不同西瓜品种枯萎病抗性鉴定方法比较

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7716_fon 引物序列为:5'-TTAAAAATCATCTC鄄 CTCTTTAAAACTATT -3',5' -ATATATTTGGTCTC鄄 CGAGTGTTCAA-3'。
2 结果与分析
2.1 枯萎病抗性分析 用中国西瓜主产区当前分布最广的尖孢镰刀
菌西瓜专化型 1 号生理小 种 (FON-1)对供试的 20 个西瓜品种进行苗期枯萎病接种鉴定, 结果表明
张国良等[12]研究指出,西瓜枯萎病抗性遗传可能 受多基因控制,不同资源材料其抗病基因可能各不相 同。 随着西瓜全基因组信息的 公布[13],西瓜在 进化 过程中也丢失了部分抗病基因。 本研究利用与西瓜 枯 萎 病 抗 性 基 因 (Fon-1) 紧 密 连 锁 的 CAPS 标 记
M W-1 W-2 W-3 W-4 W-5 W-6 W-7 W-8 W-9 W-10 W-11 W-12 W-13 W-14 W-15 W-16 W-17 W-18 W-19 W-20
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JOURNAL OF CHANGJIANG VEGETABLES
植保研究 2015.12
品种代号 W-1 有籽 W-2 无籽 W-3 大果 W-4 无籽 W-5 小果 W-6 大果 W-7 大果 W-8 小果 W-9 大果 W-10 无籽
表 1 20 个西瓜品种的接种鉴定结果与分子检测结果比较
西瓜抗枯萎 病育种工 作 早 在 1902 年 即 开 展 ,
第一个抗病品种 Conqueror 是通过对枸橼西瓜的抗 性 转 育 育 成 , 此 后 ,Calhoun Gray、Jubilee、Crimson Sweet、Summit、Smokylee 等抗病 性 强 的 品 种 相 继 问 世[11]。 近年来,随着设施农业的迅速推广,连作障碍 成为西瓜生产的主要制约因子。 因此,西瓜育种家 把抗枯萎病作为了最重要的选育性状之一。 本研究 中所引进的品种包括了 5 个无籽西瓜、11 个有籽西 瓜和 4 个小果型西瓜品种。 通过枯萎病苗期接种鉴 定发现,4 个小果型西瓜品种均感枯萎病;无籽西瓜 中 1 个表现为高抗、1 个表现为中抗、3 个表现为轻 抗; 而有籽西瓜中 8 个表现为高抗、1 个表现为中 抗、2 个表现为轻抗。 不同类型的西瓜品种抗性差 异明显,推测原因是,现今小果型西瓜品质与枯萎 病性状并存的抗性亲本材料依然偏少,未能在育种 中得到很好的运用。 因此,利用分子标记辅助选择 技术对优良性状基因进行聚合,选育优良性状材料 是重要的趋势。
②DNA 提取 待接种后 7 d 进行单株取样,采 取 CTAB 法提取基因组 DNA[10]。
③PCR 反应体系 均采用 12 μL,包括 1.2 μL 10×Buffer(含 Mg2+),1 μL 2.5 mmol/L dNTPs,1 μL 10 μmol/μL 引物,0.2 μL 5 U/μL Taq DNA 聚合酶, 2 μL 30 ng/μL 模板 DNA,用去离子水补足至 12 μL。 引物 7716_fon 为张屹等[8]已发表的西瓜抗枯萎病基 因分子标记,由上海生工生物技术公司合成。
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2.2
65.0
LR
+/-
W-19 大果
4.4
22.6
MR
+/-
W-20 大果
0
抗性类型 LR HR S HR LR LR S HR HR HR
分子检测 +/+ +/+/+/-
(表 1),20 个品种对枯萎病表现出不同抗性。 其中, 9 个品种表现为高抗(HR,枯萎病病株率 0~20%), 占 总 数 的 45%;2 个 品 种 表 现 为 中 抗 (MR,枯 萎 病 病株率 21%~50%), 占总数的 10%;5 个品种 表现 为轻抗 (LR, 枯萎病株率 51%~80%), 占总 数 的 25%;而表现为感病(S,枯萎病病株率 80%以上)的 品种有 4 个,占总数的 20%。 2.2 抗病基因分子检测
molecular weight plant DNA [J]. Nucleic Acids Research, 1980, 8(19): 4 321-4 325. [11] 张 屹 ,魏 林 ,许 勇 ,等.西 瓜 枯 萎 病 的 研 究 进 展[J].湖 南 农 业 科 学 ,2013(5):67-70. [12] 张 国 良 ,王 春 生 ,杨 坤 ,等.西 瓜 枯 萎 病 抗 性 材 料 的 转 育 及 其 遗 传 规 律 的 研 究 [J].安 徽 农 业 科 学 ,1999,27(6):616618. [13] Guo S G, Zhang J G, Sun H H, et al. The draft genome of watermelon (Citrullus lanatus) and resequencing of 20 diverse accessions[J]. Nature Genetics, 2012, 45: 51-58.
