成纤维细胞的培养
抗坏血酸_成纤维细胞培养_解释说明以及概述
抗坏血酸成纤维细胞培养解释说明以及概述1. 引言1.1 概述本文旨在探讨抗坏血酸在成纤维细胞培养中的作用机制，并解释其与成纤维细胞生物学过程的关联。
抗坏血酸，也被称为维生素C，是一种重要的水溶性维生素，在人体中扮演着多种重要的生理功能角色。
而成纤维细胞作为基质合成和调节过程中至关重要的一环，其培养方法及应用领域也备受研究者关注。
因此，深入了解抗坏血酸在成纤维细胞培养过程中的作用机制将对进一步揭示其生物学活性和应用前景具有重要意义。
1.2 文章结构本文将分为五个主要部分进行论述。
首先，引言部分将提供对文章主题的概述和定义以及文章整体结构。
其次，我们将介绍抗坏血酸（维生素C）的定义、特性、生理功能以及相关缺乏症状和食物来源。
第三部分则涵盖了成纤维细胞培养的概述、原理及其在科研和应用领域中的意义。
接下来，我们将详细解释抗坏血酸在成纤维细胞培养中的作用机制，包括抗氧化作用、与胶原合成的关联以及对细胞增殖和凋亡的调节效应。
最后，我们将总结并得出相关结论。
1.3 目的本文旨在全面阐述抗坏血酸在成纤维细胞培养中的作用机制。
通过深入了解抗坏血酸对成纤维细胞生物学过程的影响，希望能够揭示其在相关领域中的潜力和应用前景。
同时，本文也将为科学界提供更多关于抗坏血酸与成纤维细胞之间相互作用的理论依据，并为进一步研究该领域提供参考和指导。
2. 抗坏血酸2.1 定义和特性抗坏血酸，也称为维生素C，是一种水溶性维生素。
化学名为L-抗坏血酸，分子式为C6H8O6。
它是人体必需的营养物质之一，人体无法自主合成，因此需要通过食物摄入。
抗坏血酸具有许多特点和特性。
首先，它是一种强大的抗氧化剂，在体内可以中和自由基，并保护细胞免受氧化应激的伤害。
其次，抗坏血酸对于胶原蛋白的合成至关重要，它促进胶原蛋白的生成与修复，并维持皮肤、组织和器官的健康状态。
此外，抗坏血酸还能增强免疫系统功能、促进铁元素吸收以及参与多种生理过程。
2.2 生理功能抗坏血酸在人体中拥有多项重要的生理功能。
成年小鼠心肌成纤维细胞的分离和原代培养
成年小鼠心肌成纤维细胞的分离和原代培养物品准备：6-8周成年小鼠、眼科剪、眼科镊、75%酒精、PBS缓冲液、细胞培养皿、细胞培养瓶、15ml细胞离心管、恒温水平摇床、低速水平离心机、倒置显微镜、DMEM/F12细胞培养基、胎牛血清、胶原酶II、胰蛋白酶等。
操作步骤：（1）取出2只成年小鼠心脏，并将它们置于含有冰冷的PBS的培养皿中。
（2）将心脏置于无菌细胞培养皿中，并在无菌条件下进行操作。
使用剪刀将心脏切成10块，使用解剖刀将它们缩小至1mm的尺寸。
（3）将组织小块移到盛有PBS的无菌细胞培养皿中，清洗后弃去PBS。
（4）加入2ml消化缓冲液并在37℃恒速水平摇床下消化组织5分钟。
注意：摇床速度应调整至80r，以使所有组织片流动并且不会坐在底部，但不应太强以至不能破坏细胞。
消化酶（胶原酶II: 1mg/ml，胰酶: 0.75mg/ml）（5）将混合物放置1分钟，使组织沉淀并丢弃含有碎片和血细胞的上清液。
（6）加入2ml消化缓冲液并在37℃恒速水平摇床下消化组织30分钟。
（7）将混合物放置１分钟使组织沉淀到底部，并用移液管收集上清液。
不要收集倾向于漂浮的组织碎片。
（8）将上清放入含有2ml成纤维细胞培养基的15ml细胞离心管中。
（9）800r，离心5min。
（10）将细胞重悬于3-4ml培养基中。
（11）重复步骤6-10，直到所有组织溶解（通常7-10次）。
（12）将细胞悬液平铺到细胞培养皿瓶中，并在37℃下在具有5%二氧化碳的细胞培养箱中培养２小时。
（13）２ｈ后显微镜下观察细胞汇合。
此时成纤维细胞类似于小圆点。
（14）收集并丢弃上清液。
用2.5ml温热的PBS洗涤３次，并用10ml 新鲜的成纤维细胞培养基补充。
在37℃和5%二氧化碳的细胞培养箱中培养。
一种鸡胚胎成纤维细胞体外三维培养和分离的方法
一种鸡胚胎成纤维细胞体外三维培养和分离的方法1. 从鸡胚体内收集成纤维细胞：使用灭菌的工具和培养介质，从鸡胚体内收集成纤维细胞。
2. 细胞培养基的制备：制备适宜的细胞培养基，比如DMEM（Dulbecco's Modified Eagle's Medium），其中包含适当的营养物质和补充物。
3. 细胞培养底物处理：在培养器中涂覆适宜的细胞培养底物，比如胶原蛋白、明胶或聚二甲基丙烯酸甲酯（PDMA）等。
4. 细胞预处理：将收集到的鸡胚胎成纤维细胞在预处理培养基中预处理一段时间，以提高细胞的存活率和增殖速度。
5. 细胞接种：将经过预处理的细胞接种至培养器中的培养底物上，使细胞附着并形成单层或多层细胞。
6. 体外三维培养的创建：将培养器中的细胞培养至一定程度，使细胞形成三维结构，如球状或纺锤状。
7. 细胞增殖和细胞养护：提供适宜的培养条件，包括合适的培养基、温度、湿度和氧气含量，以促进细胞增殖和维持细胞的健康状态。
8. 培养基的更换：定期更换培养基，以排除废弃物和维持细胞的正常功能。
9. 细胞监测和分析：使用显微镜和其他细胞学技术，定期监测和分析培养器中的细胞状态、数量和生长速度。
10. 细胞传代：当细胞达到一定密度时，可以进行细胞传代，将细胞分离、稀释并重新接种，以维持细胞的健康状态和继续培养。
11. 细胞分离：使用适当的消化酶（如胰蛋白酶）或细胞分离缓冲液，将三维细胞结构分离为单个细胞。
12. 细胞计数：使用细胞计数仪或显微镜，对分离的细胞进行计数，以确定细胞的数量。
13. 细胞检测：采用细胞培养板或微孔板等细胞培养容器，将分离的细胞均匀地分配在不同孔或区域上，以进行后续的细胞检测和分析。
14. 细胞培养条件的优化：在细胞分离过程中，根据不同实验目的，优化培养条件，如培养基的配方、温度、湿度和氧气含量等。
15. 细胞培养的存活率和生长速度的分析：通过计算存活细胞的比例和细胞增殖速率，评估细胞培养的效果。
人成纤维细胞的体外分离、纯化培养及细胞鉴定
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中国老年学杂志 2012 年 3 月第 32 卷
化学染色，细胞质中有棕色颗粒。成纤维细胞的标志物 Vimen- tin 为阳性，证明提取细胞为成纤维细胞。见 细胞培养第 2 天； c： 细胞培养第 12 天细胞生长呈鱼群状； d： 细胞培养第 14 天，细胞生长呈漩涡状
5 Keisuke T，Jin H，Taranova O，et al. Generation of insulin-secreting isletlike clusters from human skin fibroblasts〔J〕. Science，2008； 283 （ 46 ） ： 31601-7.
