单克隆抗体制备实验过程
单克隆抗体制备流程
单克隆抗体制备流程1.鼠标免疫：选择合适的抗原，并将其注射到小鼠或其他啮齿动物的体内。
这样可以激发小鼠体内的免疫系统产生特异性的抗原抗体。
2.细胞融合：在小鼠免疫周期结束后，收集其脾细胞，并将其与癌细胞（如骨髓瘤细胞）进行融合。
这一步骤将产生一组称为杂交瘤细胞的细胞群体，具有免疫系统的特异性。
3.筛选和扩增：将融合细胞在含有抗生素的培养基中进行筛选，以去除非融合细胞和未融合的B细胞。
然后，将融合细胞转移到含有较低抗生素浓度的培养基中，以扩增单克隆细胞株。
4.克隆：通过稀释稀释法或限稀稀释法，将单个细胞分离成单个细胞，并将其分别培养在微孔板中。
培养一段时间后，进行测序和酶联免疫吸附试验（ELISA）等测试，以筛选出产生特异性抗体的克隆。
5.生产和纯化：确定产生特异性抗体的克隆后，可以进行大规模的生产和纯化。
将克隆细胞移植到大容量培养器中，进行大规模培养。
然后，通过收集和离心等步骤收集细胞上清液，获取抗体。
6.特性和稳定性测试：对生产的抗体进行特性和稳定性测试，以确定其特异性、亲和力、稳定性和纯度等参数。
这些测试通常包括ELISA、Western blot、免疫组织化学（IHC）等。
7.应用：将制备好的单克隆抗体用于特定的应用，如免疫组化、免疫印迹、流式细胞术等。
根据需要，可能需要对抗体进行标记，如荧光标记或酶标记，以便在特定实验中进行检测。
总之，单克隆抗体制备流程是一个复杂而耗时的过程，需要经过多个步骤来获得特异性和高亲和力的抗体。
这些抗体可以用于研究、诊断和治疗等领域，对于科学研究和临床应用有着重要的意义。
单克隆抗体制备流程图
单抗制备流程1975年,Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交细胞既可产生抗体,又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术.这一技术上的突破不仅为医学与生物学基础研究开创了新纪元，也为临床疾病的诊、防、治提供了新的工具。
制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步骤，下面按照制备单克隆抗体的流程顺序，逐一介绍其实验方法。
一、细胞融合前准备（一) 免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。
一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定.1.颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。
下面以细胞性抗原为例的免疫方案:初次免疫1×10７／0.5ml ip （腹腔内注射)↓2～3周后第二次免疫1×10７／0。
5ml ip↓3周后加强免疫（融合前三天）1×10７／0.5ml ip或iv（静脉内注射）↓取脾融合2.可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂,常用佐剂：福氏完全佐剂，福氏不完全佐剂.要求抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水的乳糜状，放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态。
商品化福氏完全佐剂在使用前须振摇,使沉淀的分枝杆菌充分混匀。
