分子生物学常用技术.ppt
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分子生物学技术ppt课件
• 核酸研究中的应用十分广泛。
探针技术
• 探针是经过特殊标记的核酸片段，具有特定的 序列，能够与待测的核酸片段互补结合，因此 可用于检测核酸样品中的基因。
• 标记物：同位素、生物素或荧光染 Nhomakorabea • 核酸片段：人工合成、克隆的基因组DNA、
cDNA、RNA • 探针种类：DNA、RNA
印迹技术(Blotting): 将在凝胶中分离的 生物大分子转移(印迹)在固相化介质上 并加以检测分析的技术。
(1) DNA 印迹: Southern blotting (2) RNA 印迹: Northern blotting (3) 蛋白质印迹: Western blotting
印迹技术基本原理
凝胶电泳
转移
杂交
放射自显影 或化学显色
Southern blotting（DNA印迹技术）
组织或细胞中基因组DNA经限制性内切酶消 化后进行琼脂糖凝胶电泳，将含有DNA区带的凝 胶放入变性溶液变性后，使胶中的DNA分子转移 到NC膜上。转移完成后，加热使DNA固定于NC膜 上，用于杂交反应可进行DNA印渍。
三个步骤为一个循环。新合成的DNA分子作 为下一轮合成的模板，经多次循环（25～30次） 后即可达到扩增DNA片段的目的。
PCR的主要用途
目的基因的克隆 为重组DNA获得目的基因提供了简便快速的方法
基因的体外突变 利用PCR技术可以随意设计引物在体外进行基因 的嵌合、缺失、点突变等改造。
DNA和RNA的微量分析 一滴血液、一根毛发或一个细胞已足以满足PCR 的检测需要。
DNA序列分析 基因突变分析
PCR衍生技术
反转录PCR技术
mRNA反转录生成cDNA, cDNA 为模板PCR扩增
探针技术
• 探针是经过特殊标记的核酸片段，具有特定的 序列，能够与待测的核酸片段互补结合，因此 可用于检测核酸样品中的基因。
• 标记物：同位素、生物素或荧光染 Nhomakorabea • 核酸片段：人工合成、克隆的基因组DNA、
cDNA、RNA • 探针种类：DNA、RNA
印迹技术(Blotting): 将在凝胶中分离的 生物大分子转移(印迹)在固相化介质上 并加以检测分析的技术。
(1) DNA 印迹: Southern blotting (2) RNA 印迹: Northern blotting (3) 蛋白质印迹: Western blotting
印迹技术基本原理
凝胶电泳
转移
杂交
放射自显影 或化学显色
Southern blotting（DNA印迹技术）
组织或细胞中基因组DNA经限制性内切酶消 化后进行琼脂糖凝胶电泳，将含有DNA区带的凝 胶放入变性溶液变性后，使胶中的DNA分子转移 到NC膜上。转移完成后，加热使DNA固定于NC膜 上，用于杂交反应可进行DNA印渍。
三个步骤为一个循环。新合成的DNA分子作 为下一轮合成的模板，经多次循环（25～30次） 后即可达到扩增DNA片段的目的。
PCR的主要用途
目的基因的克隆 为重组DNA获得目的基因提供了简便快速的方法
基因的体外突变 利用PCR技术可以随意设计引物在体外进行基因 的嵌合、缺失、点突变等改造。
DNA和RNA的微量分析 一滴血液、一根毛发或一个细胞已足以满足PCR 的检测需要。
DNA序列分析 基因突变分析
PCR衍生技术
反转录PCR技术
mRNA反转录生成cDNA, cDNA 为模板PCR扩增
分子生物学ppt课件完整版
肿瘤标志物