2结果 2. 1 成纤维细胞分离、纯化及培养 通过酶消化法及贴壁筛 选法，成功分离出人成纤维细胞。 2. 2 形态学观察 倒置显微镜观察细胞形态，接种第 2 天可 见细胞散在生长，分布不均的单个贴壁细胞呈梭形，成纤维细 胞样。待细胞培养 10 ～ 14 d 时，细胞生长已达 80% ～ 90% ，呈 鱼群样或漩涡状排列。见图 1。 2. 3 细胞 HE 染色 成纤维细胞的形态呈梭形，也可见大多 角形和扁平星形等。核仁明显，核呈椭圆形，可见 1 ～ 2 个核 仁，胞体较大，胞质弱嗜碱性，染色质疏松着色浅。当细胞汇流 时，呈鱼群样或漩涡状排列，细胞在 15 代内形态保持不变，经 HE 染色可以更清楚地观察到这些表现。见图 2。 2. 4 细胞免疫组化结果 对第 6 代成纤维细胞进行免疫细胞
人 成 纤 维 细 胞 的 体 外 分 离 、纯 化 培 养 及 细 胞 鉴 定
王玲玲1 马 峰2 张玉成 杜珍武 张桂珍 （ 吉林大学中日联谊医院中心研究室，吉林 长春 130033）
〔摘 要〕 目的 对人皮肤成纤维细胞进行分离、纯化、培养及细胞鉴定，探讨一种高效的分离及纯化方法，为细胞移植提供种子细胞。方法 使用酶消化法原代提取人成纤维细胞，快速贴壁法纯化细胞，对细胞进行形态学观察、HE 染色，免疫细胞化学鉴定细胞标志物 Vimentin。结果 利 用倒置显微镜及 HE 染色，可见细胞为散在分布的梭形贴壁细胞，当细胞汇流时，呈鱼群样或漩涡状排列，且细胞在 15 代内形态保持不变。结论 成 功地发现快速提取成人成纤维细胞的方法，为成人自体细胞移植的研究奠定了基础。
原代成纤维细胞培养基配方
原代成纤维细胞培养基配方1.引言1.1 概述成纤维细胞是一类常见的细胞，广泛存在于人体各个组织中，包括皮肤、血管、肌肉和内脏等。
在细胞培养技术的发展过程中，原代成纤维细胞培养基的配方变得越来越重要。
原代成纤维细胞培养基是一种提供养分和适宜环境的培养液，可以维持原代成纤维细胞的生长和增殖。
原代成纤维细胞培养基的配方包括多种关键成分，如培养基基础成分、生长因子、附加物等。
不同的组分可以提供细胞所需的营养和信号物质，使细胞能够在体外环境下继续生长和繁殖。
原代成纤维细胞培养基配方的研究对于细胞生物学、组织工程和再生医学等领域具有重要意义。
通过优化培养基的配方，可以提高原代成纤维细胞的增殖速度和存活率，同时改善其功能和特性，为细胞研究和临床应用提供更好的工具和基础。
然而，目前关于原代成纤维细胞培养基的配方研究还比较有限。
不同实验室和研究者之间存在着很大的差异，配方的选择和调整仍然依赖经验和试错。
因此，进一步的研究和探索仍然是十分必要和迫切的。
本文将深入探讨原代成纤维细胞培养基配方的概念和重要性。
我们将详细介绍培养基的组成、各种成分的作用机制，并总结现有研究的进展和局限性。
最后，我们将展望未来的研究方向，希望通过进一步的研究和探索，为原代成纤维细胞培养基的配方优化和应用提供更好的指导和支持。
1.2 文章结构文章结构部分的内容可以包括以下内容：文章结构部分的主要目的是为读者提供对整篇文章的摘要和框架。
通过描述文章的组织结构，读者可以更好地理解文章的内容和逻辑顺序。
首先，本文将介绍原代成纤维细胞培养基的概念和重要性。
这一部分将讨论成纤维细胞在生物医学和生命科学研究中的重要作用，以及为什么培养基对于细胞培养的成功和细胞功能的研究是至关重要的。
其次，本文将详细介绍原代成纤维细胞培养基的组成。
这一部分将讨论培养基中各种组分的作用和功能，如营养物质、生长因子、酶和血清的添加等。
读者将了解到培养基中各种组分的重要性和对细胞生长和功能的影响。
CEF、DEF培养
鸡胚成纤维细胞（CEF）、鸭胚成纤维细胞(DEF)培养一、材料9¬10日龄鸡胚13¬14日龄鸭胚眼科剪、镊、外科镊、巴氏吸管、蛋架、灭菌平皿 25ml小三角瓶Hanks＇液 0.25%胰酶液 Versene液灭菌纱布、玻璃漏斗、0.1% 结晶柠檬酸（0.1M）或0.4%台盼兰,血球计数板、60ML培养瓶或60ML培养皿、灭菌盖玻片、营养液。
二方法（CEF为例）鸡胚理：取9¬10日龄鸡胚直于蛋架，在气室部用于5%碘酊棉消毒，再用洒精棉脱色，用外科镊击破蛋壳用眼科镊取出胚体放于平皿内，去喙瓜眼和内脏，用Hank＇s液洗两次，用弯头眼科剪剪胚剪成1-2mm的碎块，加Hank’s液20ml,略加摇振，静置使组织块下沉，将混有红血球及碎片的上悬液吸去，重复洗2—3次，直至上悬液不混浊为止。
2、消化：将0.25%胰蛋白酶溶液用5、6%NaHCO2滴定至PH7、6—7、8，加热至37度，按组织块量3—5倍加于装有鸡胚碎块的三角瓶中，每个鸡胚约需胰酶5ml，30分钟取出，静置1—2分钟，吸去胰液，再加HanK’s 液20ml，轻轻摇动后吸去，如此反复两三次，目的是洗去残余的胰酶。
第三次加入营养液，每胚3ml左右，用粗口吸管吹吸数次，使细胞脱落分散。
静置1—2分钟，候组织下沉后，细心将细胞悬液吸出，另置一只25ml三角瓶，如此反复数次，使细胞尽量自组织块脱落，将多次取得的悬液合并一处，纱布过滤悬液。
必须注意每次吹吸一般6—7次为宜，太多则细胞受损，消化时间要灵活掌握，不足细胞不易掊落，太久则细胞破碎。
在消化过程中，摇动时组织不易下沉即立即停止，消化后如组织粘连如涕，证明消化过度。
二、细胞计数：取细胞悬液0.1（100ul）置盛有0.9ml10.4%台盼蓝的试管中混合,用血球计数板计数。
