绿僵菌发酵工艺的研究进展_梁昌聪

培养基质： 蔗糖、 可溶性淀粉和乳糖是液体培养 分生孢子的较好碳源， 而花生饼粉、 酵母浸出汁和蛋 白胨是较理想的氮源， 且复杂的氮源比简单的氮源更 有 利 于 液 生 分 生 孢 子 的 形 成 ［８］。
影响因素： 绿僵菌液生分生孢子的形成与培养基 成 分 、 表 面 活 性 剂 和 环 境 条 件 关 系 密 切 。 ［９～１３］ 不 同 的 菌株、 碳氮源对绿僵菌菌丝生长量和液生分生孢子产 孢量有显著性影响［４，８，１４］。 添加不同的氨基酸、 维生素 和微量元素对金龟子绿僵菌的生长和液生分生孢子的
培养基质： 固体发酵培养基组成简单， 常采用来 源广泛且便宜的天然基质或工农业下脚料， 如麸皮、 玉米芯粉、 大米等， 同时也可以包括没有营养的蛭 石、 海绵甚至织物等［２７］。
影响因素： 影响固体发酵的因素有培养基质（载体 和营养物）， 湿度， 接种量， 光照， 发酵时间的长短［２４］。 吴振强等研究了培养温度、 光照、 培养基初始 ｐＨ 等环
２００８ 年 １２ 月 Dec． 2008
热带农业科学 CHINESE JOURNAL OF TROPICAL AGRICULTURE
第 ２８ 卷第 ６ 期 Vol．28, No．6
绿僵菌发酵工艺的研究进展①
梁昌聪② 彭 军 黄 志 谢玉萍 黄俊生③ （中国热带农业科学院环境与植物保护研究所 海南儋州 571737）
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境因素对金龟子绿僵菌生长及产孢量的影响， 总结了发 酵过程培养物含水量的变化及其与产孢量的关系。 经过 优化， 得到金龟子绿僵菌产孢的最佳培养条件为： 培养 温 度 ２７℃、 避 光 培 养 、 培 养 基 初 始 ｐＨ６．０， 培 养 ６ ｄ 孢子产量可达 １．２１×１０１０ 孢子／ｇ干培养基； 培养基的 湿含量控制应为发酵前期高湿、 后期低湿［２８］。 卢忠燕 等用正交方法探索了金龟子绿僵菌的最适固体培养条 件， 结果 表明： ｐＨ７．０、 温 度 ２５℃最 适 合 绿 僵 菌 的 生 长， 固体培养基中蔗糖为碳源、 酵母为氮源、 加入微 量元素 Ｍｎ， 绿僵菌生长最好、 产孢最高［２９］。
３ 液固双相发酵（Ｄｉｐｈａｓｉｃ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ） 液固双相发酵是指经液体深层培养出菌丝或芽生
孢子后， 接入浅盘或其它容器的固体培养基上产生分 生孢子的方法。
由于物理学、 酶学及生物学特研究进展
是迄今所知国内外气生分生孢子最成熟的生产工艺， 由于其经济实用、 生产效率高 而 被 广 泛 采 用［３６， ３７］。 其 发酵过程包括液体发酵和固体发酵两个阶段， 具体是 通过摇瓶或发酵罐快速产生大量菌丝或芽生孢子， 然 后转接到固体培养基或惰性基质上产孢子， 生产工艺 流程如图 １。
应用情况： 宋璋报道在供试的 ８ 种碳源和 ６种氮 源相互组配的的培养液中， 以蔗糖 ＋ 花生饼粉的组合 最佳， 液生分生孢子产量达 １４．１３×１０９ 个／Ｌ［８］。
液体发酵的优点是发酵过程易于控制并且发酵速 度比起固体发酵快。 但缺点是绿僵菌液体发酵产生的 菌丝体、 芽生孢子由于细胞壁太薄而不能耐受诸如发 酵后的干燥、 田间应用受到紫外线照射等不利环境而 容易丧失活性［５］； 并且不能够悬浮在油里， 这就限制 了 绿 僵 菌 液 体 发 酵 的 进 一 步 应 用 ［１８， １９］。
① 国 家 科 技 支 撑 计 划 项 目（Ｎｏ． ２００７ＢＡＤ４８Ｂ０２）， 农 业 科 技 成 果 转 化 项 目（Ｎｏ． ２００７ＧＢ２３２６０４１０）， 中 央 级 公 益 性 科 研 院 所 基 本科 研 业 务费 专 项（２００７ＨＺＳ１Ｊ００７）。 收稿日期：２００８－０５－０５。 责任编辑／兰 莹； 编辑部 Ｅ－ｍａｉｌ： ｒｄｎｋ＠ｃｈｉｎａｊｏｕｒｎａｌ．ｎｅｔ．ｃｎ 或 ｒｄｎｋ＠１６３．ｃｏｍ。
１ 液体深层发酵（Ｓｕｂｍｅｒｇｅｄ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ） 发酵流程为： 斜面菌种 →摇瓶培养→发酵罐培
养→干燥→包装。 绿僵菌的液体深层发酵主要是在发 酵罐里进行。 绿僵菌在液体培养条件下， 通过菌丝隔 膜间裂殖或细胞酵母式芽殖产生芽生孢子或深层发酵 分生孢子。 绿僵菌在液体深层发酵中， 生长发育过程
影响因素： 包括了影响液体深层发酵和固体发酵 的因素。 张丽萍等对绿僵菌的液固双相发酵条件进行 了初步的研究， 确定了培养绿僵菌的培养基、 培养温 度、 含水量 、 培养时间 和 初 始 ｐＨ 值［４５］。 农 向 群 等 研 究了昆虫病原真菌绿僵菌 Ｒ８－４ 菌株液 固 两 相 法 培 养 过程中固相培养阶段的条件，包括培养基载体、 接种 量、 接种后基质含水量、 培养过程中的温度、 光照、 通气量等因素对产孢量的影响。 结果表明： 蛭石和稻 壳均可作为固相培养的优良载体，以蛭石为载体的产 孢量稍高于稻壳。 玉米粉和麦麸组合是该菌的良好营 养 源，与 不 同 载 体 配 合 均 可 使 产 孢 量 达 到 ２０×１０８ 孢 子／ｇ以上。 以小米提供营养的不如麦麸加玉米粉，当 小 米 与 载 体 的 质 量 比 大 于 ３∶１ 可 获 得 １５×１０８ 孢 子 ／ｇ的 产 孢 量 ［４６］。