利 用 CAPS 标 记 7716_fon 对 20 个 西 瓜 品 种 Fon-1 基因进行分子检测。 结果表明(图 1),有 12 个品种能扩增出 170 bp 的特异带, 基因型鉴定表 现为抗枯萎病品种;8 个品种仅能扩增出 104 bp 的 特异带,基因型鉴定表现为感枯萎病品种。 2.3 田间枯萎病接种鉴定与分子鉴定结果比对
1 材料与方法
1.1 试验材料 供试西瓜为湖南省西瓜甜瓜研究所引进的杂
交品种 20 个,其中包括有籽西瓜、无籽西瓜和小果 型西瓜 3 类。
基 金 项 目 :国 家 “863”项 目 (2011AA10A205);湖 南 省 现 代 农 业蔬菜产业技术体系专项
张 屹 (1987-),男 ,实 习 研 究 员 ,方 向 为 分 子 遗 传 育 种 , E-mail:zhang383399789yi@126.com
参考文献 [1] 徐润芳,杨鼎新.我国西瓜抗枯萎病育种的进展与前景[J].
中 国 西 瓜 甜 瓜 ,1992(1):2-5. [2] 周凤珍,康国斌.西 瓜 部 分 抗 枯 萎 病 材 料 的 抗 性 遗 传 研 究
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梁志怀(1968-),男,通信作者,博士,副研究 员 ,主 要 从 事 植 物病害生物防治的研究
收 稿 日 期 :2015-04-08
供试病原菌为西瓜枯萎病菌 1 号生理小种 (FON-1),由 北 京 农 林 科 学 院 蔬 菜 研 究 中 心 西 瓜 课 题组许勇老师惠赠。 1.2 试验方法
①接种鉴定方法 参照耿丽华等[9]报道的西瓜 苗期接种鉴定方法, 于 2014 年 5~7 月在湖南省西 瓜甜瓜研究所基地大棚内进行。 供试西瓜材料按编 号播种于灭菌的沙子中,当西瓜幼苗长至 2 叶 1 心 时, 置于孢子浓度为 5×106 个/mL 的西瓜枯萎病病 菌悬浮液中接种 15 min。 每个品种设置 3 个重复, 分别调查病株率。
detection of Fusarium oxysporum f. sp. niveum and Mycosphaerella melonis in infected plant tissues and soil [J]. FEMS Microbiol Lett, 2005, 249(1): 39-47. [4] 张兴平,王鸣.我国西瓜枯萎病生理小种分化研究初报[J]. 中 国 西 瓜 甜 瓜 ,1991(1):39-43. [5] Xu Y, Ou Y X, Zhang H Y, et al. Identification of a RAPD
200 bp
170 bp
100 bp
图 1 CAPS 标记(7716_fon)在参试西瓜品种中的扩增结果
104 bp
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7716_fon 进行验证发现,该标记的检测结果与苗期 接种鉴定结果吻合 , 而且以病 株率 70%为界限 对 抗、感枯萎病进行了有效区分。 但是,7716_fon 能检 测含有 Fon-1 基因 的品种对病 原菌表现的 抗病 性 程度差异, 我们初步认为是由于西瓜的抗源不同, 导致与其相关联的生长势、生物量存在差异,进而 影响其抗性反应表现。 本研究首次利用分子标记对 西瓜枯萎病发病率进行了定性分析, 并将病株率 70% 定 义 为 感 抗 界 限 ,可 以 加 快 西 瓜 抗 性 育 种 的 进 程,为快速进行栽培品种的抗性分子改良提供了一 条有效的技术途径。