计算方法：4大方格细胞数每ml细胞数=——————————————X10（5）45中格细胞数或每ml细胞数=——————————X10（4）三：接种以营养液配成每ml10（6）细胞（最终稀释度）接种链霉素瓶（1ml）、60ml瓶（8—10ml），100mm dish（10ml），60mm dish（4ml），37度孵育48小进后形成单层，接种病毒或作次代培养。
牙周膜肌成纤维细胞的体外培养及其标志物的表达时效
牙周膜肌成纤维细胞的体外培养及其标志物的表达时效目的探讨人牙周膜肌成纤维细胞（MFB）体外培养及其标志物表达的时效性。
方法体外培养人牙周膜成纤维细胞（hPDLF），72 h内以5ug·L-1终质量浓度的转化生长因子（TGF）-B1诱导hPDLF向MFB转化，免疫细胞化学和免疫组织化学染色检测MFB标志物a-平滑肌肌动蛋白（a-SMA）表达情况。
分别进行12、24、48、72、96和120 h的MFB观察，采用流式细胞术观察MFB长时间培养的细胞活性，采用免疫细胞化学观察MFB长时间培养后的a-SMA表达情况。
结果经TGF-B1诱导后a-SMA呈阳性；诱导至120 h，a-SMA仍呈阳性，72 h内其表达稳定。
结论5 ug·L-1终质量浓度的TGF-B1成功诱导人牙周膜细胞向MFB转化。
MFB体外培养具有时效性，培养0-72 h，其状态稳定。
标签：人牙周膜成纤维细胞；肌成纤维细胞；a-平滑肌肌动蛋白本研究的前期体内试验证实，正畸牙牙周膜张力侧肌成纤维细胞（myofibroblast，MFB）可能参与了牙周膜改建和成骨细胞的成骨过程；但牙周膜内生物学环境复杂，在正畸生物力学的影响下，多种牙周膜细胞都可能出现类似于MFB标志物的表达情况；因此，要明确MFB在牙移动过程中可能发挥的作用，就需要进行体外试验，以明确MFB分泌细胞外基质及成骨的机制。
MFB 大多存在于组织处于外力环境时，而当外界张力因素去除掉后，MFB大多程序性死亡或退化消失。
研究MFB的功能，在成功诱导出MFB后还需明确MFB的活性，即MFB可以维持多久，这样才能确定MFB的体外观察时间。
本试验采用转化生长因子（transforming growth factor，TGF）-B1诱导人牙周膜成纤维细胞（human periodontal ligament fibroblast，hPDLF）向MFB转化，从12 h起，分6个时间点对hPDLF进行最长120 h的观察。
猪皮肤成纤维细胞的培养与鉴定
文章编号:100025404(2004)1321171204 论著猪皮肤成纤维细胞的培养与鉴定丁生财1,陈意生1,魏 泓2,刘 萍3 (第三军医大学:1西南医院病理科,2实验动物中心,重庆400038,3新桥医院妇产科,重庆400037) 提 要:目的 研究猪内源性逆转录病毒在体内和体外的感染性,建立理想的细胞模型,为猪一人间跨种移植的生物安全性评价奠定良好的基础。
方法 运用组织块培养法、冷胰蛋白酶方法及热胰蛋白酶方法培养猪皮肤成纤维细胞,比较3种方法的优点和缺点。
结果 建立了猪皮肤成纤维细胞系组织块培养法优于胰酶法。
结论 应用组织块培养法培养猪皮肤成纤维细胞优于胰酶法,经济实惠、操作简便、易于掌握;并为研究PERV在体内和体外的感染性提供了理想的细胞模型,为评估猪一人间跨种移植的生物安全性提供一种新的方法;对建立动物克隆生产的皮肤体外培养模式具有重要的参考价值。
关键词:成纤维细胞;猪内源性逆转录病毒;异种移植;生物安全性;感染;培养;皮肤;猪 中图法分类号:R322.99;R329.2 文献标识码:ACultivation and identification of porcine skin fibroblastsDI NG Sheng2cai1,CHE N2Y i2sheng1,WEI H ong2,LI U Ping3(1Research Institute of Pathology,S outhwest H ospital,2Department of Lab2 oratory Animal Science,3Department of Obstetrics and G ynecology,X inqiao H ospital,400037,Third Military Medical University,Chongqing 400038,China) Abstract:Objective s T o establish an ideal cellular m odel for the study of in fection of porcine endogenous ret2 rovirus in intro and in vivo and to lay the foundation for evaluating the biological safety of xenotransplantation.Meth2 ods P orcine skin fibroblasts were cultured by tissue pieces,cold trypsin,and heat trypsin,respectively.The merit and defect of these methods were analyzed.Re sults P orcine skin fibroblast line was established and the tissue piece method was superior to trypsin methods.Conclusion Culture of