实验三 重组质粒DNA转化大肠杆菌.ppt
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将重组质粒转化进受体细菌时，需诱导受体细菌产生一 种短暂的感受态以摄取外源DNA。大肠杆菌细胞经过一些特 殊方法（电击法、 CaCl2等化学试剂法）的处理后，细胞膜 的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进 入的细胞即感受态细胞(Competent cells)。
转化(Transformation)
是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状 的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域 的基本实验技术。
0.1mol/L CaCl2是一种低渗溶液，在0℃低温处理大肠杆菌细 胞时，细胞膨胀成球形，DNA可吸附在其表面。在短暂的热冲击 （如42 ℃ ）下，细胞可吸收外源DNA。
称取氨苄西林100mg溶于1mlddH2O中，0.22μm滤器过 滤除菌，用1.5ml离心管分装后储存于-20℃冰箱.
3、0.1mol/L CaCl2 溶液: 称0.56gCaCl2(无水分析纯),溶于50ml重蒸水中,定容至 100ml,用0.22μm滤器过滤除菌或高压灭菌。EP管分装于 4℃冰箱储存 .
4、暂时不用的感受态细胞可置于 -80℃保存。 注：CaCl2处理后的细胞比较脆弱，尽量温柔操作！
（三） 重组质粒DNA的转化
1. 质粒和感受态细胞混和：在100μl感受态细胞悬液中加 入5μl重组质粒DNA（ pET32a-SmPR10 ），轻轻混匀 后冰上放置30分钟。
2. 热击：42℃水浴中热击60秒（注：精确计算时间，热 击过长将对细胞造成伤害）,热击后马上置于冰上冷2-5 分钟。
Gene fragment (SmPR10)
Vector (pET-32a)
pET32a-SmPR10
材料、设备及试剂
材料
➢ E. coli DH5α菌株: R-、M-、Amp- (转化过程所用的受体细胞 一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲 基化酶的突变体(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳 定地遗传给后代。）
按配方称量药品,加入一定量的ddH2O后置电炉上加热熔解琼脂 ，待琼脂完全熔解后加入ddH2O定容至1000ml,用NaOH调节pH至 7.0。121℃湿热高压灭菌20分钟，待冷却至60℃左右,在超净工作
台中加入一定量的Amp储存液,使终浓度为100μg/ml,摇匀后用培养
皿铺板。
2、Amp母液：
3、将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于LB液体培养基中,37℃振荡培 养2-3小时至OD600 ＝0.5左右(生长对数期）。（注：这一步非常关键 。培养过度的菌液含有较多的“老”细胞，制备成感受态细胞后其接受 外援DNA能力较低，从而导致转化率降低。）
（二）、 感受态细胞的制备 ( CaCl2 法)
➢ pET32a-SmPR10质粒DNA（浓度：2 ng/μl): 实验室自制
设备 ➢ 恒温摇床；电热恒温培养箱；台式高速离心机；超净工作
台；低温冰箱；恒温水浴锅；分光光度计；微量移液枪。
试剂
1、LB固体和液体培养基
LB培养基配方：（单位g/L）
胰蛋白胨
10
酵母提取物 5
NaCl
10
Βιβλιοθήκη Baidu
琼脂粉（1.5%） 15g （注：LB液体培养基不加琼脂粉）
pET32a
多克隆位点（MCS）：外源DNA片段的插入位点
Amps菌株
pET32a