寻找和验证肿瘤特异性标志物，用于肿瘤的早期诊断、预后评估和 个性化治疗。
肿瘤免疫治疗
利用分子生物学技术，研究和开发肿瘤免疫治疗策略，如CAR-T细胞 疗法等。
免疫学中的分子生物学应用
免疫相关基因
研究免疫相关基因的突变、表达和调控，揭示免疫应答和免疫疾 病的分子机制。
疫苗研发
利用分子生物学技术，研究和开发新型疫苗，如mRNA疫苗、 DNA疫苗等。
03
DNA修复机制
当DNA受到损伤时，细胞会启动修复机制对损伤进行修复。常见的修
复方式包括直接修复、切除修复和重组修复等。这些修复机制能够确保
遗传信息的稳定性和准确性。
03
RNA的结构与功能
RNA的分子组成
核糖核苷酸
RNA的基本组成单位是核 糖核苷酸，由磷酸、核糖 和碱基组成。
碱基
RNA中的碱基主要有腺嘌 呤（A）、鸟嘌呤（G）、 胞嘧啶（C）和尿嘧啶（U ）。
基因诊断与治疗
基因诊断
通过检测特定基因或基因突变来 预测或诊断疾病，如遗传性疾病
、癌症等。
基因治疗
通过修改或替换病变基因来治疗 疾病，如基因编辑技术CRISPR-
Cas9等。
个性化医疗
基于患者的基因组信息，制定个 性化的治疗方案，提高治疗效果
和减少副作用。
肿瘤分子生物学研究
肿瘤基因
研究肿瘤相关基因的突变、表达和调控，揭示肿瘤发生和发展的分 子机制。
分子生物学ppt课 件完整版
目 录
• 分子生物学概述 • DNA的结构与功能 • RNA的结构与功能 • 基因的表达与调控 • 分子生物学技术与方法 • 分子生物学在医学领域的应用
01
分子生物学概述
寻找和验证肿瘤特异性标志物，用于肿瘤的早期诊断、预后评估和 个性化治疗。
肿瘤免疫治疗
利用分子生物学技术，研究和开发肿瘤免疫治疗策略，如CAR-T细胞 疗法等。
免疫学中的分子生物学应用
免疫相关基因
研究免疫相关基因的突变、表达和调控，揭示免疫应答和免疫疾 病的分子机制。
疫苗研发
利用分子生物学技术，研究和开发新型疫苗，如mRNA疫苗、 DNA疫苗等。
03
DNA修复机制
当DNA受到损伤时，细胞会启动修复机制对损伤进行修复。常见的修
复方式包括直接修复、切除修复和重组修复等。这些修复机制能够确保
遗传信息的稳定性和准确性。
03
RNA的结构与功能
RNA的分子组成
核糖核苷酸
RNA的基本组成单位是核 糖核苷酸，由磷酸、核糖 和碱基组成。
碱基
RNA中的碱基主要有腺嘌 呤（A）、鸟嘌呤（G）、 胞嘧啶（C）和尿嘧啶（U ）。
基因诊断与治疗
基因诊断
通过检测特定基因或基因突变来 预测或诊断疾病，如遗传性疾病
、癌症等。
基因治疗
通过修改或替换病变基因来治疗 疾病，如基因编辑技术CRISPR-
Cas9等。
个性化医疗
基于患者的基因组信息，制定个 性化的治疗方案，提高治疗效果
和减少副作用。
肿瘤分子生物学研究
肿瘤基因
研究肿瘤相关基因的突变、表达和调控，揭示肿瘤发生和发展的分 子机制。
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目 录
• 分子生物学概述 • DNA的结构与功能 • RNA的结构与功能 • 基因的表达与调控 • 分子生物学技术与方法 • 分子生物学在医学领域的应用
01
分子生物学概述
分子生物学ppt课件
基因组大小(Mb)
0.58 1.83 4.20 4.60 13.50 12.50 466 165 97 2700 3000
基因数
470 1743 4100 4288 6034 4929 30000 13601 18424 30000 25000
染色体数*
无 无 无 无 16 16 21 4 6 20 23
包括：
结构基因组学
功能基因组学
三个亚领域.