porcine skin fibroblasts with tissue pieces is superi2 or to trypsin method,with the characteristics of low cost and easy operation.The established porcine skin fibroblast cell line supplies an ideal cell m odel for the study of in fection of porcine endogenous retrovirus in vitro and in vivo, provides a new method for the evaluation of biological safety of xenotransplantation,and plays an im portant role in the skin culture m odel of production of cloned animals. K ey w ords:fibroblast cell;porcine endogenous retrovirus;xenotransplantion;biological safety;in fection;cul2 ture;skin;pig 猪器官、组织和细胞作为猪一人间跨种移植的供体源具有广阔的前景,但其基因组载有猪内源性逆转录病毒前病毒序列,可能导致猪内源性逆转录病毒(porcine endogenous retrovirus,PERV)种间传播发生的潜在危险。
成纤维细胞培养
人皮肤成纤维细胞库的构建试剂: 胶原酶(Sigma)，优质胎牛血清(Gibco)，胰蛋白酶(Sigma)，中性蛋白酶(Sigma)，DMEM培养基(Sigma)，二甲基亚砜(Merck)。
配液 :成纤维细胞培养基配制:DMEM10g，NaHCO3 3．7g，HEPES 2．4g，优质胎牛血清100ml，青霉素100 000U，链霉素100 000U，超纯水加至1 000ml，用1N NaOH 调pH值至7-2～7．4，0．22pan孑L滤膜过滤除菌，9Om】／瓶分装，一2O℃贮存备用。
D—Hanks 平衡盐液：NaC1 8．0g，KC1 0．4g，Na2HPO4·12H：0 134．4mg，KH~PO4 0．06g，NaHCO3 0．35g，酚红O．O2g，青霉素100000U，链霉素100000U，超纯水加至1 o0Ornl，用1N NaOH调pH值至7．2-7A，0．22tun孔滤膜过滤除菌，90ml／瓶分装，一2O℃贮存备用。
方法:乙醇棉球将标本用力擦拭3遍；标本移至培养皿中，用D—Hanks平衡盐液反复用力彻底冲洗标本5遍，直至标本发白，轻度发胀；在培养皿中修剪皮下筋膜组织及多余的皮下脂肪，将标本剪成0．3cmx2．0em大小的皮条，置于培养皿中，加0．25％胰蛋白酶浸没组织，4℃冰箱中消化14~16h，以用眼科镊能轻轻揭下表皮为度；消化后的标本置于超净工作台上。
吸出胰蛋白酶，用DMEM漂洗2遍，中止胰蛋白酶消化作用；用眼科镊轻轻揭下表皮，置于另一培养皿中(用于培养角质形成细胞)，真皮置于培养皿中，用眼科剪将真皮成分剪成糊状(组织大小约为0．1cmx0．1cmx0．1cm)，加入0．2％胶原酶浸没组织，37℃孵箱中消化1~4h，以将组织基本上消化散开，看不到组织块为度；加D-Hanks平衡盐液1 500#min离心5min，5遍，以洗去胶原酶，沉淀即为成纤维细胞，弃上清，加DMEM制成细胞混悬液，接种至50ml培养瓶中，置37℃、5％CO：、湿度95％的CO 孵箱中培养131。
鸡胚成纤维细胞的原代培养
鸡胚成纤维细胞的原代培养171850044生拔钱诗晨一、背景知识1.1原代培养与传代培养1.1.1原代培养是指直接从生物体取材（细胞、组织或器官）进行的第一次培养（中途不分割培养物、不更换培养物的生长器皿）。
1.1.2传代细胞培养分割细胞培养物进行的再配养注：细胞培养的代不是指细胞分裂次数，而是指培养的次数1.2细胞体外培养要求的条件✓无菌✓适宜温度：哺乳动物细胞36.5℃ 0.5℃，植物细胞原生质体25℃左右✓生理渗透压✓适宜酸碱度：7.2-7.4✓气体：95%空气+5%二氧化碳✓培养基：提供水、各种有机营养（糖、氨基酸、维生素等）及无机盐、生长调节因子等1.3培养细胞生长类型悬浮型：培养时不黏附于支持物之上。
而呈现悬浮生长的细胞。
贴壁型：培养时需要黏附于一定固相支持物表面才能很好生长的细胞。
又称黏附依赖型细胞（分如下四类）✧成纤维细胞：胞体呈梭形或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质突起，生长时呈放射状。
✧上皮型：细胞呈扁平不规则多角形，中央有圆形核，细胞彼此紧密相连成单层膜。
✧游走型：呈散在生长，一般不连成片，胞质常突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规则。
此型细胞不稳定，有时难以和其他细胞相区别。
在一定条件下，如培养基化学性质变动等，它们也可能成纤维细胞形态。
✧多形型：是一些形态上不规则的细胞。
细胞一般分胞体和胞突两部分，胞体呈不规则多边形，胞突呈细长丝状。