Ampr
培养基上含有X-Gal和 IPTG时，可使用蓝白 斑筛选方法鉴别真正 的重组的转化子。
涂布于含Amp的培养基上，可以生长。 次日可见白色菌落-- 转化子。
结构的三大要素： • 多克隆位点 • 选择标记（耐药性，LacZ） • 复制起始位点 种类： • 质粒 • 噬菌体 • 酵母人工染色体（YAC） • 反转录病毒载体 • 表达载体等
4、 pET32a-SmPR10质粒：实验室自制
操作步骤
（一） 受体菌的培养
1、取-70℃或-20℃贮存的大肠杆菌DH5α菌种，在LB培养液中培养过夜 ，进行活化;
2、取几微升活化后的菌液（取量视菌的密度而定）在LB平板上涂布,于 37℃培养箱中培养24h；从LB平板上挑取单菌落,接种于3-5ml LB液 体培养基中,37℃下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期。
实验三 重组质粒DNA转化大肠杆菌
实验目的
学习将重组质粒DNA导入大肠杆菌的方法 学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的方法 为下一步重组体筛选做准备
实验原理
遗传学中转化的基本含义是使细胞获得一新的可遗传的 表型性状。分子克隆中用人工的方法将重组质粒DNA导入大 肠杆菌细胞，使携带有重组质粒的大肠杆菌获得在抗生素平 板上生长的能力，从而与不携带重组质粒的的细菌区分开来 ，这个过程就是转化。
为了鉴定这些转化子，须利用质粒编码的筛选标记，这些标 记赋予细菌新的表型，是成功转化的细菌很容易被筛选出来。 pET32a质粒带有氨苄西林抗性基因（Ampr），其重组体转化的 大肠杆菌能够在含氨苄西林的培养基上生长，而未转化的受体菌 则不能再这种培养基上生长。
Ampr：氨苄西林抗性基因 – β内酰胺酶
1、将菌液转入1.5ml离心管中,冰上放置10分钟,然后于 4℃、4000rpm离心10分钟。
2、弃去上清,用预冷的0. 1mol/L的CaCl2 溶液1ml轻轻悬 浮细胞,冰上放置10分钟后,4℃、4000rpm离心10分钟 。
3、弃去上清,加入0.1ml预冷的0. 1mol/L的CaCl2 溶液,轻 轻悬浮细胞。每份100μl（注意悬液密度要均匀）,冰 上放置备用。
3. 复苏：向每管中加入800μl LB液体培养基(注：不含
Amp),混匀后在37℃150rpm轻摇培养1小时，使细菌恢
复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因
pET-32a Vector
The pET System is the most powerful system yet developed for the cloning and expression of recombinant proteins in E. coli.
pET-32 cloning/expression region
转化(Transformation)
是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状 的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域 的基本实验技术。
0.1mol/L CaCl2是一种低渗溶液，在0℃低温处理大肠杆菌细 胞时，细胞膨胀成球形，DNA可吸附在其表面。在短暂的热冲击 （如42 ℃ ）下，细胞可吸收外源DNA。
称取氨苄西林100mg溶于1mlddH2O中，0.22μm滤器过 滤除菌，用1.5ml离心管分装后储存于-20℃冰箱.
3、0.1mol/L CaCl2 溶液: 称0.56gCaCl2(无水分析纯),溶于50ml重蒸水中,定容至 100ml,用0.22μm滤器过滤除菌或高压灭菌。EP管分装于 4℃冰箱储存 .
