药物分析第十一章抗生素

（一）呈色反应
–羟肟酸铁反应 青霉素及头孢菌素在碱性 中与羟胺作用，β-内酰胺环破裂生成羟肟 酸；在稀酸中与高铁离子呈色。
–茚三酮反应（侧链含-氨基酸结构） –与重氮苯磺酸的偶合反应（侧链含酚羟基
）
–硫酸-甲醛试验
（二）各种盐的反应 钾、钠离子的火焰反应 有机胺盐的特殊反应（如普鲁卡因青霉 素的重氮化-偶合反应）
第二节 β-内酰胺类抗生素
一、化学结构与性质
青霉素族
头孢菌素 族
** *
6-氨基青霉烷酸
**
7-氨基头孢菌烷酸
酸性：
青霉素和头孢菌素分子中的游离羧基具 有相当强的酸性，大多数青霉素的pKa 在2.5～2.8之间，能与无机碱或某些有 机碱形成盐。
旋光性：
青霉素族分子中含有三个手性碳原子， 头孢菌素族含有两个手性碳原子，故都 具有旋光性。
–仲酰胺的氨基、羰基的伸缩振动（3300cm-1± ，1525 cm-1±，1680 cm-1±）
–羧酸离子的伸缩振动（1600 cm-1±）
cm-1±、1410
UV——利用最大吸收波长鉴定法或利用水解产物 的最大吸收波长鉴定法。
三、特殊杂质的检查
本类抗生素的特殊杂质主要有高分子聚 合物，有关物质，异构体等，一般采用 HPLC法控制其量，也有采用测定杂质的 吸收度来控制杂质量的。
聚合物——HPLC法
聚合物的检查采用分子排阻色谱法。分 子排阻色谱法的分离原理为凝胶色谱柱 的分子筛机制。色谱柱多以亲水硅胶、 凝胶或经修饰凝胶如葡聚糖凝胶（ sephadex）和聚丙烯酰胺凝胶（ sepharose）等为填充剂。
现以头孢他啶中头孢他啶聚合物的测定 为例
1. 色谱条件与系统适用性试验
中国药典（2005）新规定了该项检查， 采用薄层色谱法测定。
溶液配制
供试品溶液：
取本品0.25g，精密称定，置回流瓶中，加入 5ml新鲜配制的硫酸-甲醇溶液（397‫） ׃‬溶解 ，加热回流1h，冷却，用甲醇冲洗冷凝管，合 并冲洗液，并用甲醇定量稀释成每1ml中含 10mg的溶液，作为供试品溶液。
（三）色谱法 高效液相色谱法（HPLC） 薄层色谱法（TLC） 中国药典收载的头孢菌素族药物和大多 数青霉素族药物采用HPLC法进行鉴别 。
（四）光谱法
IR——各国药典对收载的β-内酰胺类抗生素几乎均 采用了本法进行鉴别。
该类抗生素共有的特征峰：
– －内酰胺环羰基的伸缩振动（1750～1800）
2. 对照品溶液的制备：取头孢他啶对照品 适量，精密称定，加水制成含头孢他啶 100g/1mL的溶液，摇匀。
3. 测定法：取本品适量，精密称定，加水 制成含头孢他啶20mg/1mL的溶液，立 即进样200L，以流动相A为流动相进行 测定，记录色谱图；另取对照品溶液 200L注入液相色谱仪，以流动相B为流 动相，记录色谱图，按外标法计算，本 品含头孢他啶聚合物以头孢他啶计不得 过0.3%。
液，在110C加热数分钟显色。 限度：供试品溶液所显链霉素B 斑点的颜色与
对照溶液的主斑点比较，不得更深（3.0%）。
根据1mg甘露糖相当于4.13mg的链霉素B，则 :
C×4.13 L= S×1000
×100% 1700××140.1030限？×量100% =3.0%
2、硫酸奈替米星中有关物质的TLC检查： 供试品溶液：150mg / mL； 标准品溶液（1） 1.5mg / mL； 标准品溶液（2） 3mg / mL； 标准品溶液（3） 1.44mg西索米星/mL， 点样：各2L， 展开剂：二氯甲烷-甲醇-浓氨溶液（4：4：2） 显色：0.2%茚三酮溶液，110℃加热20min。
庆大霉素 C1 C2 C1a C2a
R1 CH3 CH3 H
H
R2 CH3 H
H
H
R3 H H H CH3
分子式 C21H43N5O 7C20H41N5O 7C19H29N5O7
C20H41N5O
7
二、鉴别试验
茚α-吡三氨咯酮基衍反酸生应的物—性—质本，类可抗与生茚素三具酮羟缩基合胺成类蓝和紫 色化合物。
ChP（2005）采用蒸发光散射检测器 检测
色谱条件：
–十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（pH值范 围0.8～8.0）；
–0.2mol/L三氟醋酸-甲醇（92：8）为流 动相，流速0.6ml/min；
–蒸发光散射检测器检测
系统适用性试验
–分别称取庆大霉素和小诺霉素标准品各适量 ，用流动相制成每1ml中各含0.2mg的溶液 ，取20l注入液相色谱仪，记录色谱图.
