7 亲和层析

②根据配体的特性进行测定 首先用适当的方法将配体和基质分离开， 首先用适当的方法将配体和基质分离开，然后根据各 种配体的特性，用相应的方法测定（在相同的条件下， 种配体的特性，用相应的方法测定（在相同的条件下， 用一定量的配体和未活化的基质混合液作标准对照， 用一定量的配体和未活化的基质混合液作标准对照，计 算出配体的含量） 算出配体的含量）
四、特异性吸附
当样品加入到已知的具有一定浓度的亲和层析柱时， 当样品加入到已知的具有一定浓度的亲和层析柱时，欲分离的大分子物 质就会逐步进入层析柱中，和配体结合成复合物；随着样品的加入， 质就会逐步进入层析柱中，和配体结合成复合物；随着样品的加入，复合物 的浓度越来越大，呈恒定增加。由于配体的存在， 的浓度越来越大，呈恒定增加。由于配体的存在，使样品中有效成分的移动 受到阻碍，从而形成紧密的复合物带， 受到阻碍，从而形成紧密的复合物带，由于不同组分与吸附剂的结合能力不 同，所以可得到分离和纯化 样品中有效成分在亲和吸附剂上的吸附量，除与它们之间的亲合力有关 样品中有效成分在亲和吸附剂上的吸附量，除与它们之间的亲合力有关 亲合力 还与样品的pH值 离子强度和反应时间有关 外，还与样品的 值、离子强度和反应时间有关 例1 图7-6，Sepharose-έ氨基乙酰 色氨酸甲酯亲和层析研究发现 ， 氨基乙酰-D色氨酸甲酯亲和层析研究发现 氨基乙酰 条件下， ①在高pH条件下，吸附剂对 胰凝乳蛋白酶的吸附量大 在高 条件下 吸附剂对α-胰凝乳蛋白酶的吸附量大 ②在高离子强度条件下，吸附剂对α-胰凝乳蛋白酶的吸附量小 在高离子强度条件下，吸附剂对 胰凝乳蛋白酶的吸附量小 亲和层析柱分离γ-球蛋白时 例2 用Con.A-Sepharose亲和层析柱分离 球蛋白时，上样后反应 比3h 亲和层析柱分离 球蛋白时，上样后反应1h比 得率高
CNBr是最常用的偶联剂，偶联过程分为基质的活化、偶联、去除未 是最常用的偶联剂，偶联过程分为基质的活化、偶联、 是最常用的偶联剂 结合配体、 结合配体、配体结合量的测定等步骤
1.活 化 1.活
将一定量的贮存基质用布氏漏斗抽干，然后加入等量的 将一定量的贮存基质用布氏漏斗抽干，然后加入等量的D.W 溶液（pH11~12），混匀 12）， 和2mol/L Na2CO3 溶液（pH11 12），混匀 称取适量固体CNBr（50~300mg/g贮存胶）， 300mg/g贮存胶），溶于二甲基甲酰 称取适量固体CNBr（50~300mg/g贮存胶），溶于二甲基甲酰 胺溶液中 活化：将溶好的 活化：将溶好的CNBr溶液加入琼脂糖悬浮液中活化 溶液加入琼脂糖悬浮液中活化 洗涤：将冷却的反应液转入布氏漏斗中， 洗涤：将冷却的反应液转入布氏漏斗中，用10~20倍体积的 倍体积的 预冷水及0.07mol/L 溶液（ 预冷水及0.07mol/L NaHCO3 溶液（pH8.5）洗涤 ）
3.洗 3.洗 涤
在基质和配体偶联后的溶液中加入用HCl调pH9.0的乙醇 调 在基质和配体偶联后的溶液中加入用 的乙醇 胺溶液，在搅拌下反应 胺溶液，在搅拌下反应15min，或在弱碱溶液中放置过夜， ，或在弱碱溶液中放置过夜， 或在Tris-HCl溶液，pH8.0，放置 ；然后室温条件下分别 溶液， 或在 溶液 ，放置2h； 溶液、 溶液、 溶液洗涤吸附剂， 用NaHCO3溶液、Na2B4O7溶液、NaCl溶液洗涤吸附剂，除 溶液洗涤吸附剂 去过剩的配体和乙醇胺
（1）直接测定法 ）