4、暂时不用的感受态细胞可置于 -80℃保存。 注：CaCl2处理后的细胞比较脆弱，尽量温柔操作！
（三） 重组质粒DNA的转化
1. 质粒和感受态细胞混和：在100μl感受态细胞悬液中加 入5μl重组质粒DNA（ pET32a-SmPR10 ），轻轻混匀 后冰上放置30分钟。
2. 热击：42℃水浴中热击60秒（注：精确计算时间，热 击过长将对细胞造成伤害）,热击后马上置于冰上冷2-5 分钟。
Gene fragment (SmPR10)
Vector (pET-32a)
pET32a-SmPR10
材料、设备及试剂
材料
➢ E. coli DH5α菌株: R-、M-、Amp- (转化过程所用的受体细胞 一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲 基化酶的突变体(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳 定地遗传给后代。）
按配方称量药品,加入一定量的ddH2O后置电炉上加热熔解琼脂 ，待琼脂完全熔解后加入ddH2O定容至1000ml,用NaOH调节pH至 7.0。121℃湿热高压灭菌20分钟，待冷却至60℃左右,在超净工作
台中加入一定量的Amp储存液,使终浓度为100μg/ml,摇匀后用培养
皿铺板。
2、Amp母液：
3、将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于LB液体培养基中,37℃振荡培 养2-3小时至OD600 ＝0.5左右(生长对数期）。（注：这一步非常关键 。培养过度的菌液含有较多的“老”细胞，制备成感受态细胞后其接受 外援DNA能力较低，从而导致转化率降低。）
（二）、 感受态细胞的制备 ( CaCl2 法)
➢ pET32a-SmPR10质粒DNA（浓度：2 ng/μl): 实验室自制
设备 ➢ 恒温摇床；电热恒温培养箱；台式高速离心机；超净工作
台；低温冰箱；恒温水浴锅；分光光度计；微量移液枪。
试剂
1、LB固体和液体培养基
LB培养基配方：（单位g/L）
胰蛋白胨
10
酵母提取物 5
NaCl
10
Βιβλιοθήκη Baidu
琼脂粉（1.5%） 15g （注：LB液体培养基不加琼脂粉）
pET32a
多克隆位点（MCS）：外源DNA片段的插入位点
Amps菌株
pET32a
Ampr
培养基上含有X-Gal和 IPTG时，可使用蓝白 斑筛选方法鉴别真正 的重组的转化子。
涂布于含Amp的培养基上，可以生长。 次日可见白色菌落-- 转化子。
结构的三大要素： • 多克隆位点 • 选择标记（耐药性，LacZ） • 复制起始位点 种类： • 质粒 • 噬菌体 • 酵母人工染色体（YAC） • 反转录病毒载体 • 表达载体等
4、 pET32a-SmPR10质粒：实验室自制
操作步骤
（一） 受体菌的培养
1、取-70℃或-20℃贮存的大肠杆菌DH5α菌种，在LB培养液中培养过夜 ，进行活化;
2、取几微升活化后的菌液（取量视菌的密度而定）在LB平板上涂布,于 37℃培养箱中培养24h；从LB平板上挑取单菌落,接种于3-5ml LB液 体培养基中,37℃下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期。
实验三 重组质粒DNA转化大肠杆菌
实验目的
学习将重组质粒DNA导入大肠杆菌的方法 学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的方法 为下一步重组体筛选做准备
实验原理
遗传学中转化的基本含义是使细胞获得一新的可遗传的 表型性状。分子克隆中用人工的方法将重组质粒DNA导入大 肠杆菌细胞，使携带有重组质粒的大肠杆菌获得在抗生素平 板上生长的能力，从而与不携带重组质粒的的细菌区分开来 ，这个过程就是转化。
为了鉴定这些转化子，须利用质粒编码的筛选标记，这些标 记赋予细菌新的表型，是成功转化的细菌很容易被筛选出来。 pET32a质粒带有氨苄西林抗性基因（Ampr），其重组体转化的 大肠杆菌能够在含氨苄西林的培养基上生长，而未转化的受体菌 则不能再这种培养基上生长。
Ampr：氨苄西林抗性基因 – β内酰胺酶
1、将菌液转入1.5ml离心管中,冰上放置10分钟,然后于 4℃、4000rpm离心10分钟。
2、弃去上清,用预冷的0. 1mol/L的CaCl2 溶液1ml轻轻悬 浮细胞,冰上放置10分钟后,4℃、4000rpm离心10分钟 。
3、弃去上清,加入0.1ml预冷的0. 1mol/L的CaCl2 溶液,轻 轻悬浮细胞。每份100μl（注意悬液密度要均匀）,冰 上放置备用。
3. 复苏：向每管中加入800μl LB液体培养基(注：不含
Amp),混匀后在37℃150rpm轻摇培养1小时，使细菌恢
复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因
pET-32a Vector
The pET System is the most powerful system yet developed for the cloning and expression of recombinant proteins in E. coli.
pET-32 cloning/expression region