比较基因组学
28
29
一、病毒基因组 二、原核生物基因组 三、真核生物基因组
30
一、病毒基因组
基因组（genome） 1个配（精子或卵子），1个单倍 体细胞或1个病毒所包含的全套遗传物质的总和。病毒核酸 或为DNA或为RNA，可以统称为病毒染色体。
完整的病毒颗粒具有蛋白质外壳，以保护病毒核酸不 受核酸酶的破坏，并能识别和侵袭特定的宿主。
分子生物学
Molecular Biology
1
What is Molecular Biology?
分子生物学是从分子水平研究生命现象、生命规律和生命本质 的学科。
核心内容是从分子水平研究基因和基因的活动，这些活动主要 通过核酸和蛋白质的活动来实现。
医学分子生物学主要研究人体生物大分子和大分子体系的结构、 功能、相互作用及其与疾病发生、发展的关系。
16
三、基因的结构特点和分类
基因的结构
结构基因：编码区序列（coding region sequence ）
在细胞内表达为蛋白质或功能RNA的DNA序列
转录调控序列：非编码序列（non-coding sequence）
基因表达需要的调控区（regulatory region）序列， 包括启动子（promoter）、增强子（enhancer）等。
分子生物学常用技术(简化版)
Northern blot
类似于 Southern 印迹杂交的方法，用于 RNA 检测
in situ hybridization
原位杂交：特定 mRNA 的组织细胞分布
FISH Fluorescence in situ hybridization (FISH)：特定基因的染色体定位
反 Northern 杂交与 DNA 芯片
DNA解旋解链
DNA的体内复制
ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC
5’
3’
TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
3’
5’
GGAUCG
5’
AUCGCG
5’
引物酶
引物酶
RNA引物
RNA引物
DNA解旋解链
引物合成
DNA的体内复制
ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC
核酸：测序、印迹、杂交、体外扩增技术 蛋白质：电泳与印迹、组学技术、相互作用
基本技术：
基因工程技术 转基因生物与基因敲除技术
综合技术：
基因诊断 基因治疗
应用技术：
第一节：核酸分子杂交
Molecular hybridization: 利用已知核酸序列 (探针/probe) 检测与其互补的未知核酸序列 用途： 确认核酸序列间同源性 对特定核酸序列进行定量 自核酸混合体中辨认特定核酸序列
1.什么是耐热 DNA 聚合酶
早期 PCR 曾使用 DNA 聚合酶 I
在高温时发生变性，每一循环都需要重新添加酶 延伸反应温度为 37℃，非特异性太多
目前常用 Taq DNA 聚合酶
纯化自嗜热水生菌 (Thermus aquaticus) 可耐受 95℃ 高温，最适反应温度为 72℃ 左右
分子生物学常用技术共35张-2024鲜版
•分子生物学概述•基因克隆技术•核酸测序技术•蛋白质组学技术•基因表达调控研究技术•细胞信号传导途径研究技术•生物信息学在分子生物学中应用contents目录01分子生物学概述分子生物学定义与发展分子生物学定义发展历程包括基因的结构、功能、表达调控以及基因组的结构、功能与进化等。
