刘西莉-中国农业大学农学院
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
已有的研究表明，辣椒疫霉不能自身合成甾醇类物质，但却含有部分甾醇合成相关的基因。其中ERG3基因是一类在真核生物体内相对保守的基因，其编码的C-去饱和酶能够催化甾醇在第五位C原子处形成双键，是其他真核甾醇合成的重要功能蛋白。另有异源表达的结果表明，辣椒疫霉ERG3基因可以互补酿酒酵母ERG3基因功能，但ERG3在辣椒疫霉体内的具体作用尚未明确。
中国农业大学
本科生“URP”立项申请书
项目名称辣椒疫霉CRISPR/Cas9敲除
体系的建立及ERG3基因的功能研究
申请人刘西莉
工作单位植物保护学院
联系电话62733012
电子信箱****************.cn
填表日期2016年目名称
辣椒疫霉CRISPR/Cas9敲除体系的建立及ERG3基因的功能研究
该环节主要是培养学生在分子生物学和分子遗传学方面的基本实验操作技术。
考核办法：构建目标基因的敲除载体，获得目标基因的敲除转化子。
3.对目标基因的敲除体进行功能分析。
该环节主要是培养学生在植物病理学方面的实验操作技能，包括对于辣椒疫霉各发育阶段的观察，接种和侵染过程观察以及甾醇种类和含量的研究等。
考核办法：目标基因敲除转化子突变表型的各类图片和统计数据。
甾醇又叫固醇，属于脂类物质中的三萜类。甾醇在生物体尤其在真核生物体内广泛存在。对于真核生物中的脊椎动物、植物和真菌，其甾醇研究相对比较透彻，甾醇在这三类生物体内的存在形式和合成途径有所差别：在脊椎动物体内，主要的甾醇类物质是胆固醇；在植物体内大量存在着谷甾醇、豆甾醇和菜油甾醇；而在真菌体内，麦角甾醇含量很高，并发挥着重要的作用。甾醇在不同生物体内具有激素或者保证生物膜的完整性的作用，并且可影响很多与生物膜相关的生物功能。在植物体内，具有激素作用的甾醇主要被归为芸薹属甾醇（brassicasteriods）。芸薹属甾醇主要为植物体内菜油甾醇合成途径中的一些甾醇，对于这类甾醇的研究，最初人们关注的是其在促进植物生长方面的作用，而近年的相关研究表明，其能够引起植物生长必需的多种重要反应。真核生物体内，甾醇的结构和浓度可以影响很多与生物膜相关的生物功能，如液泡的形成，蛋白质分选，内吞作用，同型膜融合，膜蛋白活性，蛋白和酯类的侧向聚集以及生物膜离子通透性等。另外，芸薹属甾醇也可以影响植物细胞伸长，细胞分裂，应激反应，膜极化，质子泵，光合作用和细胞衰老等多种生理功能。
2.本实验室有从事辣椒疫霉基因功能研究的在读研究生多名，他们可以协助申请者指导URP计划的本科生。
3.实验室具备试验所需的灭菌锅、电磁炉、微波炉、培养箱、无菌操作台、水浴锅、PCR仪、电泳仪、冰箱等硬件设施；实验室具备原生质体转化所需的菌株、质粒、试剂等。
4.本研究小组目前承担国家自然科学基金等项目，研究经费有保障。
项目起止时间
2016.4-2017.4
项目申请人情况
姓名
刘西莉
性别
女
出生日期
1969.05
最后学历与学位
博士研究生，博士
专业技术职务
教授
从事专业
植物病理学
一、项目概况
辣椒疫霉（Phytophthora capsici）属于藻界、卵菌纲、霜霉目、霜霉科、疫霉属，是一种重要的土传植物病原卵菌，在2014年Sophien Kamoun等发表的“The top 10 oomycete pathogens in molecular plant pathology”一文中，辣椒疫霉位居第五，其寄主范围广，至少可侵染茄科、葫芦科等26科的上百种寄主植物，其中包括辣椒、番茄、黄瓜、菜豆等蔬菜作物，其侵染辣椒后引起的辣椒疫病是生产中的一种毁灭性病害，严重制约了辣椒的健康生产。
四、学生提交的成果
1．项目参与同学共同提交URP结题报告1份。
2.参加该项目的每位同学需要提交完整的URP实验记录，包括相关的照片资料、数据资料、文献资料、完整的实验记录等。