如神经元和神经胶质细胞1.4原代细胞培养的一般办法1.4.1植块培养法直接将组织块接入培养皿底部，待组织块贴牢在底部后再加入培养基培养的方法1.4.2离散细胞培养法用酶消化组织，使细胞之间连接破坏，将组织离散成单细胞悬液进行培养的方法注：原代培养中的植块培养法与组织培养不是一回事；植物组织培养又叫离体培养，指从植物体分离出符合需要的组织、器官或细胞、原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。
大鼠肺成纤维细胞原代提取及培养实验具体步骤及方法
大鼠肺成纤维细胞原代提取及培养实验具体步骤及方法将大鼠的肺成纤维细胞从机体中取出，经胰酶、螯合剂（常用EDTA）处理，分散成单细胞，置合适的生长培养基培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。
一、实验材料准备1. 动物出生后1-4天的Wistar乳鼠1只。
2. 试剂PBS、培养液(Hyclone的低糖DMEM，含Hyclone的10%新生牛血清、100 U/ml 青链霉素、1%明胶PBS、0.25%胰酶(含EDTA，GIBCO)，碘酒和酒精绵球。
3. 器械眼科直剪2把、眼科弯剪2把、眼科直镊2把、眼科弯镊2把、玻璃平皿3套，25 cm2塑料培养瓶(Costar)。
二、具体操作1. 明胶包被培养瓶过夜(准备2-3个)，取出明胶，用2 ml培养液冲洗培养瓶一遍，置于超净台中。
2. 解剖取肺：将乳鼠在酒精中浸泡后取出，转移至超净台上的玻璃培养皿中，用碘酒消毒胸部皮肤，再用酒精棉球脱碘。
左手捏紧乳鼠颈背部皮肤以充分展露胸部，右手以眼科直剪剪开皮肤，充分撕拉开，再用酒精棉球消毒，继而以另一把眼科弯剪沿胸骨柄左下缘向上剪开肋骨，然后在切口中间横剪胸骨。
用眼科镊取出肺，置于盛有PBS(含有200U/ml青链霉素)的玻璃平皿中，冲洗去血。
3. 用眼科剪将肺分成几个肺叶，用镊子去除周边的血凝块及纤维组织，用眼科剪剪去肺门处的支气管和血管，再用含有双抗的PBS冲洗1遍。
4. 用眼科弯剪将肺组织剪碎成1 mm3大小，加入含有双抗的PBS，将肺组织块吹打开，静置15 min后，更换新的PBS。
5. 用200 ul微量加样器(最好是超净台中专用的，临用时用酒精绵球好好擦拭枪柄)取200 ul加样枪头一个，剪去尖，在酒精灯上用火焰烧弯。
用枪头吸取组织块接种于培养瓶中，每瓶20-25块左右，每小块间距0.5 cm左右。
组织块放置好后，轻轻将培养瓶翻转，让瓶底朝上，向瓶内加入2 ml左右的培养液，盖好瓶盖，将培养瓶倾斜放置在温箱中，干贴壁2-4 h后，将培养瓶慢慢翻转平放，继续静置培养。
小鼠成纤维细胞原代培养
实验—小鼠成纤维细胞得原代培养一、实验目得１.掌握哺乳动物细胞原代培养与传代培养中得取材、消化及无菌操作等基本实验技术与操作过程。
2。
熟悉在倒置相差显微镜下观察培养细胞得形态与生长状况得方法．3。
了解细胞原代培养与传代培养得原理与方法。
二、实验原理自１７世纪下半叶Robｅrt Hooｋｅ提出“细胞"概念直至2０世纪中叶，细胞培养(Cell culture)才逐渐发展起来.现代生命科学以及相关领域得研究前提就是细胞得维持与增殖，因此,细胞培养不仅就是细胞生物学得密不可分得组成部分,而且已经成为生物化学、生物物理学、遗传学、免疫学、肿瘤学、生理学、分子生物学与神经科学、甚至临床医学得重要内容。
细胞培养也就是细胞生物学延伸至相关学科得一条主要途径。
如今,细胞培养已经成为生命科学与医学研究最常用得基础技术之一。
细胞培养就是模拟机体内生理条件,将细胞从机体中取出,在人工条件下,使其生存、生长、繁殖与传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题得研究。
细胞培养得直接目得就是维持或扩增细胞数量。
依据取材于动物组织或培养细胞,细胞培养分为原代培养与传代培养．1.原代培养(pｒimary culture)就是从供体取得组织或细胞后在体外进行首次培养直至成功地进行首次传代之前得培养。
但实际上通常把第一代至第十代以内得培养细胞统称为原代细胞培养.原代培养就是建立细胞系得第一步,其最基本得方法有两种：组织块培养法与消化培养法.组织块培养法就是指直接从机体取下组织与器官,通过组织块直接长出单层细胞,该培养法就是最常用得原代培养方法，其将刚刚离体得、生长活力旺盛得组织剪成小块接种在培养瓶中作为实验材料，一天后细胞可从贴壁得组织块四周游出并生长。
组织块培养法操作过程简便、易行,培养得细胞较易存活，适用于一些来源有限、数量较少得组织得原代培养。
消化培养法利用酶或机械方法将组织分散成单个细胞后，在不加任何粘附剂得情况下，直接移植在培养瓶壁上,加入培养基立即进行培养得方法。
人心肌成纤维细胞的培养及免疫荧光鉴定
人心肌成纤维细胞的培养及免疫荧光鉴定摘要】目的:探讨和建立适用于人心肌成纤维细胞体外培养及鉴定的技术方法。
方法：从将进行心脏手术患者体内取右心耳组织，用胰蛋白酶消化法消化分离细胞，再通过差速贴壁分离法收集心肌成纤维细胞，用含20%胎牛血清的DMEM培养液进行培养并传代，光学显微镜下观察心肌成纤维细胞基本形态特征的变化，波形蛋白(Vimentin)，α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)，Ⅷ因子(VWF) 抗体对细胞进行免疫荧光鉴定。
结果：形态学观察和免疫荧光鉴定显示，成功培养心肌成纤维细胞，纯度达95%以上。
结论：胰蛋白酶消化法结合差速贴壁分离法及免疫荧光鉴定是一种简单有效的人心肌成纤维细胞培养方法。
建立了一种纯度较高且保存了成纤维细胞自身增殖能力特点的人心肌成纤维细胞体外培养模型。