基因与基因组研究DNA 复制、转录与翻译蛋白质组学基因表达调控研究DNA 的复制、转录和翻译过程及其调控机制，揭示遗传信息在细胞内的传递和表达规律。
研究细胞内所有蛋白质的表达、功能及其相互作用，揭示蛋白质在生命活动中的作用机制和调控规律。
研究基因表达的时空特异性及其调控机制，包括转录因子、表观遗传学修饰等。
分子生物学研究内容分子生物学与生物技术关系生物技术定义生物技术是以生命科学为基础，利用生物（或生物组织、细胞及其他组成部分）的特性和功能，设计、构建具有预期性能的新物质或新品系，以及与工程原理和技术相结合进行社会生产或为社会服务的一种综合性技术。
分子生物学对生物技术的影响分子生物学的发展为生物技术提供了重要的理论基础和技术支持，推动了基因工程、细胞工程、发酵工程等生物技术的飞速发展。
同时，生物技术的发展也反过来促进了分子生物学的深入研究，为揭示生命现象的本质和规律提供了有力手段。
02基因克隆技术步骤目的基因的获取载体的选择与构建030201重组DNA分子的构建将目的基因与载体连接，形成重组DNA分子。
重组DNA分子的转化将重组DNA分子导入受体细胞，如细菌、酵母或哺乳动物细胞等。
转化细胞的筛选与鉴定通过选择性培养基或PCR等方法筛选含有重组DNA分子的细胞，并进行鉴定。
0102载体选择构建策略添加启动子和终止子添加选择性标记优化载体结构030405载体选择与构建策略重组DNA转化与筛选方法转化方法筛选方法03核酸测序技术1. DNA模板制备2. 引物设计3. 测序反应4. 产物纯化015. 变性凝胶电泳026. 放射自显影031 2 3NGS技术原理NGS技术特点NGS技术应用第二代测序技术（NGS）简介第三代测序技术（TGS）展望TGS技术原理TGS技术特点TGS 技术应用前景04蛋白质组学技术蛋白质组学概念及研究内容蛋白质组学概念研究内容层析法利用不同物质在固定相和流动相之间分配系数的差异进行分离，如凝胶层析、离子交换层析等。
分子生物学原理--基因工程ppt课件
分子生物学原理
整合
• 整合： 噬菌体感染大肠杆菌的第一步
噬菌体粘附于细胞壁上，将自身的 DNA注入菌体中。 此 DNA可与细菌染色 体重组，成为细菌染色体的一部分。
• 溶原菌：整合了噬菌体基因组的细菌。
• 裂解： 噬菌体感染大肠杆菌的第二步
DNA利用菌体的酶系统，复制自身及 外壳蛋白，组装成大量新 噬菌体，并将 细菌涨破。
第十四章 基因重组与基因工程
10/28/2024
分子生物学原理
基因重组：genomic recombination 重组DNA：recombinant DNA
10/28/2024
分子生物学原理
第一节、自然界的基因重组
• 转化：transformation • 整合：integration • 转导：transduction • 转位：transposition
10/28/2024
分子生物学原理
转位
• 转位：一个或一组基因从一处转到基因 组的另一个位置。
• 这些游动的基因称为转位子(transposon)。
10/28/2024
分子生物学原理
转 位
10/28/2024
分子生物学原理
第二节、基因工程
• 基因工程：是用分离纯化或人工合成的 DNA在体外与载体DNA结合，成为重组 DNA，用以转化宿主，筛选出能表达重 组DNA的活细胞，加以纯化、传代、扩 增，成为克隆。也叫基因克隆或重组 DNA技术。
切割后与原来载体比较。
• 利用核酸杂交和放射自显影进行鉴定：用目 的基因作探针监测宿主DNA是否重组体。
10/28/2024
分子生物学原理