中 图 分 类 号 :S651
文献标识码: A
文 章 编 号 :1001-3547(2015)12-0050-03
西瓜枯萎病是由西瓜枯萎病菌(Fusarium oxys鄄 porum f. sp. niveum,FON)侵 染 所 致 的 土 传 维 管 束 病害,是严重制约西瓜生产的病害之一 。 [1~3] 已有文 献报道, 尖孢镰刀菌西瓜专化型生理小种有 4 个, 0、1、2 和 3, 其 中 ,1 号 生 理 小 种 在 我 国 致 病 力 最 强、存在范围最广[4]。 因此,以 1 号生理小种为病原 菌株,开展西瓜品种枯萎病抗性评价具有很强的代 表性。 随着分子生物学的发展,研究者们已对西瓜 枯萎病病菌 1 号生理小种的抗病基因(Fon-1)进行 定 位[5~8],并 利 用 已 开 发 的 分 子 标 记 开 展 不 同 西 瓜 新 品种 Fon-1 基因的分布调查,为西瓜新品种抗性鉴 定提供了重要的依据。 本文通过对 20 份不同类型 西瓜品种进行抗枯萎病室内人工接种鉴定与分子 检测分析,以期为西瓜抗病分子育种和抗源筛选提 供参考。
利用国内西瓜枯萎病病菌优势小种对引进的 20 个 西 瓜 品 种 进 行 抗 性 鉴 定 及 分 子 检 测 结 果 对 比 ,结 果 显 示 (表 1、 图 1),CAPS 标 记 7716_fon 可 以有效区分抗、感枯萎病材料,其结果与抗性鉴定 结果吻合,并将病株率 70%定性为感抗界限。
3 讨论与结论
摘 要:以 20 个不同类型的西瓜品种为试验材料,采用室内苗期人工接种鉴定方法和分子标记检测方法进行比对, 研究不同西瓜品种对枯萎病的抗性差异及不同鉴定方法之间的关系。 试验结果表明,人工接种鉴定与分子检测方法 鉴定结果基本吻合,CAPS 标记(7716_fon)可以将西瓜抗、感枯萎病的界限有效定性为病株率 70%。 关键词:西瓜;枯萎病;分子标记检测;人工接种鉴定
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
平均病株率/% 抗性类型
分子检测
品种代号 平均病株率/%
0
HR
+
W-11 大果
78.8
75.8
LR
-
W-12 大果
0
38.9
MR
+/-
W-13 小果
81.3
19.1
HR
+/-
W-14 大果
0
89.4
S
-
W-15 无籽
75.5
0
HR
+
W-16 无籽
79.1
0
HR
+
W-17 小果
91.3
93.3
S
-
W-18 大果
植保研究 2015.12 DOI:10.3865/j.issn.1001-3547.2015.12.019
JOURNAL OF CHANGJIANG VEGETABLES
不同西瓜品种枯萎病抗性鉴定方法比较
张屹,刘建雄,梁志怀,李基光,张云 (湖 南 省 西 瓜 甜 瓜 研 究 所 ,长 沙 ,410125)
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