组织细胞的三维培养
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模拟在体细胞的环境：
⑴良好生长环境
⑵缺氧、缺乏营养、废物积聚或pH降低 等协同作用－－－“toxic enviroment”
[15]
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9
3、细胞的生物学特性
⑴浸润和转移：肿瘤细胞和基质共培养 （E-cadherin、 ICAM-1 ）[16,17]
⑵细胞黏附：研究细胞聚集过程中黏附 因子的作用[18]
2、非黏附物包被的培养瓶或培养皿：琼脂、 琼脂糖、蛋白聚糖、聚苯乙烯
3、支架
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6
五、研究方法
1、细胞生长及形态：体积－直径
Ki-67）
免疫组化（BrdU、PCNA、
流式细胞仪（DNA
Hoechst33342、PI）
电镜
2、细胞球的生理特性：微电极（pO2 or pH）
NMR(脂代谢)
生物体发光技术（ATP、 Lactate、glucose）
⑵当ES细胞经过2天悬滴培养、2天悬浮
培养后，可形成简单拟胚体（3－D），
拟胚体内包含着来源于三个胚层的不同
细胞
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12
微囊化肿瘤细胞用于药筛
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13
1、抗肿瘤药物筛选的研究现状
⑴多采用体外单层培养的肿瘤细胞：简单、 易操作、费用低、可大量应用、生长方 式及环境与在体肿瘤差距较大
Peak plasma concentration (ppc), the highest level of drug that can be obtained in the blood usually following multiple doses, of ADM, MC and 5-FU was 0.4 g/mL, 3.0 g/mL and 10 g/mL, respectively .
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3
二、三维培养的构成
1、辅助物：人工软骨[1]、PET聚乙烯酯[2]、 纤维蛋白支架[3]、胶原支架[4-5]、旋转生 物反应器[6]、微胶囊[7]、中空纤维[8]
2、细胞：原代组织细胞－大鼠肝、软骨、 脂肪[9]、成骨样细胞、干细胞[10]、 肿瘤 细胞[11]
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三、三维培养的特点
1、生长特点：三维结构、异质性、生长速 率及氧气、葡萄糖等梯度分布
2、组织学特点：细胞分三层（直径>300µm） 可有类似组织基质的物质产生
3、生长动力学：三维培养细胞以G1/G0期 细胞占优势，S期细胞较少
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四、三维培养的方法
1、旋转式培养：旋转细胞培养系统或培养 瓶，旋转生物反应器同时产生较多量直 径为1－2mm的细胞球
⑵动物实验：费用高、生存条件苛刻、生 长方式及环境与在体相似
⑶手术切除标本：回顾性研究、不能动态 观察
⑷体外三维培养：模拟肿瘤生长方式及环 境、可大量应用、费用较低，如MCTS
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肿瘤细胞在体与体外三维生长示意图
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wenku.baidu.com
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2、微囊化细胞三维共培养特点
⑴微胶囊为半透膜 ⑵细胞呈三维立体生长 ⑶生长空间可控 ⑷空间相对封闭 ⑸“被动”共培养 ⑹实质与间质细胞共培养-模拟体内
⑶血管形成： VEGF（血管内皮生长因 子）在恶性肿瘤血管形成中起主要作用
[19]
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10
4、实验性组织模型
移植物以组织或器官的方式培养，使 其在一定时间内保持原有功能
简单的讲：使细胞自发或借助人工基 质聚集并诱导细胞分化、维持细胞功能
举例：人工肝（肝细胞、纤维细胞等 与明胶海绵、琼脂、胶原共培养）[20-22]
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11
5、胚体干细胞与拟胚体
⑴胚胎发育到囊胚期，此时细胞分化为 两大类，即位于周边的滋养层细胞和位 于腔内但居于一端的内细胞团（inner cell mass ICM）。只有ICM将来发育成 胚胎本身，把ICM从胚胎中分离出来在一 定条件下培养，可形成具有无限增殖能 力的细胞群，称为胚胎干细胞 （embryonic stem cells,ES细胞）
*
*
0.1ppc
1ppc
Drug concentration
b
10ppc
23
Inhibition Rate (%) Inhibition Rate (%)
100
*
M-MC 72 h
90
M-ADM 72 h
80
M-5-FU 72 h
*
70
60
50