初次免疫 Ag 1~50μg 加福氏完全佐剂皮下多点注射│(一般0.8～1ml 0.2ml／点)↓3周后第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip│(ip剂量不宜超过0.5ml)↓3周后第三次免疫剂量同上，不加佐剂,ip│（5～7天后采血测其效价,检测免疫效果）↓2～3周后加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv↓3天后取脾融合目前,用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性,另一方面可降低抗原的使用量。
单克隆抗体的制作流程
单克隆抗体的制作流程一、前期准备工作1. 确定目标抗体：根据研究需求确定需要制备的单克隆抗体。
2. 筛选免疫原：选择适合的免疫原，如蛋白质、多肽、细胞等。
3. 动物选择：选择适合的动物，如小鼠、大鼠、兔子等。
4. 免疫计划设计：设计出合理的免疫计划，包括免疫剂量、次数、间隔时间等。
二、免疫过程1. 免疫原制备：将所选的免疫原纯化或合成后进行检测和确认。
2. 免疫动物注射：将免疫原与佐剂混合后注射到动物体内，按预定计划进行多次注射。
3. 血清采集：在最后一次注射后采集动物血清，检测抗体滴度是否达到预期水平。
三、杂交细胞制备1. 细胞系选择：选择适合的细胞系如SP2/0或NS0等。
2. 细胞培养：将细胞系培养至稳定生长状态，并进行筛选和确认。
3. 细胞融合：将免疫小鼠脾细胞与SP2/0或NS0细胞进行融合，得到杂交瘤细胞。
4. 杂交瘤筛选：利用HAT培养基对杂交瘤进行筛选，筛选出产生单克隆抗体的杂交瘤。
四、单克隆抗体制备1. 单克隆细胞培养：将单个杂交瘤细胞进行单克隆分离和培养。
2. 单抗酶标法检测：利用ELISA等技术检测单克隆抗体的特异性和亲和力。
3. 大规模培养：将筛选出的单克隆细胞进行大规模培养，得到足够多的单克隆抗体。
4. 纯化和鉴定：通过亲和层析、离子交换层析等技术对单克隆抗体进行纯化，并进行质量鉴定。
五、应用1. 体外实验应用：如ELISA、Western blotting等技术中作为检测试剂使用。
2. 体内实验应用：如流式细胞术、组织切片染色等技术中作为荧光标记或特异性结合试剂使用。
3. 临床应用：如治疗肿瘤、自身免疫性疾病等方面的治疗药物。
六、总结单克隆抗体的制备流程包括前期准备工作、免疫过程、杂交细胞制备、单克隆抗体制备和应用等环节。
其中，前期准备工作和免疫过程是制备成功的关键，而单克隆抗体制备需要经过多次筛选和鉴定才能得到高质量的单克隆抗体。
单克隆抗体在医学和生命科学领域有着广泛的应用前景，对于推动科学发展具有重要意义。
单克隆抗体的过程
单克隆抗体的过程
单克隆抗体的过程是指从单一的淋巴细胞中制备出一种特异性
很高、只与一种抗原结合的抗体。
这种抗体被称为单克隆抗体，是研究和应用领域中非常重要的工具。
单克隆抗体制备的过程主要包括以下几个步骤：
1. 免疫原注射：将一种抗原注射到小鼠或大鼠体内，以激发其
免疫系统产生特异性抗体。
2. 淋巴细胞分离：从小鼠或大鼠的脾脏或淋巴结中取出特异性
抗体产生的淋巴细胞。
3. 融合细胞制备：将淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行融合，得到一
种能够长期生长和分泌抗体的杂交瘤细胞。
4. 筛选杂交瘤：通过对杂交瘤进行筛选，筛选出只分泌与所需
抗原结合的单克隆抗体的杂交瘤细胞。
5. 培养单克隆抗体：将根据筛选结果得到的杂交瘤细胞进行培养，得到单克隆抗体。
6. 纯化单克隆抗体：采用各种化学和生物学方法，将得到的单
克隆抗体进行纯化和加工处理。
单克隆抗体制备的过程需要经过多个阶段，其中淋巴细胞的分离、杂交瘤的筛选和单克隆抗体的培养是关键步骤。
随着技术的不断发展，单克隆抗体制备的效率和质量也在不断提高，为生命科学和医学研究提供了更加可靠的工具。
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单克隆抗体制备的基本过程
单克隆抗体制备的基本过程