【关键词】心肌成纤维细胞原代培养胰蛋白酶消化法差速贴壁分离法免疫荧光【中图分类号】R39 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2014）30-0052-03心肌纤维化是各种心血管疾病发生、发展到一定阶段的共同病理改变，是心肌重构的主要表现之一，而心肌成纤维细胞在这一过程中发挥着极其重要的作用。
当前，心肌成纤维细胞体外实验研究模型主要集中建立在动物的心肌，人的心肌成纤维细胞体外实验研究模型鲜有文献报道。
我们参照Neuss等学者差速贴壁分离和培养人心脏成纤维细胞的方法[1]，采用胰蛋白酶消化法结合差速贴壁分离法，成功分离培养出人心肌成纤维细胞，摸索出一种纯度较高且保存了成纤维细胞自身增殖能力特点的人心肌成纤维细胞体外培养方法，为人心肌纤维化研究及人心肌成纤维细胞增殖模型的建立提供了一种方法，现作报道。
一、材料与方法（一）、材料:取福建省立医院建立体外循环将进行心脏手术患者心脏停跳前的右心耳组织约30mg，放入置于冰面上盛有PBS的无菌培养皿并立即送入实验室进行下一步细胞分离培养。
（二）、主要试剂及配制胰蛋白酶（美国Amersco公司），DMEM高糖培养基（美国Gibco公司），胎牛血清（美国Hyclone），免疫荧光染色试剂盒-抗小鼠cy3（碧云天生物技术研究所），免疫荧光染色试剂盒-抗兔FITC（碧云天生物技术研究所），V2258小鼠波形蛋白单克隆抗体（美国Sigma公司），A2547小鼠α-SMA单克隆抗体（美国Sigma公司），F3520兔VWF抗体（美国Sigma公司）。
血管成纤维细胞原代细胞提取培养
血管成纤维细胞分离与培养一、实验动物8-10周龄C57小鼠10只。
大鼠二、试剂及配制高糖DMEM、0.25%胰蛋白酶, 胎牛血清、青霉素-链霉素混合液。
培养液: 10%DMEM培养基：FBS：双抗 100：10：1（45ml：5ml：0.5ml）20%FBS DMEM三、实验仪器超净工作台、CO2培养箱、光学倒置显微镜、离心机四、组织分离与贴壁1、将小鼠于75%乙醇缸中浸泡5ｓ, 转移至超净台。
用大头针将其固定在无菌的泡沫板上, 用75%乙醇消毒胸、腹部皮肤。
2、取2把弯镊子撕开皮肤, 充分撕拉开, 再用乙醇棉签消毒。
用眼科虹膜剪沿剑突处正中线向上剪开胸骨, 沿正中线向下剪开腹膜，将腹部内脏拨至一旁，充分暴露主动脉，从肾动脉分支处直至心脏剪下, 取出心脏及主动脉, 置于盛预冷PBS液的培养皿中。
3、将鼠心脏主动脉全部取出后, 剪去心房心脏、剔除主动脉上脂肪，预冷ＰＢＳ液清洗3次, 去除血污。
4、纵向剖开血管腔，血管内膜面朝上铺于培养皿上，手术剔除内膜和中膜，PBS漂洗余下半透明血管外膜。
5、贴块法：将血管外膜转移至20%FBS DMEM中，剪成约1mm3的小块，吸弃多余的培养基，培养皿底面朝上置于37℃5%CO2培养箱，干涸4-6h，待组织块贴壁后，将培养皿慢慢翻转放平，滴加含有20%FBS DMEM培养基，使培养液完全浸泡组织块，置于37℃，5%CO2培养箱，每2天换培养液1次，待细胞生长达融合状态（7-10天），胰酶消化传代10%DMEM。
6.胰酶消化法：？五、细胞形态学观察和免疫荧光鉴定成纤维细胞：波形蛋白，内皮细胞：CD31,平滑肌细胞1：分离血管内中外膜比较费时，可以先在显微镜下练习，然后肉眼练习，再到超净台内练，动作尽量要熟练轻柔，避免牵拉过度。
2：剪的组织块要小，最好能小于1*1mm。
可以用刀片切。
3：贴壁距离要小，比5mm*5mm小，可以一次把培养液加到5~7ml，等估计贴牢时可以直接翻瓶。
实验一-鸡胚成纤维细胞的培养
02
实验过程中，细胞形态和生长曲线的变化符合预期，表明实验
操作和Байду номын сангаас件控制得当。
传代培养后细胞稳定增殖，表明所使用的培养基和条件能够支
03
持鸡胚成纤维细胞的正常生长。
对实验的改进和展望
在未来的实验中，可以尝试优化培养基的成分，以提高细胞的生长速度和活性。
可以进一步研究不同条件对鸡胚成纤维细胞生长和功能的影响，如温度、pH、气体 环境等。
了解细胞培养的基本原理和操作流程
掌握细胞生长和增殖 的基本原理，了解细 胞周期和细胞分裂的 过程。
了解细胞培养过程中 的注意事项和安全措 施。
熟悉细胞培养的基本 流程，包括原代细胞 的培养和传代细胞的 继代培养。
学习细胞培养的实验设计和数据分析方法
01 学习如何设计细胞培养的实验方案，确定实验参 数和对照组设置。
实验一-鸡胚成纤维 细胞的培养
目 录
• 实验目的 • 实验原理 • 实验步骤 • 结果分析 • 实验结论
01
CATALOGUE
实验目的
掌握鸡胚成纤维细胞的培养技术
01
掌握细胞培养的基本操作，如细胞分离、传代、计 数等。
02
熟悉细胞培养所需的仪器和试剂，如显微镜、细胞 培养皿、胰蛋白酶等。
03
了解细胞培养的环境条件，如温度、湿度、气体等 。
细胞形态的观察结果分析
总结词
观察鸡胚成纤维细胞的形态变化，分析 细胞形态与细胞功能的关系。
VS
详细描述
在实验过程中，通过显微镜观察鸡胚成纤 维细胞的形态变化，记录细胞的形态特征 。通过对比不同培养时间的细胞形态，可 以分析细胞形态与细胞功能的关系，进一 步了解细胞的生理状态和变化规律。
成纤维细胞培养
