Tol2 转座子系统及其应用

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intron
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exon2
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Coding region UTR
图 1.— Tol2 转座子和最小转座子载体
图 2.—Tol2 最小结构及其转 座效率
1、当左臂 ≥ 200 bp ，右臂 ≥ 150 bp 时转座效率最高。
2、左右臂不能互换。
(Urasaki, Morvan et al. 2006)
图 3.—Tol2 的左右臂序列.
亚末端重复序列( AAGTA 出现 24 次、 GAGTA 出 现 9 次)
约 12 bp末端反向重复序 列，是转座酶识别的关 键序列。
(Urasaki, Morvan et al. 2006)
图 4. 正常的及替换突变的Tol2 骨架结构及其转座效率。
末端的长方形代表TIRs，箭头 及其方向分别代表SR及其方向， 中间的方块代表SR以外的序列， 黑色方块和三角形代表突变。
Tol2 转座子系统及其应用
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目录
CONTENTS
1 转座子简介 2 转座机制 3 Tol2 转座子整合位点偏好性 4 应用——转基因斑马鱼的构建 5 参考文献
转座子简介
转座子：能够从基因组的一个位点转移到另一位点并且整合在该位点的遗 传因子。
自主性转座子：玉米的 Ac(activator) 转座子系统，能编码一个有转座功能的 转座酶并且能自主转座。
(Urasaki, Morvan et al. 2006)
Tol2 转座子转座效率随着转座酶活性的提高而提高，并可能不存 在类似 SB 转座子系统 (Sleeping Beauty transposon system) 的过表 达抑制效应 (Kawakami and Noda 2004)
转座机制
Tol2 转座子整合位点偏好性
Tol2 在体内对靶基因的 AT 富集区有一定的偏好性 此外，Tol2 整合位点主要在转录起始位点， CpG 岛 和 DNA酶I 超敏感位点
(DNaseI hypersensitive sites) 附近(Huang, Guo et al. 2010) 体外整合实验证明，插入片段在靶质粒上不是随机分布的，而是聚集在
非自主性转座子：玉米的 Ds(Dissociation) 转座子系统，该系统转座酶基因 突变或缺失，但保留了必要的转座臂，在有活性的转座酶的存在下能够进 行转座
Barbara McClintock
Tol2 转座子被发现于青鳉的基因组，属于 hAT 家族，被鉴定为自主性转座 子。
Tol2 转座子约 4.7 kb，主要由一个（含有4个外显子）编码转座酶的基因 和一对同向转座臂组成 (图 1) (Kawakami 2007)。
参考文献
Urasaki, A., G. Morvan and K. Kawakami (2006). "Functional dissection of the Tol2 transposable element identified the minimal cis-sequence and a highly repetitive sequence in the subterminal region essential for transposition." Genetics 174(2): 639-649.
(Urasaki, Morvan et al. 2006)
图 5.转座酶 mRNA 和含有 Tol2 转座臂结构的质粒DNA 被共注射到一细胞期受精卵，养至 成鱼F0，杂交获得F1。 A. 左端和右端之间存在一个最小间隔区，否则也不能发生转座；当转座子结构长达11.7 kb
时未降低转座效率
B. Southern blot hybridization 检测拷贝整合 C. 1、2 从转基因鱼中扩出的插入片段；3、4 从质粒中扩出的插入片段 D. 整合位点两端附近的测序结果 8 bp TSD (target site duplication)
Ni, J., K. J. Wangensteen, D. Nelsen, D. Balciunas, K. J. Skuster, M. D. Urban and S. C. Ekker (2016). "Active recombinant Tol2 transposase for gene transfer and gene discovery applications." Mob DNA 7: 6.
Huang, X., H. Guo, S. Tammana, Y. C. Jung, E. Mellgren, P. Bassi, Q. Cao, Z. J. Tu, Y. C. Kim, S. C. Ekker, X. Wu, S. M. Wang and X. Zhou (2010). "Gene transfer efficiency and genome-wide integration profiling of Sleeping Beauty, Tol2, and piggyBac transposons in human primary T cells." Mol Ther 18(10): 1803-1813.
SV40 poly (A) 富集区
体外整合实验
通过 PCR 从模板 pTol2miniKan(-)amp中扩出平末端的 miniTol2-KanR 片段。 PCR 产物用 DpnI 酶处理，消化模板,后纯化。用刚制备的质粒和PCR产物进 行反应
20 μL 反应体系：
0.5 pMol 质粒 pGL, 相应的 PCR 产物，27 pMol His-Tol2 (~2 μg) 在 MOPS buffer (25 mM MOPS, pH 7.0; 1 mM MnCl2; 50 mM NaCl; 5 % glycerol; 2 mM DTT; 100 ng/ul BSA)中混匀 . 30 ℃，孵育 2 h。
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在序列下方的红线表示插入位点，
(Ni, Wangensteen et al. 2016)
由于转座可以非常有效地发生在斑马鱼 (等物种) 胚系中，Tol2 转座子系统 已成功应用于转基因和基因诱捕 (Kawakami et al. 2000)。
应用——转基因斑马鱼的构建
50%~70%
3%~100% (Kawakami 2007)
Kawakami, K. (2007). "Tol2: a versatile gene transfer vector in vertebrates." Genome Biol 8 Suppl 1: S7.
谢谢