1.免疫原选择：选择适当的免疫原进行免疫，以诱导机体产生特异性抗体。
免疫原可以是蛋白质、多肽、病毒、细菌等。
2.动物免疫：将免疫原注射到动物体内，通常使用小鼠、兔子或大鼠作为免疫动物。
免疫的方法包括皮下注射、腹腔注射或静脉注射。
3.抗体筛选：收集动物的抗体样本，检测其对免疫原的特异性和亲和力。
常用的方法包括ELISA（酶联免疫吸附测定法）和免疫组化。
4.B细胞筛选：选择具有高亲合力的抗体阳性B细胞作为单克隆抗体的源头。
B细胞流式细胞分选或细胞培养均可用于筛选。
5.克隆化：从筛选出的B细胞中获得单个的抗体分泌细胞。
可以通过限稀稀释、单细胞分选、细胞融合等方法获得单克隆抗体细胞株。
6.表达和纯化：将单克隆抗体细胞按照需要进行培养和大量扩增，使其产生足够的抗体。
通过培养上清液或组织提取等方式获得抗体。
7. 鉴定和验证：对制备的单克隆抗体进行鉴定和验证，确定其特异性和亲和力。
常用的方法包括Western blotting、免疫组化和流式细胞术等。
8.应用和保存：单克隆抗体可以用于研究、诊断或治疗等领域。
制备的抗体可以保存在液氮中，以备后续使用。
需要注意的是，单克隆抗体制备是一项复杂的工作，需要专业的知识和技术。
制备过程中可能会遇到各种问题，如抗原选择、抗体筛选和细胞克隆等环节的问题。
因此，在进行单克隆抗体制备之前，应对各个环节进行充分的计划和准备，并请专业的科研人员或技术人员指导操作。
单克隆抗体制备流程
单克隆抗体制备流程单克隆抗体是一种由单一克隆的B细胞产生，具有针对特定抗原的高度特异性和亲和力的抗体。
制备单克隆抗体的过程主要包括以下几个步骤：免疫原制备、小鼠免疫、混合细胞瘤制备、细胞筛选与分克隆。
首先，制备免疫原。
根据需要制备一种抗原，可以是纯化的蛋白质、多肽或合成的多肽。
这个抗原通常具有特异性，可用于激发B细胞产生特异性抗体。
其次，选择小鼠免疫。
通常选择小鼠作为免疫动物，因为小鼠的免疫系统较为适合。
给小鼠注射免疫原，激发其免疫反应。
为了增强免疫效果，通常在小鼠体内使用佐剂，如完全弗氏佐剂。
然后，制备混合细胞瘤。
在小鼠接种一段时间后，从其脾脏或骨髓中取出淋巴细胞。
然后通过融合淋巴细胞和骨髓瘤细胞，如骨髓瘤SP2/0，获得混合细胞瘤。
接下来，细胞筛选与分克隆。
将混合细胞瘤悬浮液均匀地滴于含有选择性培养基的平板上，通过稀释法，保证每个细胞得到充分的空间生长。
经过适当的培养时间后，细胞形成单个克隆。
最后，对每个克隆细胞进行培养与鉴定。
收集克隆细胞，经过一段时间的培养，获得充足的抗体。
而后，对培养液中的抗体进行鉴定，采用ELISA和免疫组化方法来确认是否产生了特定抗原的单克隆抗体。
在单克隆抗体制备的过程中，需要注意以下几点：首先，免疫原的制备应保证其纯度和有效性；其次，小鼠对免疫原的免疫应注意适当的剂量和接种时机；再者，混合细胞瘤的制备要控制好融合细胞的比例，避免细胞瘤的过度生长；最后，细胞的培养与鉴定是确保获得高质量单克隆抗体的关键环节，要进行仔细的监测和筛选。
总之，单克隆抗体的制备过程是一个复杂而精细的过程，需要在实验操作中严格控制各个步骤，以确保获得高质量、高特异性的单克隆抗体。
这些单克隆抗体不仅可以应用于科学研究领域，还可以用于临床诊断和治疗。
单克隆抗体制备步骤及注意事项
单克隆抗体制备步骤及注意事项单克隆抗体（Monoclonal antibody，mAb）是指由单一B细胞克隆分离得到的抗体，其具有高特异性和高亲和力。
制备单克隆抗体的方法主要有杂交瘤技术和重组DNA技术。
以下是单克隆抗体制备的步骤及注意事项。
步骤一：抗原免疫1.选择合适的抗原：根据需要检测的分子或细胞表面标志物，选择合适的抗原。
2.免疫动物：常用的动物有小鼠、兔子等。
选择适合的动物后，根据抗原的种类和免疫动物对该抗原的敏感性，设计免疫方案。
3.免疫计划：免疫计划包括免疫剂量、免疫途径和免疫次数等。
