用时，免疫荧光法会比荧光蛋白技术快很多，因为后者必须先克隆目的基因再将DNA转染到适当的细胞中。
荧光蛋白的另一项劣势在于其本身属于蛋白质。
因此，细胞内的这些荧光蛋白具有特定的蛋白质特性，其会导致附着的目的蛋白质发生功能紊乱或出现误释的情况。
然而，荧光蛋白技术仍然是观察活细胞的首选方法。
免疫荧光法利用了抗体可以和相应抗原特异性结合的这个特性，对此它还有两种不同的表现形式。
最简单的方式是使用可与目的蛋白相结合的荧光标记抗体。
这种方法被称为“直接免疫荧光法”。
在很多情况下，我们可以利用两种不同特性的抗体。
第一种抗体可以结合目的蛋白，但其本身并未进行荧光标记（一抗）。
第二种抗体本身就携带荧光染料（二抗），并且可以特异性结合一抗。
这种方法被称为“间接免疫荧光法”。
这种方法存在诸多优势。
一方面，它会产生放大效应，因为不只一个二抗可以与一抗相结合。
另一方面，没有必要始终用荧光染料标记目的蛋白的每个抗体，但可以使用市售荧光标记的二抗。
【源版】免疫荧光细胞化学技术
一、荧光的特征
分子都含有电子，电子在不停地运动着。根据量子理论，运 动着的电子可以处于一系列不连续的能量状态中，电子遵守一定的规则， 要以从一个能级向另一能级跃迁，并伴随着与能级差相对应的特定能量 的吸收或释放。
激发: 当电子吸收能量跃迁到较高能
级，这个过程叫激发。
发射: 以辐射方式跃迁时，能量转化
一个IgG分子最多能标记15-20个FITC分子
最大吸收光谱：490～495nm， 最大发射光谱：520～530nm。 分子量：389.4KD
(2)四乙基罗达明(RB200)
褐红色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮，性质稳定，可长期保存。呈 明亮橙红色荧光。RB200在五氯化磷(PCl5)作用下转变成磺酰氯，在碱性 条件下易与蛋白质的赖氨酸一氨基反应结合而标记在蛋白分子上。
(1)原理：当FITC在碱性溶液中与抗体反应时，主要是抗体分子上的赖 氨酸-氨基与FITC上硫碳胺键结合，一个IgG分子中有86个赖氨酸残基， 一般最多能结合15～20个。
荧光素FITC-N＝C ＋ N-蛋白质→ FITC- N – C – N - 蛋白质
‖
‖
S HH
HS H
(2)操作流程 抗体与荧光素比例为50-100:1
最大吸收光谱:570nm 最大发射光谱:596～600nm 分子量：580KD
(3)四甲基异硫氰酸罗达明(TMRITC) 紫红色粉末，罗达明的衍生物，易溶于水，性质较稳定。呈橙红色荧 光，与FITC的黄绿色荧光对比清晰，与蛋白质结合方式同FITC。它可 用于双标记示踪研究。
最大吸收光谱:550nm
（5）结果
荧光显微镜下观察，呈现黄绿色荧光部分为阳性细胞。
2 间接法
（1）基本原理 先用未标记特异性抗原与细胞或组织内抗体反应，再用此 抗原的特异性荧光抗体与结合在细胞内抗体上的抗原相结合，抗原夹在细胞 抗体与荧光抗体之间，故称夹心法。
主要荧光素一览表
主要荧光素一览表(总4页)--本页仅作为文档封面，使用时请直接删除即可----内页可以根据需求调整合适字体及大小--（1）荧光素类Fluorescein标准荧光素（Reference standard）之一,在其基础上进行结构改造,可产生一系列荧光素衍生物。
Fluorescein适用于Argon-ion Laser的488nm光谱线，有相对高的荧光吸收，较好的荧光产率以及良好的水溶性。
标记蛋白时通常不会产生蛋白沉淀。
与其他荧光素类衍生物一样，Fluorescein具有光淬灭率高，pH敏感性强与发射波谱宽的缺点。