DNA重组体的筛选与鉴定
•灭 活法筛 选重组 体。
分子生物学全套课件(2024)
2024/1/26
17
蛋白质在细胞中的作用
蛋白质可以作为酶催化生物体内 的化学反应，维持生命活动的正 常进行。
蛋白质可以作为载体运输物质， 如血红蛋白运输氧气和二氧化碳 。
蛋白质可以作为抗体参与免疫反 应，保护机体免受病原体的侵害 。
蛋白质是细胞结构和功能的基础 ，参与细胞的各种生命活动，如 催化、运输、免疫、调节等。
2024/1/26
21
基因表达调控的分子机制
DNA结合蛋白的作用
识别并结合特定DNA序列，影响基因转录。
染色质结构与基因表达
染色质结构的变化可影响基因的可及性和转 录活性。
2024/1/26
信号转导与基因表达调控
细胞外信号通过信号转导途径影响基因表达 。
转录后调控机制
包括mRNA剪接、转运、定位和降解等过程 对基因表达的调控。
比较基因组学分析
通过比较不同物种或不同个体之间的基因组差异，揭示物种进化、基 因功能等生物学问题。
生物信息学在基因组学中的应用
利用生物信息学方法对基因组数据进行挖掘和分析，发现新的基因、 突变位点以及与疾病相关的遗传变异等。
27
THANK YOU
感谢观看
2024/1/26
28
2024/1/26
8
DNA的复制与修复
01
02
03
DNA复制的过程
起始、延伸和终止三个阶 段，涉及多种蛋白质和酶 的参与。
2024/1/26
DNA复制的特点
半保留复制、半不连续复 制等。
DNA修复的机制
直接修复、切除修复、重 组修复和SOS修复等，用 于纠正复制过程中产生的 错误。
9
DNA的转录与表达
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▪ 答疑：1.10 (9:00-11:30; 3:00-5:30) ▪ 地点：逸夫楼3楼生化实验室
三、探针(probe)
▪ 探针的概念 ▪ 探针的类型 ▪ 标记物的种类 ▪ 标记方法
1. 探针的概念
▪ 特异结合和检测靶分子的活性物质
– 抗原－抗体 – 配体－受体 – 同源DNA/RNA
杂交条件
▪ 靶分子 ▪ 探针 ▪ 杂交袋 ▪ 杂交炉
杂交种类
▪ 被检核酸种类和方法
– 原位杂交 – 斑点杂交 – Southern杂交 – Northern杂交 – Western杂交
▪ 反应介质
– 液相杂交 – 固相杂交(✓)
二、固相支持物
▪ 固相支持物的特性
– 结合能力强 – 不影响杂交反应 – 结合牢固 – 非特异性吸附少 – 机械性能良好
琼脂糖凝胶电泳
二、聚丙烯酰胺凝胶电泳
(polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE)
▪ 分离原理 ▪ 操作要点 ▪ 优点 ▪ 应用范围
（一）分离原理
▪ 电荷效应 ▪ 分子筛效应
PAGE支持物
▪ 单体－丙烯酰胺(Acr) ▪ 交联剂－甲叉双丙烯酰胺(Bis) ▪ 催化剂－过硫酸胺(AP) ▪ 加 速 剂 － N,N,N’,N’- 四 甲 基 乙 二 胺
2. 尼龙膜
▪ 特点
– 结合能力强 – 可反复杂交 – 韧性强 – 适于电转移印迹法 – 对DNA小片段(10bp)结合能力强
▪ 不足
– 杂交信号本底较高
分子生物学考试
▪ 时间：2005.1.11(晚7:00-9:00) ▪ 地点
– 9教讲演厅 (150人) – 9-2-1 (50人) – 9-2-2 (50人) – 9-3-1 (50人)
固相支持物的种类