*
40
30
20
10
0.1ppc
1ppc
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3、微囊化肿瘤细胞的三维培养
⑴材料：海藻酸钠，聚赖氨酸，人乳腺癌 细胞系MCF-7
⑵方法：静电液滴法
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Day 0
Day 2
Day 5
Day 7
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18
4、药物对三维生长细胞的抑制
⑴药物：丝裂霉素（MC）、阿霉素（ADM）、 5－氟尿嘧啶（5－FU）
⑵浓度和作用时间：0.1ppc,1ppc及10ppc
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*
72
22
Inhibition Rate (%) Inhibition Rate (%)
100
95
90
85
80
75
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*
65
60
55 24
S 10 ppc M10 ppc *
48
Time (h)
a
*
72
100 80 60 40 20 0 -20 -40
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*
M 72 h
S 72 h
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六、三维培养的应用
1、实验性治疗
⑴放射效应[12]：分化程度影响放疗效 果
⑵药物耐受[13]：培养方式是决定耐药 的因素之一
⑶免疫疗法[14]：肿瘤细胞与免疫细胞 作用
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2、代谢及代谢环境研究
三维培养的细胞可模拟肿瘤生成中的无 血管阶段、微转移灶或毛细血管之间的 微区域
分别作用24h, 48h, 72h
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a
f
b
g
c
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h
20
d
i
e
j
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Diameter of cells spheroid(10－6m)
140 130 120 110 100
90 0
* *
control 0.1ppc 1 ppc 10 ppc
24
48
Time (h)
Seminar Ⅱ
组织细胞的三维培养
学生：张旭朗 导师：马小军 研究员 2005－5－18
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1
• 概念 • 三维培养的构成 • 三维培养的特点 • 三维培养的方法 • 研究方法 • 三维培养的应用 • 展望
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2
一、三维培养的概念
• 相对于单层细胞的二维培养而言，利用 各种方法及材料，使细胞呈空间立体方 式生长，形成类似体内组织的结构，发 挥其功能
⑴良好生长环境
⑵缺氧、缺乏营养、废物积聚或pH降低 等协同作用－－－“toxic enviroment”
[15]
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3、细胞的生物学特性
⑴浸润和转移：肿瘤细胞和基质共培养 （E-cadherin、 ICAM-1 ）[16,17]
⑵细胞黏附：研究细胞聚集过程中黏附 因子的作用[18]
2、非黏附物包被的培养瓶或培养皿：琼脂、 琼脂糖、蛋白聚糖、聚苯乙烯
3、支架
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五、研究方法
1、细胞生长及形态：体积－直径
Ki-67）
免疫组化（BrdU、PCNA、
流式细胞仪（DNA
Hoechst33342、PI）
电镜
2、细胞球的生理特性：微电极（pO2 or pH）
NMR(脂代谢)
生物体发光技术（ATP、 Lactate、glucose）
⑵当ES细胞经过2天悬滴培养、2天悬浮
培养后，可形成简单拟胚体（3－D），
拟胚体内包含着来源于三个胚层的不同
细胞
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微囊化肿瘤细胞用于药筛
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1、抗肿瘤药物筛选的研究现状
⑴多采用体外单层培养的肿瘤细胞：简单、 易操作、费用低、可大量应用、生长方 式及环境与在体肿瘤差距较大
Peak plasma concentration (ppc), the highest level of drug that can be obtained in the blood usually following multiple doses, of ADM, MC and 5-FU was 0.4 g/mL, 3.0 g/mL and 10 g/mL, respectively .