主要应用于聚焦激光扫描微阵列（Confocal laser scanning microscopy）和流式细胞计应用（Flow cytometry）。
FITC异硫氰酸荧光素，Fluorescein isothiocyanate，是荧光素衍生物的一种，5-FITC较6-FITC更经常使用。
FITC的异硫氰酸基能与氨基反应，可用于标记氨基修饰DNA，一旦形成，产物极为稳定。
适用于Argon-ion Laser的488nm光谱线，Abs/Em=492/519nm（pH=）。
与蛋白的结合力也强。
FITC 具有荧光素衍生物的普遍特性。
在水中易变坏，不能长久保存。
FITC-Oligo 广泛用于杂交探针；FITC-多肽用于Edman降解蛋白测序；FITC也经常被用于蛋白电泳检测（即使是毛细管电泳）和荧光能量激发转移测试。
FAM羧基荧光素，Carboxyfluorescein，是荧光素衍生物的一种，5-FAM较6-FAM更经常使用。
Carboxyfluorescein-5-succimidyl ester，即5-FAM（NHS）广泛存在于荧光标记试剂盒。
与FITC相比，FAM与氨基反应更快，产物也更稳定，但FITC结合蛋白的量更大且进程更易于控制。
FAM也适用于Argon-ion Laser的488nm光谱线，Abs/Em=492/518nm（pH=），具有荧光素衍生物的普遍特性，在水中稳定。
流式配色及分析
如想要鉴定到th中的细胞因子，则必须对其进行“开源”与“节流”。
精选2021版课件
47
胞内因子的含量与检测效果
如想要鉴定到th中的细胞因子，则必须对其进行“开源”与“节流”。
开源：刺激活化T细胞。方法有二：
1:PMA（PHA/LPS...)＋Ionomycin: PMA能自由透过细胞膜，因此能绕过细胞膜受体直接激活PKC; Ionomycin则能使细胞膜外Ca2+进入膜内增加，导致细胞内游离钙浓度升高； 只有PMA+Ionomycin联合应用才是使T细胞进入细胞周期的最有效的方法.
流式配色分析及实验设计
精选2021版课件
1
关于流式抗体
什么是荧光素
fitc pe
✓ 荧光素是具有荧光特性的染料 ✓ 只在特定波长激光照射后才发出自身荧光 ✓ 发出的精选荧20光21版颜课件色（波长）也是固定的 2
流式细胞技术：
在细胞分子水平上； 通过单克隆抗体； 对单个细胞或其他生物粒子； 进行多参数； 快速的； 定量分析。
红3
Pe-cy7
远红 4
Apc(AF647,ef660) 红 5
Apc-cy7(ApcH7,ef780)
远红 6
可以也仅可以最多选择8个荧光抗体去标 记抗原；
需要注意： 同一通道不可以选2种荧光抗体，例如： AF488，BB515,FITC 不可以同时使用；
精选2021版课件
19
染料的亮度与抗原表达强度相匹配
Tertiary: 低水平表达，激活性marker，或者表达区 分不明显
Example: CD25
CD4 CD45RA
CD25
几种常见荧光素极其特性介绍
几种常见荧光素极其特性介绍荧光素（英语：Fluorescein，又称为荧光黄）是一种合成有机化合物，它是具有光致荧光特性的染料，外观为暗橙色/红色粉末，可溶于乙醇，微溶于水，在蓝光或紫外线照射下，发出绿色荧光。
荧光染料种类很多，目前常用于标记抗体的荧光素有以下几种：异硫氰酸荧光素，四乙基罗丹明，四甲基异硫氰酸罗丹明，酶作用后产生荧光的物质。
目前荧光素广发应用在免疫荧光、免疫荧光染色实验中。
下面介绍几种常用荧光素及其基本生物学特性：1、异硫氰酸荧光素，简称“FITC”。
是一种小分子荧光素，其效率取决于于溶液的pH值，因此，在使用FITC时应注意溶液的酸碱度。