▪ 硝酸纤维素滤膜 (nitrocellulose filter membrane)
▪ 尼龙膜(nylon membrane)
1.硝酸纤维素滤膜
▪ 特点
– 吸附ssDNA和RNA – 杂交信号本底低
▪ 不足
– 不适于重复杂交 – 滤膜较脆 – 不适于电转移印迹法 – 对DNA小片段(<200bp)结合能力弱
▪ 电泳的用途
– 分离 – 鉴定纯度 – 测定分子量
▪ 凝胶电泳的种类
– 琼脂糖凝胶电泳 – 聚丙烯酰胺凝胶电泳
一、琼脂糖凝胶电泳
(agarose gel electrophoresis)
▪ 分离核酸原理 ▪ 操作要点 ▪ 应用范围
（一）分离核酸原理
▪ 电荷效应 ▪ 分子筛效应 ▪ 分子构象
1. 电荷效应
试剂
制备浓度(%)
(ml) 3.5 5.0 8.0 12 20
30%Acr 11.6 16.6 26.6 40.0 66.6
ddH2O 67.7 62.7 52.7 39.3 12.7 5XTBE 20.0 20.0 20.0 20.0 20.0
10%AP 0.7 0.7 0.7 0.7 0.7
TEMED
1. 支持物
商品化的琼脂糖
琼脂糖种类
普通 低熔点 高纯 高筛分
熔点 80~90℃ <70℃ 80~90℃ 80~90℃
机械强度 中
差
高
高
分辨率 中
差
中
高
2. 凝胶浓度的选择
凝胶的制备
3. DNA marker
DNA marker
DNA 长度标准曲线
4. 电泳缓冲液
▪ Tris-乙酸(TAE)pH 8.0 ▪ Tris-硼酸(TBE) pH 8.0 ▪ Tris-磷酸(TPE) pH 8.0
(TEMED)
聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶
（二）操作要点
▪ 凝胶的分类 ▪ 凝胶浓度的选择 ▪ 凝胶液的配制 ▪ 凝胶中DNA的检测 ▪ DNA片段的回收
1. 凝胶的分类
▪ 非变性凝胶：dsDNA ▪ 变性凝胶: ssDNA
– 尿素 – 甲酰胺 – SDS
2. 凝胶浓度的选择
3. 凝胶液的配制
35ul/100ml
PAGE装置
电泳
4. 凝胶中DNA的检测
▪ 溴乙锭染色法 ▪ 银盐染色法 Ag+－DNA 甲醛
还原 ▪ 放射自显影法
Ag（黑褐色）
5.DNA片段的回收
▪ 压碎浸泡法
– <1kb – 纯度高，回收率低
（三）PAGE优点
▪ 机械强度好、化学稳定性高 ▪ 分辨率高 ▪ 载样量大 ▪ 回收的DNA纯度高
第十七章
分子生物 学常用技
术
分子生物学常用技术
▪ 凝胶电泳 ▪ 分子杂交 ▪ 聚合酶链反应(PCR)技术 ▪ DNA的物理图谱 ▪ DNA序列测定 ▪ 基因芯片
第一节 凝胶电泳
(gel electrophoresis)
▪ 电泳概念 ▪ 基本原理
Q μ＝
6πrη
μ: 迁移率
Q : 电荷量
r : 粒子半径（分子量） η: 介质粘度
（四）PAGE应用范围
▪ 分离、纯化和鉴定RNA和小分子DNA ▪ DNA序列分析 ▪ PCR产物鉴定 ▪ 蛋白质的检测和分析
第二节 分子杂交
▪ 分子杂交的基本原理 ▪ 固相支持物 ▪ 探针 ▪ 几种常用杂交技术
一、分子杂交的基本原理
▪ 核酸的变性和复性
分 子 杂 交
DNA-DNA
DNA-RNA
5. 样品制备
▪ 上样缓冲液
– 50%甘油/蔗糖 – 0.5%溴酚蓝/二甲苯青
点样
6.电泳条件
▪ 潜水电泳 ▪ 恒压电泳
– 低压: 1~2V/cm – 中压: 8~10V/cm – 高压电泳：>几十V/cm
▪ 温度：15~25℃
潜水电泳