通常先进行原位免疫，然后再以单体或混合抗原进行体内免疫。
步骤二：细胞融合1.收集脾细胞：在最佳时期，解剖免疫动物，取出脾脏。
2.细胞培养：将收集的脾细胞在无菌条件下分散成单个细胞，并在培养基中培养，以供细胞融合使用。
3.准备骨髓瘤细胞：选择合适的骨髓瘤细胞，例如NS0或SP2/0等。
将其培养至对数生长期。
4.细胞融合：在抗原刺激下，将脾细胞与骨髓瘤细胞以一定比例混合，用聚乙烯醇或其他化合物促进细胞融合。
步骤三：细胞筛选与扩展1. HT增重培养：用含有hprt缺陷的培养基筛选融合细胞，以选择杂交瘤细胞。
2. Limited Dilution扩展：以一细胞一孔的方式将杂交瘤细胞进行有限稀释，使其实现单克隆化。
3.细胞培养：将单克隆细胞株移植到培养瓶中，进行培养和扩增。
步骤四：单克隆抗体鉴定1.酶联免疫吸附试验（ELISA）：用ELISA方法筛选单克隆细胞株，检测其抗原特异性。
2.免疫组织化学检测：将单克隆抗体应用于细胞和组织切片，检测其在特定细胞或组织中的反应。
3.流式细胞术：通过流式细胞仪检测单克隆抗体与特定细胞表面标志物的结合情况。
步骤五：单克隆抗体生产与纯化1.细胞培养：将单克隆细胞株培养扩增至一定程度。
2.抗体收集：将培养上清液进行抗体收集。
3.纯化与浓缩：利用亲和层析、离子交换、凝胶过滤等技术，对抗体进行纯化和浓缩。
单克隆抗体制备流程
单抗制备流程1975年，Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合,形成的杂交细胞既可产生抗体,又可无限增殖,从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。
这一技术上的突破不仅为医学与生物学基础研究开创了新纪元，也为临床疾病的诊、防、治提供了新的工具。
制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步骤，下面按照制备单克隆抗体的流程顺序,逐一介绍其实验方法。
一、细胞融合前准备(一) 免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。
一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。
1.颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果.下面以细胞性抗原为例的免疫方案:初次免疫1×10７／0。
5ml ip (腹腔内注射)↓2~3周后第二次免疫1×10７／0。
5ml ip↓3周后加强免疫(融合前三天) 1×10７／0.5ml ip或iv（静脉内注射)↓取脾融合2。
可溶性抗原免疫原性弱,一般要加佐剂，常用佐剂:福氏完全佐剂，福氏不完全佐剂。
要求抗原和佐剂等体积混合在一起,研磨成油包水的乳糜状，放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态.商品化福氏完全佐剂在使用前须振摇，使沉淀的分枝杆菌充分混匀。
初次免疫 Ag 1～50μg 加福氏完全佐剂皮下多点注射│（一般0.8～1ml 0.2ml／点)↓3周后第二次免疫剂量同上,加福氏不完全佐剂皮下或ip│（ip剂量不宜超过0。
5ml)↓3周后第三次免疫剂量同上，不加佐剂，ip│ (5～7天后采血测其效价，检测免疫效果)↓2~3周后加强免疫，剂量50～500μg为宜,ip或iv↓3天后取脾融合目前,用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性,另一方面可降低抗原的使用量。
单克隆抗体制备流程
单克隆抗体制备流程单克隆抗体是一种来源于单一B细胞克隆的抗体，具有高度的特异性和亲和力，被广泛应用于生物医药领域。