FITC分子量为389.4，最大吸收光波长为490～495nm，最大发射光波长为520～530nm，呈现明亮的黄绿色荧光。
FITC在冷暗干燥处可保存多年，是目前应用最广泛的荧光素。
其主要优点是人眼对黄绿色较为敏感，通常切片标本中的绿色荧光少于红色。
2、藻红蛋白，简称“PE”。
相对分子质量较大，约为240kD，最大吸收峰为564nm，当使用488nm激光激发时其发射荧光峰值约为576nm，故可能会对其它大探针产生空间位阻。
但PE的化学结构非常稳定，有很高的荧光效率，并易与抗体分子结合。
需要注意的是PE作为天然染料，因来源不同可能造成荧光素结构上的微小差别，导致其特征的不一致。
3、PI和EB。
两者都具有嵌入到双链DNA和RNA的碱基对中并与碱基对结合的特异性。
为了获得特异的DNA分布，染色前必须用RNA酶处理细胞，排除双链RNA的干扰。
PI和EB不能进入完整的细胞膜，因此，又可以用于检测死活细胞。
PI和EB各种理化性质相似，但PI比EB的发射光光谱峰向长波方向移动，因而在做DNA和蛋白质双参数测量时，PI的红色荧光和FITC的绿色荧光更易于区分和测量。
另外，PI比EB测得的DNA分布的变异系统（CV值）低，所以PI得到更广泛的应用。
4、其它荧光素单激光束三色荧光分析时，要求单激光激发，所选择的三种荧光素的发射光波长应该有所不同。
【高中生物】荧光抗体的制备
【高中生物】荧光抗体的制备（一）免疫球蛋白的提取（二）荧光素1．荧光色素的基本条件（1）具有化学活性基团，如异硫氰基（-ncs）等，易与免疫球蛋白结合形成共价键。
（2）对免疫球蛋白无毒性，不影响抗体活性。
（3）荧光效应高，与蛋白结合需要量少。
（4）荧光素性能平衡，结合物性能平衡，难储藏。
（5）结合物的颜色必须与背景组织有良好的反衬作用，易于观察判定。
至目前为止，基本合乎上述建议的荧光素只有异硫氰酸荧光素（fitc），丽丝胺罗丹明b200（rb200）。
2．常用的荧光色素（1）异硫氰酸荧光素：又称异硫氰酸荧光徐，纯品为橙黄色粉末。
棕斑结晶型与粉末型两种,结晶型荧光强度小、平衡、强于粉末型。
分子式c21h11o2n5、分子量389，溶水，易溶于ph8-9.5碳酸盐缓冲液中。
最小稀释波长为495nm。
最小升空波长520nm。
异硫氰酸荧光徐性质平衡，于低温下可以留存二年以上，但久置标记抗体能力强，荧光亮度高，故应使用新产品。
异硫氰酸荧光素借助异硫氰基与蛋白中氨基酸（主要是赖氨酸）的氨基结合。
一个igg分子有86个氨基酸残基，一般最多能标记16～20个荧光素分子。
（2）丽丝胺罗丹明：为褐色粉末，不溶水、易溶于酒精和丙酮。
荧光为桔红色。
性质平衡，可以长期留存。
分子式c23h29o7nas2，分子量为580，最小稀释波长570nm，最小升空波长为600nm。
由于丽丝胺罗丹明荧光效能较低，一般不单独使用，多用于与fitc标记抗体的反衬染色或双标记配合使用。
此染料不能直接与蛋白质结合，必须先用五氯化磷（pcl5）处理，使染料的-so3na基变为-so3cl基后，才能在碱性条件下与赖氨酸的氨基结合，形成稳定的硫氨键。
（三）标记方法异硫氰酸荧光素常用的标记法有以下两种：1．烘烤法（1）取一定量的纯igg液，用0.5mol/lph9.5碳酸盐缓冲液稀释至20mg/ml。
（2）按荧光素与蛋白质比1?20～1?100（通常用1?100）称取异硫氰酸荧光素，用ph9.5碳酸盐缓冲液熔化。
星锋生物-荧光染料总表
/product3.asp
2010-4-7
Cy 7-N-羟基琥珀酰亚胺酯
