第十二章 细胞增殖极其调控(2)

Masui和Markert用解剖方法分离第Ⅵ期卵母细胞，并用孕酮进行体外刺激，诱 导卵母细胞成熟然后进行细胞质移植实验。他们发现，将孕酮诱导成熟的卵细 胞的细胞质注射到卵母细 胞中，可以诱导后者成熟； 再将后者的细胞质少量注 射到一些新的卵母细胞中， 这些新的卵母细胞仍被诱 导成熟；再将刚被诱导成 熟的卵细胞的细胞质少量 注射到另一些新的卵母细 胞中，仍然可以诱导卵母 细胞成熟(图12—33)。因 而他们认为，在成熟的卵 细胞的细胞质中：必然有 一种物质，可以诱导卵 母细胞成熟。他们将这种 物质称作促进成熟因子， 即MPF。
1983年Timothy Hunt首次发现海胆卵受精后，在其卵裂过程中两种蛋白质的 含量随细胞周期剧烈振荡，在每一轮间期开始合成，G2/M时达到高峰，M结束 后突然消失，下轮间期又重新合成，故命名为周期蛋白(cyclin)ห้องสมุดไป่ตู้ cyclin A， B）。后来在青蛙、爪蟾、海胆、果蝇和酵母中均发现类似的情况，各类动物来 源的细胞周期蛋白mRNA均能诱导蛙卵的成熟。用海洋无脊椎动物和两栖类的卵 为实验材料进行这类实验，好处在于卵的量比较大，而且在胚胎发育的早期，细 胞分裂是同步化的。
1988年M. J. Lohka 纯化了爪蟾的MPF，获得了微克级的 MPF，发现它是两种蛋白组成的复合体，经鉴定由32KD和45KD 两种蛋白组成，二者结合可使多种蛋白质磷酸化。后来Paul Nurse（1990）进一步的实验证明P32实际上是cdc2的同源物， 而P45是cyclin B的同源物，从而将细胞周期三个领域的研究联系 在一起。 2001年10月8日美国人Leland Hartwell、英国人Paul Nurse、Timothy Hunt因对细胞周期调控机理的研究而荣获诺贝 尔生理医学奖（图）。
1971年，Masui和Markert用非洲爪蟾卵做实验，非洲爪蟾卵细胞发育过程可以 划分为6个阶段，即第1、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、V和Ⅵ期。第1至Ⅳ期为卵母细胞生成和 生长阶段。第Ⅳ期卵母细胞达到一定体积，停止生长，等待成熟。此时的卵母 细胞处于第一次减数分裂前期阶段，含有一个体积较大的细胞核，称为生发泡 (germinal vesicle，GV)。卵母细胞成熟需要雌性激素孕酮的刺激。在孕酮作用 下，卵母细胞向V和Ⅵ期转化，生发泡破裂(GV broken down，GVBD)，染色 体凝集，进行第一次减数分裂；然后立即进行第二次减数分裂，并停留在分裂 中期Ⅱ，即成熟的卵细胞(第Ⅵ期卵细胞)。卵细胞受精后，形成受精卵，很快 便开始卵裂 P423(图12—32)。
不仅同类M期细胞可以诱导PCC，不同类的M期细胞也可以诱导PCC产生， 如人和蟾蜍的细胞融合时同样有这种效果，这就意味着M期细胞具有某种促进 间期细胞进行分裂的因子，即成熟促进因子(maturation promoting factor， MPF)。 早在1960s，Yoshio Masui发现成熟蛙卵的提取物能促进未成熟卵的胚 胞破裂(Germinal Vesicle Breakdown，GVBD)，后来Sunkara将不同时期 Hela细胞的提取液注射到蛙卵母细胞中，发现G1和S期的抽取物不能诱导 GVBD，而G2和M期的则具有促进胚胞破裂的功能，它将这种诱导物质称为有 丝分裂因子(MPF)。后来在CHO细胞，酵母和粘菌中也提取出相同性质的 MPF。这类物质被统称为MPF。 MPF被发现以后，不少学者便着手MPF的纯化工作，但一直进展缓慢， 直到1988年，Maller实验室的Lohka等人以非洲爪蟾卵为材料，分离获得了 微克级的纯化MPF，并证明其主要含有p32和p45两种蛋白。p32和p45结合 后，表现出蛋白激酶活性，可以使多种蛋白质底物磷酸化。因而证明，MPF 是一种蛋白激酶。
二. P34cdc2激酶的发现及其与MPF的关系
细胞周期的各个时期都需要有各种不同的蛋白质，编码这些蛋白质的基因叫 细胞周期基因（cell-cycle genes），或细胞分裂周期基因（cell division-cycle genes, cdc），或cdc2基因，按发现的先后顺序，被命名为cdc2、cdc25、 cdc28。 1960s Leland Hartwell以芽殖酵母（图）为实验材料，利用阻断在不同细胞周 期阶段的温度敏感突变株（在适宜的温度下和野生型一样），分离出了几十个 与细胞分裂有关的基因(cell division cycle gene，cdc)，被称为cdc基因。如 芽殖酵母的cdc2基因，在G2/M转换点发挥重要的功能。Hartwell还通过研究 酵母菌细胞对放射线的感受性，提出了checkpoint（细胞周期检验点）的概念， 意指当DNA受到损伤时，细胞周期会停下来。 1970s Paul Nurse等人以裂殖酵母（图13-17）为实验材料，同样发现了许多 细胞周期调控基因，如：裂殖酵母cdc28、cdc25的突变型和在限制的温度下 无法分裂；wee1突变型则提早分裂，而cdc25和wee1都发生突变的个体却会 正常地分裂（图13）。进一步的研究发现cdc2和cdc28都编码一个34KD的蛋 白激酶，促进细胞周期的进行。而weel和cdc25分别表现为抑制和促进CDC2 的活性。这也解释了为何cdc25和wee1双重突变的个体可以恢复野生型的表型。 Hartwell和Nurse等人筛选出一些细胞增殖所必须的基因，其中有一个基因在 G1/S和G2/M转换处是必不可少的，若使它功能失活，细胞就会停滞在转换处， 不能进入下一个时期，这个基因在裂殖酵母中被称为cdc2（在牙殖酵母中的同 源基因称为cdc28），其表达产物具有激酶的活性。
第三节 细胞周期的调控 一、MPF的发现极其作用 Rao和Johnson(1970、1972、1974)将Hela细胞同步于不同阶段，然后与M 期细胞混合，在灭活仙台病毒介导下，诱导细胞融合，发现与M期细胞融合的 间期细胞产生了形态各异的早熟凝集染色体(prematurely condensed chromosome，PCC)，这种现象叫做早熟染色体凝集(premature chromosome condensation)。 G1期PCC为单线状，因DNA未复制。 S期PCC为粉末状，因DNA由多个部位开始复制，因此有大量的染色体片段。 G2期PCC为双线染色体，说明DNA复制已完成。 不同形态的PCC