其制备流程主要包括免疫原制备、动物免疫、细胞融合、筛选和鉴定等步骤。
下面将详细介绍单克隆抗体制备的流程。
1. 免疫原制备。
首先需要准备纯化的抗原蛋白，可以是蛋白质、多肽、细胞膜蛋白等。
抗原蛋白的纯度和活性对单克隆抗体的制备至关重要，因此需要进行严格的纯化和活性检测。
通常采用亲和层析、离心、电泳等方法进行抗原蛋白的提取和纯化。
2. 动物免疫。
将纯化的抗原蛋白注射到小鼠或兔子等动物的体内，诱导其产生特异性抗体。
在免疫过程中，需要注意控制免疫程序，监测抗体滴度，以及合理调整免疫方案，以提高单克隆抗体的产量和质量。
3. 细胞融合。
从免疫动物中获取脾细胞或骨髓细胞，与骨髓瘤细胞（如SP2/0、NS-1等）进行融合，得到杂交瘤细胞。
杂交瘤细胞具有较高的产抗体能力，能够长期稳定地分泌单克隆抗体。
4. 筛选和鉴定。
通过ELISA、免疫印迹、细胞免疫荧光等方法对杂交瘤细胞培养上清液进行筛选和鉴定。
筛选出特异性较强的单克隆抗体阳性杂交瘤细胞，并进行亚克隆的鉴定，最终获得单克隆抗体细胞株。
5. 扩大培养和纯化。
将筛选出的单克隆抗体细胞株进行扩大培养，获得大量的单克隆抗体上清液。
然后采用亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤等方法对单克隆抗体进行纯化，获得高纯度的单克隆抗体制剂。
总结。
单克隆抗体制备流程是一个复杂而又精细的过程，需要在每个环节都严格控制条件，确保单克隆抗体的产量和质量。
通过上述步骤的实施，可以获得高效、高纯度的单克隆抗体，为生物医药领域的研究和应用提供有力支持。
单克隆抗体的制备流程
单克隆抗体的制备流程
一、抗体cDNA克隆
2、结合分离：抗体和抗原之间采用免疫学方法，进行亲和结合分离，在病理学中，可以采用细胞亲和免疫电泳或者细胞色素紧缩技术来进行识
别性结合分离抗体。
3、mRNA提取：使用RNAsy Plus Kit根据操作说明提取亲和结合分
离后的抗体的mRNA，用于cDNA合成。
4、cDNA合成：使用双链cDNA合成试剂盒，根据说明书操作，将mRNA合成双链cDNA。
5、克隆：将双链cDNA进行克隆，经过构建的一系列步骤，最终将cDNA克隆到载体上，构建出抗体cDNA克隆库。
二、抗体cDNA克隆抗体制备
1、选择克隆体：选择抗体cDNA克隆库中的抗体表达克隆，采用PCR
技术进行选择，并检测克隆体具有良好的免疫特性，可以快速确定最佳克
隆体。
2、表达载体构建：将最佳克隆体插入到表达载体中，构建出属于克
隆体的表达载体，以此保证克隆体的正确表达。
3、表达系统筛选：利用多种表达系统，筛选出最佳的表达系统，以
此来达到最佳的表达效果。
4、表达调控：对于最佳的表达系统，根据cDNA克隆体的特性，进行
最佳的表达调控，以此达到最佳的抗体表达效果。
单克隆抗体制备步骤及注意事项
单克隆抗体制备步骤及注意事项一、脾细胞的准备：1.将Balb/c小鼠拉颈脱臼处死，浸泡于75%酒精3～5min。
无菌操作取出脾脏，置于盛有5mL不完全培养液的平皿中，洗涤3次去除脾脏表面的脂肪和结缔组织。
2.将洗好的脾脏用剪刀剪成3～5个小块，然后将脾脏研碎，过细胞筛，收集细胞。
3.将脾脏细胞悬液在1000r/min条件下，离心5min，弃上清。
再以同样的方法洗涤离心一次。
4.将沉淀细胞重新悬浮于10mL不完全培养液中，计活细胞数，取108个脾淋巴细胞悬液备用。
注意事项：➢免疫脾细胞一般取最后一次加强免疫3天以后的脾脏，制备成细胞悬液，因为此时B淋巴母细胞比例较大，融合的成功率较高。
二、骨髓瘤细胞的准备：1.选好骨髓瘤细胞株，取体外培养对数生长期细胞或体内生长的肿瘤分离骨髓瘤细胞。
2.取对数生长骨髓瘤细胞离心，用无血清培养液洗2次。
3.制备细胞悬液，计活细胞数。
4.调整细胞浓度，取107细胞悬液备用。