Dihydrorhodamine 123 二氢罗丹明123 Dihydrorhodamine 123 *5 mM solution in DMSO* 二氢罗丹明123（5 mM DMSO溶液） DAPI [4,6-Diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride] 4,6-联脒-2-
28718-90-3 苯基吲哚二盐酸盐
C16H15N5 · 2HCl
/product3.asp
Байду номын сангаас
2010-4-7
星锋生物，专业的生化试剂供应商
页码，2/2
PI [Propidium iodide] 碘化丙啶 Hoechst 33258 荧光染料33258
25535-16-4 23491-45-4
Hoechst 33342 荧光染料33342
BAPTA, AM 胞内钙荧光探针BAPTA, AM BAPTA, tetrapotassium salt BAPTA四钾盐 BAPTA, tetrasodium salt BAPTA四钠盐
Fluo-3, AM 钙荧光探针Fluo-3, AM
23491-52-3 126150-97-8
SYBR Green II RNA *10,000X concentrate in DMSO* SYBR Green II 172827-25-7
RNA胶体染料（10,000×DMSO溶液）
5(6)-FAM [5-(and-6)-Carboxyfluorescein] *Mixed isomers* 5(6)-羧 72088-94-9
基荧光素（混合物）
花菁染料CY3CY5CY7标记D-葡萄糖胭脂红黄豆苷葛根素半乳糖
花菁染料CY3CY5CY7标记D-葡萄糖胭脂红黄豆苷葛根素半乳糖常见的荧光染料有异硫氰酸荧光素(FITC)、罗丹明，可用的非磺化的花菁染料包括Cy3，Cy3.5，Cy5，Cy5.5，Cy7，和Cy7.5。
Cy (Cyanine) 系列, 也叫菁染料，即花青素系列荧光染料是具有多聚次甲基桥链化学结构特点的一类合成荧光染料。
Cy染料的次甲基桥链(1-7个次甲基)两端常常连着两个氮原子，其中一个氮原子带正电，从而Cy染料形成具有离域正电荷效应的介离子化合物。
因为这个结构特点，Cy染料的消光系数(extinction coefficient)非常高。
桥链长度和两端的发色团直接控制着染料的吸收峰和发射峰值，从而让Cy系列染料可以覆盖从紫外到远红外的几乎所有常用荧光谱带。
Cy3 (Cyanine 3) 是一种发橘黄色荧光的花青素荧光染料。
Cy3染料的激发峰和发射峰分别在550 nm和570 nm左右，它的荧光肉眼观察很明亮，并且对pH不敏感，在共聚焦显微镜中可以用532nm(肩峰)或者556nm(顶峰)的激光束激发，在普通荧光显微镜中可以用TRITC (tetramethylrhodamine) 的滤片观察，所以在绝大部分荧光仪器上都可以使用。
Cy3也是Dil等细胞电位追踪剂的母核，所以它是在生物技术中非常有用的荧光染料。
在荧光成像时，Cy3的背景荧光一般认为比TAMRA等TRITC系列的染料低。
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荧光(荧光显微镜和荧光分光光度计)
7 荧光分光光度计
荧光分光光度计工作原理： 由光源氙狐灯发出的光通过切光器使其变成断续之光以及激发 光单色器变成单色光后，此光即为荧光物质的激发光，被测的荧光 物质在激发光照射下所发出的荧光，经过单色器变成单色荧光后照 射于测样品用的光电倍增管上，由其所发生的光电流经过放大器放 大输至记录仪，激发光单色器和荧光单色器的光栅均由电动机带动 的凸轮所控制，当测绘荧光发射光谱时，将激发光单色器的光栅， 固定在最适当的激发光波长处，而让荧光单色器凸轮转动，将各波 长的荧光强度讯号输出至记录仪上，所记录的光谱即发射光谱 （emission spectrum），简称荧光光谱。