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二、三维培养的构成
1、辅助物：人工软骨[1]、PET聚乙烯酯[2]、 纤维蛋白支架[3]、胶原支架[4-5]、旋转生 物反应器[6]、微胶囊[7]、中空纤维[8]
2、细胞：原代组织细胞－大鼠肝、软骨、 脂肪[9]、成骨样细胞、干细胞[10]、 肿瘤 细胞[11]
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三、三维培养的特点
1、生长特点：三维结构、异质性、生长速 率及氧气、葡萄糖等梯度分布
2、组织学特点：细胞分三层（直径>300µm） 可有类似组织基质的物质产生
3、生长动力学：三维培养细胞以G1/G0期 细胞占优势，S期细胞较少
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四、三维培养的方法
1、旋转式培养：旋转细胞培养系统或培养 瓶，旋转生物反应器同时产生较多量直 径为1－2mm的细胞球
⑵动物实验：费用高、生存条件苛刻、生 长方式及环境与在体相似
⑶手术切除标本：回顾性研究、不能动态 观察
⑷体外三维培养：模拟肿瘤生长方式及环 境、可大量应用、费用较低，如MCTS
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肿瘤细胞在体与体外三维生长示意图
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15
2、微囊化细胞三维共培养特点
⑴微胶囊为半透膜 ⑵细胞呈三维立体生长 ⑶生长空间可控 ⑷空间相对封闭 ⑸“被动”共培养 ⑹实质与间质细胞共培养-模拟体内
⑶血管形成： VEGF（血管内皮生长因 子）在恶性肿瘤血管形成中起主要作用
[19]
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4、实验性组织模型
移植物以组织或器官的方式培养，使 其在一定时间内保持原有功能
简单的讲：使细胞自发或借助人工基 质聚集并诱导细胞分化、维持细胞功能
举例：人工肝（肝细胞、纤维细胞等 与明胶海绵、琼脂、胶原共培养）[20-22]
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11
5、胚体干细胞与拟胚体
⑴胚胎发育到囊胚期，此时细胞分化为 两大类，即位于周边的滋养层细胞和位 于腔内但居于一端的内细胞团（inner cell mass ICM）。只有ICM将来发育成 胚胎本身，把ICM从胚胎中分离出来在一 定条件下培养，可形成具有无限增殖能 力的细胞群，称为胚胎干细胞 （embryonic stem cells,ES细胞）
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Drug concentration
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Inhibition Rate (%) Inhibition Rate (%)
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3、微囊化肿瘤细胞的三维培养
⑴材料：海藻酸钠，聚赖氨酸，人乳腺癌 细胞系MCF-7
⑵方法：静电液滴法
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Day 0
Day 2
Day 5
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4、药物对三维生长细胞的抑制
⑴药物：丝裂霉素（MC）、阿霉素（ADM）、 5－氟尿嘧啶（5－FU）
⑵浓度和作用时间：0.1ppc,1ppc及10ppc
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Inhibition Rate (%) Inhibition Rate (%)
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六、三维培养的应用
1、实验性治疗
⑴放射效应[12]：分化程度影响放疗效 果
⑵药物耐受[13]：培养方式是决定耐药 的因素之一
⑶免疫疗法[14]：肿瘤细胞与免疫细胞 作用
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2、代谢及代谢环境研究
三维培养的细胞可模拟肿瘤生成中的无 血管阶段、微转移灶或毛细血管之间的 微区域
分别作用24h, 48h, 72h
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Diameter of cells spheroid(10－6m)
140 130 120 110 100
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control 0.1ppc 1 ppc 10 ppc
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Time (h)
Seminar Ⅱ
组织细胞的三维培养
学生：张旭朗 导师：马小军 研究员 2005－5－18
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• 概念 • 三维培养的构成 • 三维培养的特点 • 三维培养的方法 • 研究方法 • 三维培养的应用 • 展望
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一、三维培养的概念
• 相对于单层细胞的二维培养而言，利用 各种方法及材料，使细胞呈空间立体方 式生长，形成类似体内组织的结构，发 挥其功能