7.电泳染色
▪ 溴乙锭(ethidium bromide, EB) ▪ 结构及染色原理 ▪ 染色方法
▪ 核酸是两性电解质
▪ pH = 3.5 ,
正电荷
▪ pH = 8.0~8.3 , 负电荷，正极
2.分子筛效应
▪ 小分子移动快 ，大分子移动慢
3. 分子构象
-
+
▪ 闭环超螺旋>线状DNA>开环DNA
（二）操作要点
▪ 支持物 ▪ 凝胶浓度的选择 ▪ DNA分子量标准 ▪ 电泳缓冲液 ▪ 样品制备 ▪ 电泳条件 ▪ DNA电泳染色 ▪ DNA片段的回收
– 加入凝胶液中 – 电泳结束后染色
EB染色原理
紫外灯下显色
8. DNA片段的回收
▪ 低熔点琼脂糖法 ▪ 透析袋电洗脱法(>5kb) ▪ DEAE-纤维素膜法(0.5~5kb)
（三）应用范围
▪ DNA的分离、纯化和鉴定
– 限制性酶切图谱分析 – 重组体的分离、鉴定 – 杂交分析 – PCR产物的分离鉴定
三、探针(probe)
▪ 探针的概念 ▪ 探针的类型 ▪ 标记物的种类 ▪ 标记方法
1. 探针的概念
▪ 特异结合和检测靶分子的活性物质
– 抗原－抗体 – 配体－受体 – 同源DNA/RNA
杂交条件
▪ 靶分子 ▪ 探针 ▪ 杂交袋 ▪ 杂交炉
杂交种类
▪ 被检核酸种类和方法
– 原位杂交 – 斑点杂交 – Southern杂交 – Northern杂交 – Western杂交
▪ 反应介质
– 液相杂交 – 固相杂交(✓)
二、固相支持物
▪ 固相支持物的特性
– 结合能力强 – 不影响杂交反应 – 结合牢固 – 非特异性吸附少 – 机械性能良好
琼脂糖凝胶电泳
二、聚丙烯酰胺凝胶电泳
(polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE)
▪ 分离原理 ▪ 操作要点 ▪ 优点 ▪ 应用范围
（一）分离原理
▪ 电荷效应 ▪ 分子筛效应
PAGE支持物
▪ 单体－丙烯酰胺(Acr) ▪ 交联剂－甲叉双丙烯酰胺(Bis) ▪ 催化剂－过硫酸胺(AP) ▪ 加 速 剂 － N,N,N’,N’- 四 甲 基 乙 二 胺
2. 尼龙膜
▪ 特点
– 结合能力强 – 可反复杂交 – 韧性强 – 适于电转移印迹法 – 对DNA小片段(10bp)结合能力强
▪ 不足
– 杂交信号本底较高
分子生物学考试
▪ 时间：2005.1.11(晚7:00-9:00) ▪ 地点
– 9教讲演厅 (150人) – 9-2-1 (50人) – 9-2-2 (50人) – 9-3-1 (50人)
固相支持物的种类
▪ 硝酸纤维素滤膜 (nitrocellulose filter membrane)
▪ 尼龙膜(nylon membrane)
1.硝酸纤维素滤膜
▪ 特点
– 吸附ssDNA和RNA – 杂交信号本底低
▪ 不足
– 不适于重复杂交 – 滤膜较脆 – 不适于电转移印迹法 – 对DNA小片段(<200bp)结合能力弱
▪ 电泳的用途
– 分离 – 鉴定纯度 – 测定分子量
▪ 凝胶电泳的种类
– 琼脂糖凝胶电泳 – 聚丙烯酰胺凝胶电泳
一、琼脂糖凝胶电泳
(agarose gel electrophoresis)
▪ 分离核酸原理 ▪ 操作要点 ▪ 应用范围
（一）分离核酸原理
▪ 电荷效应 ▪ 分子筛效应 ▪ 分子构象
1. 电荷效应
试剂
制备浓度(%)
(ml) 3.5 5.0 8.0 12 20
30%Acr 11.6 16.6 26.6 40.0 66.6