药物筛选 荧光探针分布是利用信号传导中信号分子的迁移功能，将一 荧光蛋白与信号分子相偶联，根据荧光蛋白的分布情况即可推断 信号分子的迁移状况，并推断该分子在迁移中的功能。由于GFP 分子量小，在活细胞内可溶且对细胞毒性较小，因而常用作荧光 探针 。
标记的蛋白质进行细胞内的活体观察
（3） 荧光原位杂交 原位杂交技术(In situ hybridization，ISH)是用标记的核 酸探针，经放射自显影或非放射检测体系，在组织，细胞、间期 核及染色体上对核酸进行定位和相对定量研究的一种手段。
荧光技术
韩东洺 细胞生物学科 2014-11-5
2015年6月15日
1 荧光和荧光素 利用较短波长的光(激发光)照射样品，使样品 受到高能量激发，产生较长波长的荧光(发射光)， 用来观察和分辨样品中产生荧光的物质的成分和位 置。
2 常见荧光素：
（1）异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)
6 使用荧光显微镜的注意事项
（1）严格按照荧光显微镜出厂说明书要求进行操作，不要随意改 变程序。 （2）应在暗室中进行检查。进入暗室后，接上电源，点燃超高压 汞灯5～15min，待光源发出强光稳定后，眼睛完全适应暗 室，再开始观察标本。 （3）防止紫外线对眼睛的损害，在调整光源时应戴上防护眼镜。 （4）检查时间每次以1～2h为宜，超过90min，超高压汞灯发光强 度逐渐下降，荧光减弱；标本受紫外线照射3～5min后，荧光 也明显减弱；所以，最多不得超过2～3h。
医学免疫学：免疫荧光标记技术之荧光抗体制备
标记时间 18h
ห้องสมุดไป่ตู้4h
1～2h
pH值：在标记过程中，pH对标记有很大的影响。 pH高反应快，偏低标记慢。pH大于10蛋白质易 变性，pH大于11荧光猝灭，一般pH以9±0.5合适。
FITC和蛋白质的比例：FITC和蛋白质的浓度应按 照一定的比例，一般质量比在1：100左右。
原理
荧光素和蛋白质抗体的结合：在碱性条件下，FITC的异 硫氰基在水溶液中与免疫球蛋白的自由氨基经碳酰胺化而 形成硫碳氨基键，使荧光素和蛋白质结合。
一个IgG分子有86个氨基酸残基，最多能标记15-20个荧 光素。
主要的试剂和器材
FITC 20mg/ml IgG溶液 0.005M pH7.0磷酸缓冲液、 0.5M pH9.5 碳酸
值过高，易出现非特异性反应。
注意事项
影响荧光素的因素： A：由于荧光素易受到紫外线的激发而猝灭，所
以应注意避光。 B：某些化学物质（如I-、Br-、氨基苯等）的
激发可使荧光很快的猝灭，因而要避免与以上化 学物质接触。
标记的温度和时间：在搅拌法时，应选择适当的 温度和时间。
标记温度 0～4 ℃ 7～9 ℃ 20～25 ℃
盐缓冲液 Sephadex G-25、层析柱 磁力搅拌器、称量瓶
实验步骤
精确称取FITC 2mg至称量瓶中，加入1ml 0.5M pH9.5 碳酸盐缓冲液溶解，在磁力搅拌器上不断 搅拌。（已完成）
将20mg/ml IgG溶液10ml置于另一称量瓶中，于 磁力搅拌器上搅拌，保持20℃，逐渐滴加入FITC 溶液。随即以pH试纸测试，用0.1M 碳酸钠溶液 调节，保持pH值在9.5左右。加盖，减少与空气 的接触，连续搅拌1h。（已完成）
标记抗体的提纯：取pH7.0 0.005M磷酸盐缓冲液 平衡sephadex G-25，将标记好的IgG 0.5ml上柱， 以pH7.0 0.005M磷酸盐缓冲液洗脱，并收集。