人皮肤成纤维细胞库的构建试剂：胶原酶(Sigma),优质胎牛血清(GibCo),胰蛋白酶(Sigma),中性蛋白酶(Sigma),DMEM培养基(Sigma),二甲基亚碉(MerCk)O配液:成纤维细胞培养基配制:DMEM1.Og,NaHC033.7g,HEPES2.4g,优质胎牛血清IOOn1.1,青霉素IOoOoOU,链霉素IOoOOOU,超纯水加至IoOOm1,用INNaOH调PH值至7-2〜7.4,0.22Pan孑1.滤膜过滤除菌，90m]/瓶分装，一20℃贮存备用。
D-Hanks平衡盐液：NaC1.8.0g,KC1.0.4g,Na2HPO4∙12H：0134.4mg,KH~P040.06g,NaHC030.35g,酚红0.02g,青霉素IO(X)OOU,链霉素IooooOU,超纯水加至1OOorn1,用INNaoH调PH值至7.2-7A,0.22tun孔滤膜过滤除菌，90m1./瓶分装，一20C贮存备用。
方法:乙醇棉球将标本用力擦拭3遍；标本移至培养皿中，用D-Hanks平衡盐液反复用力彻底冲洗标本5遍，直至标本发白，轻度发胀；在培养皿中修剪皮下筋膜组织及多余的皮下脂肪，将标本剪成0∙3cmx2.Oem大小的皮条，置于培养皿中，加0.25%胰蛋白酶浸没组织，4°C冰箱中消化14~16h,以用眼科镣能轻轻揭下表皮为度；消化后的标本置于超净工作台上。
吸出胰蛋白酶，用DMEM漂洗2遍，中止胰蛋白酶消化作用；用眼科镜轻轻揭下表皮，置于另一培养皿中(用于培养角质形成细胞)，真皮置于培养皿中，用眼科剪将真皮成分剪成糊状(组织大小约为0.1CmXo.1CmX0.1cm),加入0.2%胶原酶浸没组织，37。
C孵箱中消化1.~4h,以将组织基本上消化散开，看不到组织块为度；力IW-HankS平衡盐液1500#Inin离心5min,5遍，以洗去胶原酶，沉淀即为成纤维细胞，弃上清，力口DMEM制成细胞混悬液，接种至50In1.培养瓶中，置37°C、5%C0：、湿度95%的CO孵箱中培养131。
人真皮成纤维细胞的分离培养及鉴定
人真皮成纤维细胞的分离培养及鉴定作者：马英智张丽红孙梅李玉林【摘要】目的对人真皮成纤维细胞(hFbs)进行分离培养及鉴定，为组织工程复合皮肤的构建提供种子细胞。
方法利用组织块培养法、消化传代纯化培养hFbs，通过细胞形态的观察及免疫细胞化学、流式细胞术等方法对其进行鉴定。
结果经组织块培养法获得的细胞可以传代培养，从P1代到P6代细胞形态保持一致，呈纤维细胞样生长;免疫细胞化学检测可见波形蛋白(vimentin)呈阳性反应，通过流式细胞术检测P3及P6代的细胞vimentin阳性表达量均达到95%以上，角蛋白15(cytokeratin 15)呈阴性表达。
结论成功建立体外稳定培养hFbs 的方法，为组织工程皮肤的研究提供了理论与实验基础。
【关键词】成纤维细胞;分离;培养;鉴定【Abstract】Objective To explore a method of the isolation, culture and identification of human fibroblasts (hFbs) in vitro for the provision of seed cells in tissue engineering skin. Methods The cells were cultured and expanded and observed under phase contrast microscope, and they were identified with immunocytochemistry and flow cytometry (anti vimentin, cytokeratin 15). Results With phase contrast microscope, the cells were observed to uniformed population of cells and fibroblast like. Immunocytochemistry and flow cytometry showed all cultural cells were fibroblasts (positivefor vimentin, negative for cytokeratin 15). The cells were sub cultured 6 generations. Conclusions A method for isolating and culturing hFbs in vitro is established successfully.【Key words】Fibroblasts;Isolation;Culture;Identification成纤维细胞是构成皮肤真皮的主要细胞，其正常的增殖、分化维系着皮肤正常的结构和生理功能。
鸡胚成纤维细胞的原代培养
鸡胚成纤维细胞的原代培养171850044生拔钱诗晨一、背景知识1.1原代培养与传代培养1.1.1原代培养是指直接从生物体取材（细胞、组织或器官）进行的第一次培养（中途不分割培养物、不更换培养物的生长器皿）。
1.1.2传代细胞培养分割细胞培养物进行的再配养注：细胞培养的代不是指细胞分裂次数，而是指培养的次数1.2细胞体外培养要求的条件✓无菌✓适宜温度：哺乳动物细胞36.5℃ 0.5℃，植物细胞原生质体25℃左右✓生理渗透压✓适宜酸碱度：7.2-7.4✓气体：95%空气+5%二氧化碳✓培养基：提供水、各种有机营养（糖、氨基酸、维生素等）及无机盐、生长调节因子等1.3培养细胞生长类型悬浮型：培养时不黏附于支持物之上。
而呈现悬浮生长的细胞。
贴壁型：培养时需要黏附于一定固相支持物表面才能很好生长的细胞。