3.参加该课题的每位同学需要认真阅读1篇相关的英文文献，并在本研究小组的Seminar上进行汇报。
4.在尽可能的情况下，将URP研究工作与本科阶段的科研训练和毕业论文工作结合在一起，使学生有较多的时间参与研究，URP研究论文作为毕业论文参加答辩。
卵菌与丝状真菌在形态上有很多相似的地方，目前，卵菌基因功能研究中所采用的很多方法由丝状真菌中借鉴而来。但由于卵菌的营养生产阶段为二倍体，其同源重组率显著低于真菌，很难通过真菌研究中采用的同源重组方式来实现基因的敲除；而基因沉默和过表达等方法也因其转化效率较低等问题不能很好的反映目标基因在生物体内中的功能，高效的基因敲除技术的缺乏成为了限制卵菌基因功能研究的瓶颈。2015年已有最新研究表明，可利用CRISPR/Cas9敲除技术实现大豆疫霉基因的敲除，并用该方法证明了一类效应因子的功能。因此，CRISPR/Cas9敲除技术有望成为研究其他卵菌基因功能的重要手段。迄今，该技术在辣椒疫霉中的应用未见报道，所以建立和优化辣椒疫霉CRISPR/Cas9敲除体系对于辣椒疫霉相关研究工作的开展具有重要的意义。
基于以上研究背景，本研究拟通过载体构建、原生质体制备以及PEG介导的转化等方面的试验条件优化，建立辣椒疫霉中的CRISPR/Cas9敲除体系；并进一步借助该方法对ERG3基因进行敲除，明确该基因在辣椒疫霉中的功能，为进一步开展辣椒疫霉甾醇代谢相关研究以及其他基因未知功能的发掘奠定基础。
二、实施计划及方案(明确各个环节对培养学生创新能力的具体思路及考核办法)
1．资料查阅与整理：指导学生查阅国内外资料，全面了解该领域中的工作进展。
该环节主要是培养学生的科研思路，对课题进行相关的了解，为后续研究提供思路。考核办法：参与项目的每位同学阅读1-2篇英文文献，在小组学术讨论会上进行汇报。
2.针对后续基因进行敲除载体的构建和遗传转化，并获得目标基因的敲除转化子体。
4.课题总结：指导学生对数据和研究结果进行综合分析等。
该环节主要使学生掌握文献的查阅方法；数据的分析方法；图表制作；研究结果的汇报等。
考核办法：提供合格的数据分析文件，在本组和植物病理系的学术会议上进行汇报，提交URP结题报告等。
三、项目实施的基础和条件
1.项目申请人一直从事植物病原卵菌相关基因功能的研究工作，熟悉本课题的研究方法。
中国农业大学
本科生“URP”立项申请书
项目名称辣椒疫霉CRISPR/Cas9敲除
体系的建立及ERG3基因的功能研究
申请人刘西莉
工作单位植物保护学院
联系电话62733012
电子信箱****************.cn
填表日期2016年目名称
辣椒疫霉CRISPR/Cas9敲除体系的建立及ERG3基因的功能研究
该环节主要是培养学生在分子生物学和分子遗传学方面的基本实验操作技术。
考核办法：构建目标基因的敲除载体，获得目标基因的敲除转化子。
3.对目标基因的敲除体进行功能分析。
该环节主要是培养学生在植物病理学方面的实验操作技能，包括对于辣椒疫霉各发育阶段的观察，接种和侵染过程观察以及甾醇种类和含量的研究等。
考核办法：目标基因敲除转化子突变表型的各类图片和统计数据。
甾醇又叫固醇，属于脂类物质中的三萜类。甾醇在生物体尤其在真核生物体内广泛存在。对于真核生物中的脊椎动物、植物和真菌，其甾醇研究相对比较透彻，甾醇在这三类生物体内的存在形式和合成途径有所差别：在脊椎动物体内，主要的甾醇类物质是胆固醇；在植物体内大量存在着谷甾醇、豆甾醇和菜油甾醇；而在真菌体内，麦角甾醇含量很高，并发挥着重要的作用。甾醇在不同生物体内具有激素或者保证生物膜的完整性的作用，并且可影响很多与生物膜相关的生物功能。在植物体内，具有激素作用的甾醇主要被归为芸薹属甾醇（brassicasteriods）。芸薹属甾醇主要为植物体内菜油甾醇合成途径中的一些甾醇，对于这类甾醇的研究，最初人们关注的是其在促进植物生长方面的作用，而近年的相关研究表明，其能够引起植物生长必需的多种重要反应。真核生物体内，甾醇的结构和浓度可以影响很多与生物膜相关的生物功能，如液泡的形成，蛋白质分选，内吞作用，同型膜融合，膜蛋白活性，蛋白和酯类的侧向聚集以及生物膜离子通透性等。另外，芸薹属甾醇也可以影响植物细胞伸长，细胞分裂，应激反应，膜极化，质子泵，光合作用和细胞衰老等多种生理功能。