探针荧光素颜色
荧光标记二抗的选择-FITC/Rhodamine/Texas Red/Cy/PE/AMCA点击次数：2701 发布时间：2010-5-5荧光标记二抗的选择-FITC/Rhodamine/Texas Red/Cy/PE/AMCA一般来讲，耦联到二抗上的探针主要有酶(辣根过氧化酶HRP和碱性磷酸酶AP或其衍生物APAAP，PAP)，荧光基团(FITC, RRX, TR, PE, Rhodamine)和生物素。
选用哪种探针的二抗主要取决于具体的实验。
对于Western Blot和ELISA，最常用的二抗是酶标二抗；而细胞或组织标记实验(细胞免疫化学，组织免疫化学，流式细胞术)中通常使用荧光标记的二抗。
如果想要更大程度的放大检测信号，可以使用Biotin/A vidin检测系统。
其中荧光素是具有光致荧光特性的染料，荧光染料种类很多，目前常用于荧光标记二抗有以下几种：【异硫氰酸荧光素-Fluorescein Isothiocyanate (FITC)荧光标记二抗】FITC纯品为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水和酒精溶剂。
FITC分子量为389.4，最大吸收光波长为490～495nm，最大发射光波长为520～530nm，呈现明亮的黄绿色荧光。
FITC 在冷暗干燥处可保存多年，是目前应用最广泛的荧光素。
由于FITC是小分子化合物，每一个抗体可标记几个FITC分子，IgM通常用小分子的荧光素标记，如FITC、Cy3/5、Texas Red 等。
FITC荧光二抗主要优点是人眼对黄绿色较为敏感，通常切片标本中的绿色荧光少于红色。
然而FITC的最大缺点是淬灭快，因此要和抗淬灭剂一起使用。
【四甲基异硫氰酸罗丹明-Tetramethyl Rhodamin Isothiocyanate(TRITC)，Rhodamine Red-X(RRX), Texas Red(TR)荧光标记二抗】这些罗丹明的衍生物耦联基团具有不同的吸收波长(550, 570, 596nm)和最大发射波长(570, 590, 620nm)。
荧光染料的分类与介绍
荧光染料分类荧光染料是在荧光剂的帮助下对细胞成分进行高度特异性的可视化。
可以是一种荧光蛋白、例如 GFP在基因上与感兴趣的蛋白质相关联。
接下来，新研博美的小编带大家了解一下我们公司荧光染料的分类。
一、花菁染料1、Cyanines（Cyanine dyes花菁染料）花青素（Cyanines）是在两个具有离域电荷的氮原子之间含有聚甲炔桥的分子：花青素（Cyanines）染料主要用于通过光学方法监测细胞、细胞器和囊泡中的膜电位差。
用于通过光学方法监测细胞、细胞器和囊泡中的膜电位差。
这些对电位敏感的染料在分子结构、电荷和通过膜的渗透性方面有所不同。
根据染料的不同，涉及到与膜的电位依赖性结合以及二聚体和更高聚集体的形成。
花菁染料有两种：非磺化花菁和磺化花菁。
对于许多应用，它们是可互换的，因为它们的光谱特性几乎相同。
磺化和非磺化染料均可用于标记生物分子，例如DNA和蛋白质。
染料之间的区别在于它们的溶解度：硫化染料是水溶性的，并且它们在水性环境中不使用有机助溶剂进行标记。
它们不易在水中聚集。
在某些情况下，需要使用一种类型的花菁。