①2,4,6-三硝基苯磺酸钠的颜色试验 三硝基苯磺酸钠的颜色试验 在琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶的匀浆液中加入1ml饱和的硼 在琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶的匀浆液中加入 饱和的硼 酸钠溶液， 滴 三硝基苯磺酸盐水溶液， 酸钠溶液，3滴3%的2,4,6-三硝基苯磺酸盐水溶液，室温反 的 三硝基苯磺酸盐水溶液 应2h。不同的亲和吸附剂具有不同的颜色： 。不同的亲和吸附剂具有不同的颜色： 未被配体取代的基质呈黄色 配体为脂肪族氨基衍生物的呈橙色 配体为芳香族氨基衍生物的呈橙红色 未取代的肼衍生物呈深红色 然后根据各种显色物质的吸光度值计算配体的含量（比 然后根据各种显色物质的吸光度值计算配体的含量（ 色法） 色法）
（2）间接测定法 ）
①推算法
将偶联过程中加入配体的量减去偶联后洗脱出来的配体量， 将偶联过程中加入配体的量减去偶联后洗脱出来的配体量， 除以沉积胶的量，即可推算出配体的结合量（ mg/g沉积胶） 除以沉积胶的量，即可推算出配体的结合量（如mg/g沉积胶） 沉积胶
②根据亲和吸附剂对被吸附物的操作容量计算配体的结合量
第一节 基 本 原 理
一、基本原理
1.亲和层析载体的组成 1.亲和层析载体的组成 配体L以共价键结合到活化的基质 上 配体 以共价键结合到活化的基质M上，构成固相载体 以共价键结合到活化的基质 2.原 2.原 首先待分离物质S借助静电引力 借助静电引力、 理 首先待分离物质 借助静电引力、范得华力及结 构互补效应等作用吸附于固相载体上， 构互补效应等作用吸附于固相载体上，与其它物 质分离；然后通过改变起始缓冲液的pH值，或 质分离；然后通过改变起始缓冲液的 值 增加离子强度， 增加离子强度，或加竞争性抑制剂等方法使待分 离物从固相载体上脱离下来
常用亲和吸附剂采用的基质
一般有纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、交联葡聚糖、琼脂糖、 一般有纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、交联葡聚糖、琼脂糖、交联 琼脂糖以及多孔玻璃珠等。 琼脂糖以及多孔玻璃珠等。 商品纤维素：具有非特异吸附性， 商品纤维素：具有非特异吸附性，且本身结构不均一 聚丙烯酰胺凝胶和交联葡聚糖：与配体结合后，多孔性会大大 聚丙烯酰胺凝胶和交联葡聚糖：与配体结合后， 降低，且聚丙烯酰胺凝胶具有大量酰胺键， 降低，且聚丙烯酰胺凝胶具有大量酰胺键，不易在载体与配体之 间引入间隔物 玻璃珠：具有多孔性好，机械性能强等优点， 玻璃珠：具有多孔性好，机械性能强等优点，但对有的物质也 有一定的吸附力 目前使用最广泛的是Sepharose 4B，它是有 半乳糖和 ， 半乳糖和3， 目前使用最广泛的是 ，它是有D-半乳糖和 6-脱水 半乳糖结合成的链状多糖，极易用溴化氰活化，并易于 脱水-L-半乳糖结合成的链状多糖 脱水 半乳糖结合成的链状多糖，极易用溴化氰活化， 引入不同基团；在温和条件下可连接较多的配体， 引入不同基团；在温和条件下可连接较多的配体，容易吸附大分 子物质， 子物质，且吸附容量较大
将亲和吸附剂装入柱中，加入待分离大分子物质， 将亲和吸附剂装入柱中，加入待分离大分子物质，使其结合量达到 最大，先用适当的洗涤剂洗去杂质， 最大，先用适当的洗涤剂洗去杂质，然后用特异性洗脱剂洗出待分离 的大分子物质，根据分离出的大分子物质的量，计算配体的结合量 的大分子物质，根据分离出的大分子物质的量， 将少量纯品大分子物质陆续加入到亲和层析柱中，直至饱和平衡， 将少量纯品大分子物质陆续加入到亲和层析柱中，直至饱和平衡， 然后根据上样量推算出配体的结合量