2.本实验室有从事辣椒疫霉基因功能研究的在读研究生多名，他们可以协助申请者指导URP计划的本科生。
3.实验室具备试验所需的灭菌锅、电磁炉、微波炉、培养箱、无菌操作台、水浴锅、PCR仪、电泳仪、冰箱等硬件设施；实验室具备原生质体转化所需的菌株、质粒、试剂等。
4.本研究小组目前承担国家自然科学基金等项目，研究经费有保障。
项目起止时间
2016.4-2017.4
项目申请人情况
姓名
刘西莉
性别
女
出生日期
1969.05
最后学历与学位
博士研究生，博士
专业技术职务
教授
从事专业
植物病理学
一、项目概况
辣椒疫霉（Phytophthora capsici）属于藻界、卵菌纲、霜霉目、霜霉科、疫霉属，是一种重要的土传植物病原卵菌，在2014年Sophien Kamoun等发表的“The top 10 oomycete pathogens in molecular plant pathology”一文中，辣椒疫霉位居第五，其寄主范围广，至少可侵染茄科、葫芦科等26科的上百种寄主植物，其中包括辣椒、番茄、黄瓜、菜豆等蔬菜作物，其侵染辣椒后引起的辣椒疫病是生产中的一种毁灭性病害，严重制约了辣椒的健康生产。
四、学生提交的成果
1．项目参与同学共同提交URP结题报告1份。
2.参加该项目的每位同学需要提交完整的URP实验记录，包括相关的照片资料、数据资料、文献资料、完整的实验记录等。
3.参加该课题的每位同学需要认真阅读1篇相关的英文文献，并在本研究小组的Seminar上进行汇报。
4.在尽可能的情况下，将URP研究工作与本科阶段的科研训练和毕业论文工作结合在一起，使学生有较多的时间参与研究，URP研究论文作为毕业论文参加答辩。
卵菌与丝状真菌在形态上有很多相似的地方，目前，卵菌基因功能研究中所采用的很多方法由丝状真菌中借鉴而来。但由于卵菌的营养生产阶段为二倍体，其同源重组率显著低于真菌，很难通过真菌研究中采用的同源重组方式来实现基因的敲除；而基因沉默和过表达等方法也因其转化效率较低等问题不能很好的反映目标基因在生物体内中的功能，高效的基因敲除技术的缺乏成为了限制卵菌基因功能研究的瓶颈。2015年已有最新研究表明，可利用CRISPR/Cas9敲除技术实现大豆疫霉基因的敲除，并用该方法证明了一类效应因子的功能。因此，CRISPR/Cas9敲除技术有望成为研究其他卵菌基因功能的重要手段。迄今，该技术在辣椒疫霉中的应用未见报道，所以建立和优化辣椒疫霉CRISPR/Cas9敲除体系对于辣椒疫霉相关研究工作的开展具有重要的意义。
基于以上研究背景，本研究拟通过载体构建、原生质体制备以及PEG介导的转化等方面的试验条件优化，建立辣椒疫霉中的CRISPR/Cas9敲除体系；并进一步借助该方法对ERG3基因进行敲除，明确该基因在辣椒疫霉中的功能，为进一步开展辣椒疫霉甾醇代谢相关研究以及其他基因未知功能的发掘奠定基础。
二、实施计划及方案(明确各个环节对培养学生创新能力的具体思路及考核办法)
1．资料查阅与整理：指导学生查阅国内外资料，全面了解该领域中的工作进展。
该环节主要是培养学生的科研思路，对课题进行相关的了解，为后续研究提供思路。考核办法：参与项目的每位同学阅读1-2篇英文文献，在小组学术讨论会上进行汇报。
2.针对后续基因进行敲除载体的构建和遗传转化，并获得目标基因的敲除转化子体。
4.课题总结：指导学生对数据和研究结果进行综合分析等。
该环节主要使学生掌握文献的查阅方法；数据的分析方法；图表制作；研究结果的汇报等。
考核办法：提供合格的数据分析文件，在本组和植物病理系的学术会议上进行汇报，提交URP结题报告等。
三、项目实施的基础和条件
1.项目申请人一直从事植物病原卵菌相关基因功能的研究工作，熟悉本课题的研究方法。