非磺化花菁染料Cyanine3 NHS esterCyanine3.5 carboxylic acidCyanine5 azideCyanine5.5 hydrazideCyanine7 amineCyanine7.5 tetrazine磺化花菁染料sulfo-Cyanine3 DBCOSulfo-Cyanine3.5 alkyneSulfo-Cyanine5 NHS esterSulfo-Cyanine5.5 azideSulfo-Cyanine7 maleimideSulfo-Cyanine7.5 carboxylic acid2、ICG吲哚菁绿Indocyanine Green，ICG，吲哚菁绿CAS:3599-32-4是一种三碳菁染料，具有良好的水溶性，分子量为775，吲哚菁绿完全可以在血浆和全血液中几乎完全与血浆蛋白结合，可以保证其几乎完全留在血管中，不易向外扩散，因此被作为一种常用的血管造影剂使用。
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（1）荧光素类
Flｕoｒescein
标准荧光素(Refｅrence standａrd)之一,在其基础上进行结构改造,可产生一系列荧光素衍生物。
Ｆluoｒesceｉｎ适用于Argon-ioｎ Laser的４8８nm光谱线,有相对高的荧光吸收,较好的荧光产率以及良好的水溶性。
标记蛋白时通常不会产生蛋白沉淀。
与其他荧光素类衍生物一样，Fluｏreｓceiｎ具有光淬灭率高，pH敏感性强与发射波谱宽的缺点。
ﻫ主要应用于聚焦激光扫描微阵列(Ｃonfocal laｓeｒｓcanｎｉnｇ micｒｏｓｃopｙ）和流式细胞计应用(Floｗ cytomeｔry）。
ＦITＣﻫ异硫氰酸荧光素,Flｕoreｓcｅｉn ｉsoｔｈiocyanate，是荧光素衍生物的一种，5-ＦITC较６-FITC更经常使用。
ﻫFＩＴC的异硫氰酸基能与氨基反应,可用于标记氨基修饰DＮA,一旦形成，产物极为稳定。
适用于Arｇoｎ-ioｎ Laｓeｒ的488nｍ光谱线,Abs/Em=492/519nm(pH=９.0）。
与蛋白的结合力也强。
ﻫ FITＣ具有荧光素衍生物的普遍特性。
在水中易变坏,不能长久保存。
ﻫFＩTC－Oliｇo 广泛用于杂交探针;FＩＴＣ-多肽用于Edｍan降解蛋白测序；FIＴＣ也经常被用于蛋白电泳检测（即使是毛细管电泳）和荧光能量激发转移测试。
ＦAＭﻫ羧基荧光素,Caｒbｏxyfｌｕoresｃeiｎ，是荧光素衍生物的一种，5-ＦAＭ较６-FAM更经常使用。
ﻫCaｒｂoｘyｆluｏresｃｅｉn－5-sｕccｉｍidyl ｅstｅｒ，即5－FAＭ(NHS)广泛存在于荧光标记试剂盒。
与FＩTC相比,FAM与氨基反应更快,产物也更稳定,但FITC结合蛋白的量更大且进程更易于控制。
FAM也适用于Aｒgoｎ－iｏn Lasｅr的488ｎm光谱线,Aｂs/Ｅm=４92／518nm（ｐH＝9.0），具有荧光素衍生物的普遍特性,在水中稳定。
5－FAM主要应用于DNA自动测序中,标记其中的ｄ／ｄdCTP（PＥ公司),也经常用于ＰCR产物定量,核酸探针等。
ＴETﻫ四氯荧光素,Tetｒaｃhloｒo flｕoresｃeiｎ，是荧光素衍生物的一种。
ＴＥT以及HＥＸ均是在FＡM基础上加以改进的，氯原子使ＦAＭ的Aｂs与Eｍ值都产生一定的红移，并在一定程度上减弱了pＨ敏感性。
TEＴ也适用于Ａrgｏn-iｏn Laser激发光源，Abｓ/Em=５2１／5３６nm 。
ＴET,HＥX，ＦAM和TAMＲA可配合用于DNＡ自动测序中，其中TET用于标记ｄ/ddATＰ,HEX用于标记
ﻫHEXﻫ六氯荧光素,Hｅxachｌｏro fluoreｓcein,是荧光素衍生d／ddGTP或ｄ/ddAＴP(PE公司）ﻫ
物的一种。
适用于Argon－ioｎＬaser激发光源,Abs/Em=53５/５56ｎm。
（请参见TＥT介绍）ﻫ