注意
边加边搅拌 反应液应始终保持pH11 12 反应液应始终保持pH11~12 pH11 反应会放热，要用水浴中加碎冰的方法控制温度在 反应会放热， 20℃维持8~10min后，再加入大量碎冰使反映体系快速 ℃维持8 10min 10min后 冷却至4℃ 冷却至 ℃或更低温度 整个活化过程越快越好：因为活化的Sepharose在碱性 整个活化过程越快越好：因为活化的Sepharose在碱性 Sepharose 条件下不稳定
2.偶 2.偶 联
向已经活化和洗涤的基质中加入等体积的0.2~0.25 向已经活化和洗涤的基质中加入等体积的 mol/L Na2CO3 缓冲液（含0.5 mol/L NaCl和 缓冲液（ 和 1~10µmol/ml）混合，缓慢搅拌（室温2h;4℃过夜）至 ）混合，缓慢搅拌（室温 ℃过夜） 配体与基质充分偶联 注意：对于偶联极牢固（如多结合位点） 注意：对于偶联极牢固（如多结合位点）会失活的大分子 物质配体， 在低pH（ 物质配体，则应 在低 （6.0~6.5）缓冲液中反应；或将 ）缓冲液中反应； 活化的基质事先置pH8.3的碱性溶液中部分水解，适当降 的碱性溶液中部分水解， 活化的基质事先置 的碱性溶液中部分水解 低其偶联活性；从而提高配体的活性 低其偶联活性；
二、配体的选择
通常可供选择的配体有抑制剂、效应物、酶的辅助因 通常可供选择的配体有抑制剂、效应物、 子、类似底物、抗体及其他物质（如凝集素、polyA、 类似底物、抗体及其他物质（如凝集素、 、 polyU、染料和金属等）等 、染料和金属等）
1.与被纯化物质有适宜的亲和力 与被纯化物质有适宜的亲和力
一般来说，配体对大分子物质的亲合力越高， 一般来说，配体对大分子物质的亲合力越高，在亲和层析 时，分辨率就越好，应用价值就越高；但若配体与待纯化物 分辨率就越好，应用价值就越高； 质（生物大分子物质）之间的亲合力太大时，对分离纯化是 生物大分子物质）之间的亲合力太大时， 不利的 如：用抗生物素蛋白（亦称亲和素）作为配体纯化含生物素 用抗生物素蛋白（亦称亲和素） 的羧化酶时，由于抗生物素蛋白-生物素解离常数接近 生物素解离常数接近1× 的羧化酶时，由于抗生物素蛋白 生物素解离常数接近 ×1015mol，要其分离，必须在 mol/L盐酸胍溶液， pH1.5的剧烈 mol，要其分离，必须在6mol/L盐酸胍溶液， mol/L盐酸胍溶液 的剧烈 条件下才能使羧化酶释放出来，而在此条件下， 条件下才能使羧化酶释放出来，而在此条件下，羧化酶的活 性大部分已发生不可逆性丧失
二、分 类
特异性配体亲和层析： 特异性配体亲和层析：配体一般为复杂的生命大分子物 质（如抗体、受体、酶的类似物等）。其特点是吸附特异 如抗体、受体、酶的类似物等）。其特点是吸附特异 ）。 性强，结合力大 性强， 通用性配体亲和层析： 通用性配体亲和层析：配体一般为简单的小分子物质 （如金属、染料、氨基酸等）。其成本低，具有较高的吸 如金属、染料、氨基酸等）。其成本低， ）。其成本低 附容量， 附容量，但分辨率不及前者
三、特 点
优点：上样量大，分辨率高，操作步骤少， 优点：上样量大，分辨率高，操作步骤少，被分离物质的活 性不易丧失 缺点：每分离一种物质都必须找到合适的配体， 缺点：每分离一种物质都必须找到合适的配体，并将其制备 成固相载体