又称黏附依赖型细胞（分如下四类）✧成纤维细胞：胞体呈梭形或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质突起，生长时呈放射状。
✧上皮型：细胞呈扁平不规则多角形，中央有圆形核，细胞彼此紧密相连成单层膜。
✧游走型：呈散在生长，一般不连成片，胞质常突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规则。
此型细胞不稳定，有时难以和其他细胞相区别。
在一定条件下，如培养基化学性质变动等，它们也可能成纤维细胞形态。
✧多形型：是一些形态上不规则的细胞。
细胞一般分胞体和胞突两部分，胞体呈不规则多边形，胞突呈细长丝状。
如神经元和神经胶质细胞1.4原代细胞培养的一般办法1.4.1植块培养法直接将组织块接入培养皿底部，待组织块贴牢在底部后再加入培养基培养的方法1.4.2离散细胞培养法用酶消化组织，使细胞之间连接破坏，将组织离散成单细胞悬液进行培养的方法注：原代培养中的植块培养法与组织培养不是一回事；植物组织培养又叫离体培养，指从植物体分离出符合需要的组织、器官或细胞、原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。
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成纤维细胞的培养
1前言
成纤维细胞（fibroblast）是疏松结缔组织的主要细胞成分，细胞呈梭形或扁的星状，具有突起。
根据不同的功能活动状态，将细胞分为成纤维细胞和纤维细胞二型：成纤维细胞乃是功能活动旺盛的细胞。
成纤维细胞是结缔组织中最常见的细胞，由胚胎时期的间充质细胞(mesenchymal cell)分化而来。
在结缔组织中，成纤维细胞还以其成熟状态—纤维细胞(fibrocyte)的形式存在，二者在一定条件下可以互相转变。
不同类型的结缔组织含成纤维细胞的数量不同。
通常，疏松结缔组织中成纤维细胞的数量比同样体积的致密结缔组织中所含成纤维细胞的数量要少，故分离培养成纤维细胞多以真皮等致密结缔组织为取材部位[1,2]。
成纤维细胞的分离培养一开始并不涉及成骨作用，而主要是用于研究细胞的老化、各种外来因子对细胞的损伤、细胞在体外条件下的恶性转化、以及某些先天性代谢异常、酶缺陷等。
由于皮肤成纤维细胞易于获取，又易于在体外生长，故目前皮肤成纤维细胞培养已在基础医学和临床医学研究中得到较广泛的运用，其分离培养技术已相对成熟，对其体外生长规律也有了较全面的认识。
成纤维细胞的原代培养可用酶消化法或组织块法，其中组织块法又因其操作简便、条件易于控制而应用更为普遍[3]。
2材料和方法
2.1材料
玻璃器材：细胞培养瓶、500ml盐水瓶、青霉瓶、刻度吸管
塑料器材：细胞培养板
橡胶器材：细胞培养瓶胶塞、青霉素瓶塞、翻口胶塞和胶管
滤器；玻璃漏斗、微孔滤膜
2.2试剂的配制
水、0.4%酚红液、Hank’s液、MEM、无钙PBS液、双抗的配制、NaHCO3配制、新生犊牛血清（FCS)、原代和传代细胞分散液、3％谷氨酰胺、细胞生长液和细胞维持液、其他液体；洗液、无钙PBS胰酶液、Hank's液、
2.3方法
2.3.1试剂配制
（1）细胞分散液：无钙胰蛋白酶加4倍无菌蒸馏水
（2) 组织冲洗液：无血清MEM
（3）细胞生长液：含10％FCS MEM
2.3.2实验分配：每人1枚鸡胚，每人制备1瓶100mL培养瓶细胞。
2.3.3细胞制备过程
碘酊消毒气室处蛋壳，去除蛋壳，撕开壳膜、尿囊膜和羊膜，取出鸡胚，用无血清MEM 冲洗3次，将鸡胚置于无菌平皿内，去除头、四肢和内脏，并将胚体置于另一个平皿内，用无血清MEM冲洗3次，剪碎胚体，静止片刻，吸净上清，加入5－10倍无钙胰蛋白酶，并吸入于无菌青霉素小瓶内，用橡皮膏封严瓶口，37 ℃消化至细胞呈毛球样，吸净消化液，加入细胞生长液，将细胞置于细胞培养瓶中，并用大口吸管吹打细胞使之充分分散，分装2个细胞培养瓶内。
4、换液或接毒
细胞于37℃培养过夜，次日换细胞维持液，或单层接种病毒，每日观察CPE。
5、病毒的收获
CPE达到75％时，冻于冰柜内收获。
6、病毒鉴定
（1）免疫学鉴定：HA
3结论
免疫学鉴定的效价是28
4讨论
CEF细胞的制备一般选用9日龄~11日龄的SPF鸡胚,鸡胚日龄不宜过大,否则剪碎组织时候较为困难,而且杂细胞也会较多。
分离CEF的方法主要是以胰蛋白酶和胶原酶的酶消化法为主。
胰蛋白酶适用于消化细胞间质较少的软组织，其消化效果主要与pH、温度、胰蛋白酶的浓度、组织块的大小和硬度有关,钙、镁离子和血清均对该酶有抑制作用。
胶原酶适用于消化纤维性组织、上皮组织以及癌组织等,在钙、镁离子和血清存在的情况下仍具有活性,因此使用该酶消化后需要清洗细胞。
相对于胰蛋白酶,胶原酶的价格昂贵,增加了试验成本,所以研究中胰蛋白酶应用最为广泛[4]。
参考文献
[1]徐荣辉，饶寒敏，朱雅萍，等.皮肤成纤维细胞在体外培养中的成骨作用.中华外科杂志[J],
1994，32(3)：190
[2]饶寒敏，徐荣辉，朱雅萍，等.家兔皮肤成纤维细胞在体外培养中的成骨作用(显微录象与
四环素标记观察)[J].中华骨科杂志，1995，15(5)：295
[3]百度百科.[2010-6-23]./view/88142.htm?fr=ala0_1.
[4]朱国坡，周晓丽，郭延峰，等.鸡成纤维细胞原代培养及应用[J].动物医学进展，
2010，31(3)：114-116.。