JOＥﻫ羧基-4',5'-二氯-２',7'-二甲氧基荧光素,Ｃaｒbｏｘy-4＇，5'-dｉchlｏro－2＇，7＇-dimｅthｏｘyfｌuorescein,是荧光素衍生物的一种,6-JOE更被广泛使用。
ﻫＪOE荧光产量高,ｐＨ敏感性
弱,适合于标记蛋白。
６-JOE也适合于Aｒｇoｎ-ion Laseｒ激发光源，Ａｂs/Em＝520/548（pH=9.0)ﻫ常用于ＤNA自动测序，标记d/ddAＴP，也经常被用于进行电泳检测与PCR产物定量。
（2）罗丹明类（Ｒｈodaminｅ dye）
R 1１０ﻫ标准荧光素(Referencｅ standaｒｄ)之一,在其基础上进行结构改造,即可产生一系列罗丹明类衍生物。
与Fluoｒescein类衍生物相比,罗丹明类荧光素具有更强的光稳定性，更高的荧光产量以及更低的ｐＨ敏感性
罗丹明类荧光素极为适合于标记寡核甘酸，但蛋白会引起大多数罗丹明类荧光素的荧光淬灭,故大多数不适宜用于标记蛋白。
ﻫR11０被用于DNA自动测序。
TＡMRAﻫ全称羧基四甲基罗丹明，即Cａｒbｏxytetraｍethylrhodａｍine,是罗丹明类荧光素衍生物，6－ TＡＭＲA被广泛使用。
TAMRＡ是少数几个能用于标记蛋白的，6－ TＡMRＡ适用于Aｒgon-iｏn Laser激发光源,Aｂs/Em=547／573ｎm(Ph＝８.０），6－ＴＡMRＡ（NHS）常用于荧光标记试剂盒中。
6－ TAMRＡ主要用于DＮA自动测序中。
Texas Reｄ
Ｔexas Red是一个长波长荧光素,与Fｌｕoresｃｅｉn几乎没有波谱重叠,只适合于Ａｒ-Kr Lａser的5６8nm光谱线或He-Ne Lａser的５９４光谱线,比Tｅtｒaｍethｙlｒhodamｉｎe和LissamineＴM Rh ｏｄaｍine B波长更长,荧光量更高。
ＴeｘaｓＲed在荧光微阵列和流式细胞计中更被经常作为第三波长标记(Thｉｒｄ labｅlｓ)。
（3)ＢODIＰＹ类
BＯDＩPY类荧光素是由分子探针公司开发,以用来替代那些有部分缺陷的传统荧光素，普遍具有荧光产量高,ｐH敏感性低（无离子变化）,光稳定性强以及发射波谱窄的优点,故ＢＯＤＩPY类荧光素已被广泛用于核酸,,脂肪酸，磷脂以及各种受体。
同时，由于在电泳过程中对序列片段影响小,故已被逐渐用于DNA自动测序。
但相对而言, BOＤIPY类荧光素并不特别适合标记蛋白.ﻫ BＯDＩＰＹ FL可代替FlｕoｒｅｓｃeinﻫBODIPY R6Ｇ可代替Rｈodamine ６G
BODＩＰＹTMR可代替Teｔraｍethｙｌrhodamine
BODIPY ＴR可代替Texａs Red
这些BＯDＩPY类荧光素具有与被替代物几乎类似的光谱特征，能共用同样的光过滤器与激发光源,但更具优点。
（4）其他荧光素
Caｓcade blue
Cａsｃaｄe bluｅ是在芘 (pｙrenｅ)结构基础上改造得来的，即suｌfoｎatｅd pyrｅｎe,它是一种
短波长紫外激发荧光素,与另一种常用的紫外荧光素Aｍiｎocoｕｍaｒin相比,Cａscａｄｅｂlue的Em 与Ｆｌuorescein有更小的光谱重叠，有更高的荧光吸收和更大的荧光产量. Ｃaｓcａｄe ｂlue在376nm 处存在第二个吸收峰，水中不稳定。
ﻫ Cascade blｕe 主要用于标记蛋白,作为极性示踪子（ｐolar tra ｃer)可进行膜蛋白定位等.但也能用于标记核酸和葡聚糖。
Amiｎｏcoumariｎ
一种短波长紫外激发荧光素，通常使用的是７-amｉｎo－4-ｍeｔｈylcｏｕmarin, 红移现象明显,比Ｃａscaｄe ｂｌue有更长的发射波长，肉眼观察明显，更适用于cｏnfocal。
表1：主要荧光激发光源
表2:主要荧光素一览表。