–C组分的出峰顺序从第二个主峰计，依次为 庆大霉素C1a、C2、小诺霉素、C2a、C1；
– C2、小诺霉素和C2a峰之间的分离度应符 合要求；
–连续进样的小诺霉素峰面积的相对标准偏差 应不大于2.0%。
测定法
r≥0.99 lgA
取小诺霉素标准品适量，精密称定，分 别用流动相制成每1ml中约含小诺霉素 0.2mg、0.5mg和1.0mg的溶l液g0.作2 为lg0.标5 lg1.0 准品溶液（1）、（2）、（3）。取上 述三种溶液各20l，分别注入液相色谱 仪，记录色谱图，计算标准品溶液浓度 的对数值与相应的主峰面积对数值的回 归方程，相关系数（r）应不小于0.99；
结果：供试品溶液如显杂质斑点，其颜色
–与标准品溶液（3）所显主斑点相比较，不 得更深（1%），
–其他杂质与标准品溶液（1）所显主斑点相 比较，均不得更深（1%），
–如有一点超过，应不深于标准品溶液（2） 的主斑点（2%）。
注半供：合试奈成品替 抗溶米 生液星 素：是 ，15由 因0m西此g索在/ m米奈L星替；经米化星学成衍品中生样有而可成西 能的对1 对2 残标留准西液索（米1）星1，.5m需g进/ 行m控L；制。 标准液（2） 3mg / mL； 标准液（3） 1.44mg西索米星/mL
自身对照外标法的原理：
该法是利用特定条件下β-内酰胺类抗生素可 以缔合成与高分子杂质有相似色谱行为的缔 合物，即在Kav=0处K表av=现有为效单分一配系的数色谱峰。
以药物自身为对照品，测定其在特定条件下 缔合时的峰响应指标；
然后改变色谱条件，测定样品，记录样品色 谱图中Kav=0处的高分子杂质峰的响应指标，
缺点：
–操作步骤多，测定时间长，误差大等。
✓ 理化方法 ——适用于提纯的产品以及化学结 构已确定的抗生素
优点：迅速、准确、有较高的专属性。
缺点：
对含有具同样官能团杂质的供试品不适用 ，或需采取适当方法加以校正。而且当该 法是利用某一类型抗生素的共同结构部分 的反应时，所测得的结果，往往只能代表 药物的总的含量，并不一定能代表抗生素 的生物效价。
–头孢呋辛酯A，B异构体、△3-异构体及E异构体峰 的相对保留时间分别约为1.0、0.9、1.2及1.7和 2.1。
–异构体——供试品色谱图中A异构体峰的面积与A、 B异构体峰的面积和之比应为0.48～0.55。
–有关物质——按自身对照法测定， E异构体不得过 1.0%；△3-异构体不得过1.5%；其他单个杂质不 得过0.5%并规定了总杂质量不得过3.0%。
3、庆大霉素C组分测定
庆大霉素C1、C2、C1a对微生物的活性 无明显差异，但其毒副作用和耐药性有 差异，导致各组分的多少影响产品的效 价和临床疗效。因此各国药典均规定控 制各组分的相对百分含量。
庆大霉素无紫外吸收，当采用HPLC-紫 外检测器检测时，需进行衍生化处理。 由于其具有强极性和水溶性，为获得理 想的色谱结果，可采用离子对色谱法， 以庚烷磺酸钠为反离子。
β-内酰胺环的不稳定性：
β-内酰胺环是该类抗生素的结构活性中 心，其性质活泼，是分子结构中最不稳 定部分，其稳定性与含水量和纯度有很 大关系。在酸、碱、青霉素酶、羟胺及 某些金属离子（铜、铅、汞和银）或氧 化剂等作用下，易发生水解和分子重排 ，导致β-内酰胺环的破坏而失去抗菌活 性。
二、鉴别试验
△3-异构体是取头孢呋辛酯对照品经加热破坏 处理而制得， E异构体经紫外光照射24h 制得 。
头孢呋辛酯是由两 个非对映异构体头 孢呋辛酯A和B组成 的混合物
1 头孢呋辛；2异构体B；3异构体A；4△3-异构体；5,6 E异构体
吸光度
如青霉素钠（钾）的吸光度检查：
–取本品，加水制成每1mL中含1.80mg 的溶液，照分光光度法，在280nm的 波长处测定吸收度，不得大于0.10；在 264nm的波长处有最大吸收，吸收度 应为0.80～0.88。
为链霉素的专属反应
坂口（Sakaguchi）反应——链霉素水 溶液加氢氧化钠试液，水解生成链霉胍 与8-羟基喹啉、次溴酸钠反应，生成橙 红色化合物。
为链霉素的专属反应
三、特殊杂质检查及组分分析
1、链霉素中链霉素B的检查
链霉素B是指甘露糖链霉素，由发酵产生 , 其生物活性仅为链霉素的20%~25%， 能被甘露糖链霉素B苷酶水解成甘露糖和 链霉素。
第三节 氨基糖苷类抗生素
这类抗生素的化学结构都是以碱性环已 多元醇为苷元，与氨基缩合而成的苷， 故称为氨基糖苷类抗生素。
主要有链霉素、庆大霉素、卡那霉素、 新霉素及巴龙霉素、硫酸奈替米星、硫 酸西索米星、硫酸依替米星等 它们的抗菌谱和化学性质都有共同之处 。
一、化学结构与性质
链霉素
庆大霉素
药物分析第十一章抗生素
含量测定或效价测定
微生物学法—ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ通过比较标准品与供试 品产生抑菌圈的大小来测定供试品的效 价。其原理恰好与临床应用要求一致， 更能确定抗生素的医疗价值。
对于分子结构复杂、多组分的抗生素， 生物学法是首选的效价测定方法。
本法的优点：
–灵敏、用量小，结果直观
–适用范围广：纯度好的、差的制品，已 知或新发现的抗生素均适用，同一类型 的抗生素不需分离，可一次测定其总效 价。