慢病毒载体构建和包装操作手册

慢病毒载体构建及包装操作手册

目录

慢病毒收到后的注意事项

一、整体实验流程

二、实验材料

三、慢病毒包装和浓缩

四、感染目的细胞

附1. 汉恒生物慢病毒质粒列表

附2. 慢病毒滴度测定方法简介

附3. 慢病毒MOI感染参数

附4. 汉恒生物各病毒载体感染目的细胞比较

慢病毒安全使用和注意事项

➢慢病毒安全使用注意事项（*非常重要！！！*）

1)慢病毒相关实验请在生物安全柜（BL-2级别）内操作。

2)操作病毒时请穿实验服，佩戴口罩和手套，尽量不要裸露双手及手臂的皮肤。

3)操作病毒时特别小心病毒溅出。如果操作时超净工作台有病毒污染，请立即用70%

乙醇加1%的SDS溶液擦拭干净。接触过病毒的枪头，离心管，培养板，培养液请于84消毒液浸泡后统一处理。

4)如需要离心，应使用密封性好的离心管，如有必要请用封口膜封口后离心。

5)病毒相关的废弃物需要特殊收集，统一经高温灭菌处理。

6)实验完毕用香皂清洗双手。

➢慢病毒收到后的注意事项

1)慢病毒的储存

用户收到病毒液后在短期内即使用慢病毒进行实验，可以将病毒暂时放置于4 ℃保存（尽量一周内用完）；如需长期保存请分装后放置于-80℃。

注：a．反复冻融会降低病毒滴度（每次冻融会降低病毒滴度10%-50%）；在病毒使用过程中应尽量避免反复冻融，所以我们前期对病毒进行了分装（200 l/tube），收到后直接放置-80℃保存即可。

b．如果病毒储存时间超过6个月，我们建议在使用前重新测定病毒滴度。

2)慢病毒的稀释

用户需要稀释病毒时，请将病毒取出置于冰浴融解后，使用培养目的细胞用PBS或无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染)混匀分装后置于4℃保存(请尽量一周内用完)。

一、整体实验流程

二、实验材料

（一）慢病毒载体、包装细胞和菌株

该病毒包装系统为三质粒系统，组成为psPAX2, pMD2.G, pHBLV TM系列质粒。

1、载体信息（见附表1）

2、细胞株：我们采用293T作为慢病毒的包装细胞。该细胞系为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM+10% FBS+双抗。贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。

3、菌株：大肠杆菌菌株DH5α用于扩增辅助包装载体质粒；Stbl3用于扩增pHBLV TM 系列质粒，防止病毒载体重组。

三、慢病毒包装和浓缩

(一)质粒扩增

构建好的慢病毒载体和辅助质粒需经过大量抽提，浓度大于1 μg/μl，A260/280在1.7-1.8间方可用以病毒包装。推荐使用Qiagen大抽试剂盒进行质粒的大量去内毒素抽提（质粒质量会极大影响后续转染效率和病毒的滴度）。

(二)做脂质体转染

转染前一天，按照5⨯106/T75的密度铺下293T细胞。24h后转染。转染前请把DMEM 和转染试剂LipoFiter TM恢复至室温，使用前需摇匀。转染每瓶T75的质粒成分如下：

psPAX2 10 μg

PMD2.G 10 μg

pHBLV TM系列载体10 μg

请参考LipoFiter TM转染试剂说明书进行转染操作。转染后6 h换新鲜培养基。

注：LipoFiter TM转染试剂为汉恒生物研制的DNA转染试剂产品，使用说明请参考LipoFiter TM说明书。

(三)病毒收集和离心

转染后48h和72h分别两次收集病毒上清(48h收集后置换新鲜培液)，收集后以0.45 μm滤器过滤,于40 ml超速离心管中，4℃，72000⨯g离心120 min。

(四)病毒重悬和保存

500 μl 新鲜培养液重悬病毒沉淀，置于-80℃甚至液氮保存。

四、感染目的细胞

(一)细胞准备

将状态良好的目的细胞接种到24孔板，使细胞浓度为1×105/ml细胞，接种细胞数量

因细胞的生长速度而略有不同，一般是保证第二天进行病毒感染的时候细胞汇合率介于

50%至70%之间。

(二)病毒感染

1.Polybrene的选择：

Polybrene是带正电的小分子，与细胞表面的阴离子结合，提高慢病毒对细胞的感染

效率，通常加入polybrene能提高感染效率2～10倍。

Polybrene有一定的细胞毒性，有的细胞对Polybrene的毒理反应明显，因此细胞感

染时是否适合Polybrene需要摸索；不同细胞对Polybrene的敏感度不同，可以用1～

10μg/ml的范围筛选合适的浓度，以24h内细胞无明显毒性反应为佳，可参考文献并进行

预实验摸索，Polybrene最常用的工作浓度为6～8 μg/ml。

注：1）汉恒生物的自产的Polybrene 产品，用户可用以进行辅助感染。提供的Polybrene母液保存在-20℃（可保存1年以上），避免反复冻融3次以上，否则活性受影响。4℃可保存2周。

2）Polybrene预实验请先使用对照病毒进行摸索，部分细胞系MOI及Polybrene 的使用范围请参见附表3。

2.感染细胞最佳MOI的测定

MOI（Multiplicity of Infection，感染复数）是指每个细胞感染的病毒数，通常MOI 越高，病毒整合到染色体的数量以及目的蛋白的表达量越高。对于分裂活跃的细胞，比如

Hela、293细胞，MOI=1～3时，80%以上的细胞均表达目的基因。而对于非分裂细胞，比如原代细胞，感染效率较低。需要进行MOI梯度摸索实验，选择适合的MOI进行实验。

3.感染步骤

按实验需要将细胞铺板（比如12孔板）。细胞数以第2天密度约50%为宜。37℃培养过夜。

对于Polybrene可施加的细胞：准备完全培养基和Polybrene混合物，Polybrene 终浓度为摸索得到的最适终浓度。移去培养基并添加0.5 ml Polybrene/培养基混合物于每孔中（适用于24 孔板，其他孔板请相应调整体积。）

注：对于不适用Polybrene的细胞，以上步骤省略，直接进入下面步骤。

感染前，从冰箱取出并在冰上慢慢融化病毒，吸去细胞原有培养基，加入1/2体积新鲜培养基，再将病毒原液加入细胞中，轻轻混匀。（具体加入的病毒数可参考附表1）37℃小体积感染4 h，4 h后补齐培养基至正常体积。（感染时培养基体积表格如下）

病毒小培养体积感染表

培养皿类型表面积/cm2培养基体积病毒体积

96-well 0.3 cm2100 µl 50 µl

24-well 2 cm2500 µl250 µl

12-well 4 cm2 1 ml 500 µl

6-well 10 cm2 2 ml 1 ml 慢病毒感染4 h后补足至培养体积，感染24 h后换液，腺病毒感染4-8 h后直接换液