雄黄遗传毒性的研究

雄黄遗传毒性的研究

【摘要】目的评价雄黄的急性毒性和遗传毒性，为临床提供毒理学依据。方法急性毒性：设3.50、2.98、2.53、2.15、1.83、1.55g/kg剂量组灌胃，对照组给予等体积的0.5%羧甲基纤维素钠溶液(sodium carboxymethyl cellulose，cmc)。ames试验：设雄黄浸出液原液、1：1、3：1、7：1和15：1稀释作为中、低、次低和最低剂量组，各剂量组均加不同浓度的雄黄浸出液0.5ml，观察加或不加s9混合物对ta 97、ta 98、ta 100、ta 102、ta1535菌株的影响。小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验：设1、0.5、0.25g/kg 三个剂量组，2次灌胃后，24h制片，镜检。chl细胞染色体畸形试验：设雄黄浸出液1：15、1：31、1：63稀释液三个剂量，加药后将细胞放入co2培养箱中37℃培养24-48小时。终止培养前4小时，每只细胞培养皿中加入秋水仙素溶液0.1ml，收获细胞，制染色体标本、镜检。结果急性毒性试验表明：本次实验雄黄的ld50为2.069g/kg。ames试验：为阴性结果，雄黄有抑制细菌生长的作用。雄黄对小鼠骨髓嗜多染红细胞有致突变作用和对chl细胞染色体有致畸变作用。结论本次试验中该批次的雄黄有一定的遗传毒性。【关键词】雄黄；遗传毒性；急性毒性

雄黄（realgar）是矿物类中药，主要成分为三硫化二砷（as2s3）。现代药理学证明雄黄具有抗肿瘤、镇痉、止痛、杀虫和抗菌等功效［1］。长期以来中医认为雄黄有毒，内服宜慎，不可久用，孕妇禁

用，因此雄黄一直作为有毒中药受到药监部门的严格控制。雄黄含有对人体有害元素砷，临床上亦有过量服用而中毒的报道［2］。对雄黄的毒理学研究发现，雄黄具有肝肾毒性［3-4］，但是否具有遗传毒性报道不多，为此我们用小鼠骨髓细胞微核试验(micronucleus tes，mt)、chl细胞染色体畸变试验(in vitro mammalian cells chromosome aberration test)和鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验（the rat typhoid salmonella mutate back test，ames）对雄黄进行遗传毒性研究。1 材料

1.1 实验动物 icr小鼠35-38g；由上海斯莱科动物有限公司提供［实验动物生产许可证号：scxk（沪）2007-0005。动物购入后，均饲养在清洁级动物实验室内，温度控制在20-25℃，湿度控制在40-70%。动物自由摄食、饮水，1周换1-2次垫料。ames标准实验菌株，实验前对各个菌株性状进行鉴定。由上海市疾控中心赠与。chl细胞株，由上海中科院药物所赠与。

1.2 主要仪器及试剂

1.2.1 motic ba400生物显微镜。

1.2.2 主要试剂雄黄，产地湖南，由上海封浜中药饮片厂加工炮制成饮片为橙黄色细粉末，批号为h2007052401。羧甲基纤维素钠（cmc-na）批号f20090508；环磷酰胺，批号9j596a；giemsa染液及其他试剂均为国产分析纯。2 方法

2.1 实验方法

2.1.1 小鼠急性毒性试验 icr小鼠70只，体重20-24g，雌雄各半，采用随机分组法将小鼠分为7个组，雄黄各剂量组间距比设为1：0.85依次递减。空腹灌胃1次，观察2周。

2.1.2 小鼠骨髓微核试验［5］ icr小鼠30只，体重35-38g，将小鼠分为5组，雄黄给药组剂量分别为0.25、0.5、1g/kg，阳性对照组为环磷酰胺80mg/kg，（给药一次）阴性对照组为等量羧甲基纤维素钠溶液（0.5%cmc），分2次灌胃，给药后24h处死小鼠，取一侧股骨骨髓材料制片、染色、镜检阅片，每片检测2000个嗜多染红细胞，计数微核数，求出各组微核率(mnf)，并进行显著性检验。

2.1.3 chl染色体畸变试验［6］将1g生药溶解于10ml的hbss 中形成混悬液，37℃水浴摇床以100转/分水浴震荡4小时后静止20小时，取上清液过滤后制成雄黄浸出液备用。将不同稀释度的雄黄浸出液（1：15、1：31、1：63稀释）加入到单层chl细胞上，将细胞放入co2培养箱中37℃培养24-48小时。终止培养前4小时，每只细胞培养皿中加入秋水仙素溶液0.1ml，使其终浓度达到0.2μg∕ml。然后收获细胞，制染色体标本。在光学显微镜下观察染色体中期分裂相，分别记录染色体的结构畸变，数目畸变（多倍体）以及畸变细胞数和畸变类型，分析判断在体外雄黄对chl细胞的染色体畸变作用。本试验同时设立阴性对照（dmso）和阳性对照（非活化阳性对照丝裂霉素c）。

2.1.4 ames［7］试验鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型突变菌株ta 97、ta 98、ta 100、ta 102，1535菌株性状和s9活性经鉴定，符合要求，采用平皿掺入法，加s 9与不加s 9进行两次独立试验，设5个剂量，每组做3个皿。

2.2 统计分析采用spss1

3.0统计软件进行分析。计数数据用卡方检验，计量数据用方差分析进行比较。以p20%，明显高于阴性对照组（p<0.01），表明本测试系统符合测试要求、稳定可靠，详见表3、4。

表3 雄黄染色体畸变试验结果（24小时，-s9mix）

tab.3 the realgar chromosome aberration test results （24小时，-s9mix）

组别观察中期相

染色体细胞数染色体结构畸变细胞数

裂隙断裂缺失断片环状粉碎化三辐体四幅体

染色体数

目畸变数染色体

畸变率% 染色体结

构畸变率

多倍体判定结果

阴性对照

（dmso） 200 6 1 0 2 0 0 0 0 0 1.5 -

阳性对照

（mmc） 200 14 26 9 12 0 0 1 0 0 24* * ++

阴性血清 200 4 0 0 0 0 0 0 0 1 0 -

雄黄浸液低 200 9 6 8 7 2 0 2 0 0 12.5* * -

雄黄浸液中 200 21 20 9 9 0 0 1 0 0 19.5* * -

雄黄浸液高 200 14 17 5 18 0 1 0 0 0 20.5* * -

注：1、主要以不含裂隙的结构畸变率来判定结果（裂隙一般仅作为参考指标，而数目畸变单独列出评价，不计在畸变率中），“-”表示阴性，“+”表示阳性，“++”表示强阳性，并各试验组畸变率分别与阴性对照组（dmso）进行χ2检验分析，*p<0.05，* *p<0.01。

2、一个细胞的染色体出现两种以上的结构畸变。统计时按一个计算。

表4 雄黄染色体畸变试验结果（48小时，-s9mix）

tab.4 the realgar chromosome aberration test results （48小时，-s9mix）

组别观察中期相

染色体细胞数染色体结构畸变细胞数

裂隙断裂缺失断片环状粉碎化三辐体四幅体

染色体数

目畸变数染色体

畸变率% 染色体结