ddH2O 67.7 62.7 52.7 39.3 12.7 5XTBE 20.0 20.0 20.0 20.0 20.0
10%AP 0.7 0.7 0.7 0.7 0.7
TEMED
1. 支持物
商品化的琼脂糖
琼脂糖种类
普通 低熔点 高纯 高筛分
熔点 80~90℃ <70℃ 80~90℃ 80~90℃
机械强度 中
差
高
高
分辨率 中
差
中
高
2. 凝胶浓度的选择
凝胶的制备
3. DNA marker
DNA marker
DNA 长度标准曲线
4. 电泳缓冲液
▪ Tris-乙酸(TAE)pH 8.0 ▪ Tris-硼酸(TBE) pH 8.0 ▪ Tris-磷酸(TPE) pH 8.0
(TEMED)
聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶
（二）操作要点
▪ 凝胶的分类 ▪ 凝胶浓度的选择 ▪ 凝胶液的配制 ▪ 凝胶中DNA的检测 ▪ DNA片段的回收
1. 凝胶的分类
▪ 非变性凝胶：dsDNA ▪ 变性凝胶: ssDNA
– 尿素 – 甲酰胺 – SDS
2. 凝胶浓度的选择
3. 凝胶液的配制
35ul/100ml
PAGE装置
电泳
4. 凝胶中DNA的检测
▪ 溴乙锭染色法 ▪ 银盐染色法 Ag+－DNA 甲醛
还原 ▪ 放射自显影法
Ag（黑褐色）
5.DNA片段的回收
▪ 压碎浸泡法
– <1kb – 纯度高，回收率低
（三）PAGE优点
▪ 机械强度好、化学稳定性高 ▪ 分辨率高 ▪ 载样量大 ▪ 回收的DNA纯度高
第十七章
分子生物 学常用技
术
分子生物学常用技术
▪ 凝胶电泳 ▪ 分子杂交 ▪ 聚合酶链反应(PCR)技术 ▪ DNA的物理图谱 ▪ DNA序列测定 ▪ 基因芯片
第一节 凝胶电泳
(gel electrophoresis)
▪ 电泳概念 ▪ 基本原理
Q μ＝
6πrη
μ: 迁移率
Q : 电荷量
r : 粒子半径（分子量） η: 介质粘度
（四）PAGE应用范围
▪ 分离、纯化和鉴定RNA和小分子DNA ▪ DNA序列分析 ▪ PCR产物鉴定 ▪ 蛋白质的检测和分析
第二节 分子杂交
▪ 分子杂交的基本原理 ▪ 固相支持物 ▪ 探针 ▪ 几种常用杂交技术
一、分子杂交的基本原理
▪ 核酸的变性和复性
分 子 杂 交
DNA-DNA
DNA-RNA
5. 样品制备
▪ 上样缓冲液
– 50%甘油/蔗糖 – 0.5%溴酚蓝/二甲苯青
点样
6.电泳条件
▪ 潜水电泳 ▪ 恒压电泳
– 低压: 1~2V/cm – 中压: 8~10V/cm – 高压电泳：>几十V/cm
▪ 温度：15~25℃
潜水电泳
7.电泳染色
▪ 溴乙锭(ethidium bromide, EB) ▪ 结构及染色原理 ▪ 染色方法
▪ 核酸是两性电解质
▪ pH = 3.5 ,
正电荷
▪ pH = 8.0~8.3 , 负电荷，正极
2.分子筛效应
▪ 小分子移动快 ，大分子移动慢
3. 分子构象
-
+
▪ 闭环超螺旋>线状DNA>开环DNA
（二）操作要点
▪ 支持物 ▪ 凝胶浓度的选择 ▪ DNA分子量标准 ▪ 电泳缓冲液 ▪ 样品制备 ▪ 电泳条件 ▪ DNA电泳染色 ▪ DNA片段的回收
– 加入凝胶液中 – 电泳结束后染色
EB染色原理
紫外灯下显色
8. DNA片段的回收
▪ 低熔点琼脂糖法 ▪ 透析袋电洗脱法(>5kb) ▪ DEAE-纤维素膜法(0.5~5kb)
（三）应用范围
▪ DNA的分离、纯化和鉴定
– 限制性酶切图谱分析 – 重组体的分离、鉴定 – 杂交分析 – PCR产物的分离鉴定