斜面菌种
摇瓶培养
发酵罐
分离孢子
预干燥
固体培养
后干燥
包装
保存
图 １ 液固双相发酵工艺流程图
培养基质： 大规模发酵生产绿僵菌分生孢子主要 以大米［１９，３６］， 麦麸［３８，３９］和米糠［３５］为基质。 其中大米及其 大米副产品广泛应用于绿僵菌发酵的培养基质［１９， ３６］。 但 是， 当大米单独使用， 大米颗粒的较大的表面积限制 了真菌的利用空间， 如果单独使用底物， 就需要引进 一种增加水和空气利用率的介质。 据报道， 甘蔗渣和 固体发酵底物的混合使用能够促进水利用率进而促进 真菌的生长［４０，４１］。 到目前为止， 最经常使用的培养绿 僵 菌分生孢子的基质是大米 。 ［４２～４４］ 这是基于多种因素 的考虑， 包括营养平衡、 费用、 利用的地域性、 颗粒大 小形状、 接种真菌后的湿度和颗粒完整性等物理性质。
② 梁昌聪（１９８０～）， 男， 硕士， 研实员。 主要研究方向： 生物防治； Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｃｃｏｎｇｈｎ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ。 ③ 通讯作者。
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形成影响极显著［４，１５］。 吐温 ８０ 对绿僵菌液生分生孢子 的 形 成 具 有 显 著 的 影 响 ， 培 养 基 中 吐 温 ８０ 含 量 在 ０．６％～１．０％ 之间时，可获得最大的产孢量［１６］； 适当磁 化强度的磁化水能显著提高绿僵菌液生分生孢子产 量， 但不同菌株对磁化水的生物效应表现出明显的差 异性［１７］； 光照对绿僵菌菌丝生长和液生分生孢子产量 均无显著影响， 但是 培养温度和 ｐＨ 显著影响菌 丝 生 长 和 液 生 分 生 孢 子 的 产 出 率 ［８］。
绿僵菌是世界性分布的杀虫真菌， 能寄生 ８ 个目 ３０ 个科约 ２００ 种昆虫、 螨类及线虫［１］。 利用绿僵菌防 治害虫的研究已有百年， 它致病力强、 效果好， 对 人、 畜、 作物及害虫天敌无毒害， 是当今用于生物防 治的虫生真菌研究的主要对象之一。 国内有些单位利 用绿僵菌作了田间防治实验，防治效果明显，但尚未见 规模化生产。 由于绿僵菌的大量培养是满足田间应用 需求的基础， 因此对目前国内外绿僵菌发酵工艺进行 总结是十分必要的。 目前， 国内外发酵绿僵菌的方法 主要有液体深层发酵、 固体发酵和液固双相发酵［２，３］。
大 致 为 ： 振 荡 培 养 ２４ ｈ 后， 绿 僵 菌 分 生 孢 子 开 始 萌 发， 原生质转移至芽管生长点， 芽管自孢子一端或两 端伸出。 ３６ ｈ 菌体呈网状， ４８ ｈ 菌体呈团状， ６０ ｈ 菌 体出现产孢结构， 开始形成液生芽孢子， 液生芽孢子 呈长卵形。 ７２ ｈ 液生芽孢子开始大量形成［４］。 部分 芽 孢子以循环产孢方式，不经营养生长阶段， 直接从芽 孢子上形成分生孢子， 液生分生孢子卵球形， 与气生 分 生 孢 子 有 明 显 差 异 ［５～７］。
LIANG Changcong PENG Jun HUANG Zhi XIE Yuping HUANG Junsheng （Environment and Plant Protection Institute, CATAS, Danzhou, Hainan 571737）
Abstract The fermentation technologies for Metarhizium spp. developed at home and abroad in recent years are reviewed, and these technologies mainly include submerged fermentation, solid state fermentation and diphasic fermentation. The fermentation flow, culture medium, influence factors, application, advantage and disadvantage of each fermentation technology are described. Keywords Metarhizium spp. ; submerged fermentation ; solid state fermentation ; diphasic fermentation
虽然固体发酵比起液体发酵存在难以控制 ｐＨ、 温 度、 营养、 通气等问题［３３］， 但是固体发酵也具有自 己 的优势： 首先， 固体发酵使用的培养条件相对粗放， 而且培养基只需要比较简单的前期处理； 其次，工业 生产的资金投入比较小， 尤其在工业生产前期投入 少，利于规模化生产； 另外， 固体发酵的产品性能较 好、 而且工业生产时环境污染比较小， 更有利于生物 循环； 最后是固体发酵过程一般不需要严格的无菌操 作， 通气不需要连续通风， 空气一般也不需要严格的 无 菌 空 气 ［３４， ３５］。