注意事项：➢常用的骨髓瘤细胞系有：NS1、SP2/0、X63、Ag8.653等。
➢骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤细胞在同一品系小鼠腹腔内生产大量McAb。
➢骨髓瘤细胞的培养适合于一般的培养液，如RPMI-1640基础培养液，DMEM培养基。
小牛血清的浓度一般在10～20%。
细胞的最大密度不得超过106个/mL。
➢一般扩大培养以1:10稀释传代，每3～5天传代一次。
细胞的倍增时间为16～20小时。
➢一般准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细胞，为确保该细胞对HA T的敏感性，每3～6个月应用8～AG（8氮杂鸟嘌呤）筛选一次，以防止细胞的突变。
➢保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好的形态，活细胞计数高于95%，也是决定细胞融合的关键。
三、细胞融合：1.将骨髓瘤细胞与脾细胞按1:10 或1:5的比例混合，加入20～50mL RPMI-1640培养液。
2.在1000r/min条件下离心8min，弃上清，用滴管轻轻吸净残留液体。
单克隆抗体制备流程
单克隆抗体制备流程一、免疫准备1）试剂：弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂2）常用免疫原：纯化蛋白、融合蛋白、多肽。
3）耗材：1ml、2ml注射器，橡胶管，1.5ml EP管，刀片（或毛细玻璃管），酒精棉球。
4）免疫动物：小鼠（BALB/c,雌性6-8周）5）乳化器（或者手动推）二、免疫过程1）免疫前取血取血方式：酒精棉擦拭尾部后（酒精多了伤口挤压出来的血液易分散），用锋利的刀片在小鼠尾部靠近静脉处划开小口，如下图箭头所示方向从上往下挤压血管，血从伤口处流出后用枪吸取放入EP管中（30ul血够用）离心取上清放冰箱备用。
此方法取血最为简单易行，避免眼球取血毛细管扎瞎老鼠眼睛。
注意点：①避免切断老鼠尾巴②切口劲量靠近尾末端，方便挤压血管③伤口消毒酒精不要太多，不利于伤口血液凝固。
2）免疫原制备：一支2ml注射器吸抗原，另一支注射器吸等量体积佐剂，橡胶管连接两支注射器来回推几下混匀，然后放乳化器上乳化（为防止蛋白变性，乳化器上可放置冰袋），大约来回推1500次左右可乳化完全（滴一小滴到静水中若不扩散说明乳化完全）。
换上1ml注射器针头免疫小鼠（2ml注射器免疫不好控制，可将乳化液转移到1ml注射器中免疫，但这样会损失部分抗原）。
注：①每只老鼠免疫蛋白量10-100ug,初次免疫参考量50ug蛋白/只，加强免疫及融合前冲击免疫25ug蛋白/只。
初次免疫使用弗氏完全佐剂，加强免疫使用弗氏不完全佐剂，融合前冲击免疫不使用佐剂可用缓冲液如PBS等稀释抗原（如果需要）。
②免疫量100ul-300ul/每只小鼠。
③多点免疫，一针不要打太多。
3）免疫方式和免疫时间根据免疫原决定免疫方式，皮下免疫和腹腔注射较为常见(纯化蛋白、融合蛋白多肽)。
皮下注射免疫，免疫时间间隔为2周，第三次免疫一周后（8-10d）采血测效价，决定是继续加强免疫还是冲击免疫后做融合。
较好的效价应该在10W以上，附表1 免疫接种时间表天数操作佐剂免疫方式0 初次免疫CFA 皮下14 第二次免疫IFA 皮下28 第三次免疫IFA 皮下36-38 收集血清测效价＿＿42 第四次免疫（如果需要）IFA 皮下50 收集血清测效价＿＿52 融合前冲击免疫＿腹腔55 收获脾细胞和融合＿＿注：如果第四面免疫血清效价仍然达不到要求可以继续加强免疫，如果免疫超过6次仍然达不到要求免疫基本失败。
单克隆抗体制备实验过程
单克隆抗体制备实验过程
抗体制备实验一般分为抗体克隆、筛选、纯化和表征四个步骤，其中
抗体克隆是抗体制备实验的前提步骤，克隆抗体是从雌配子小鼠体内得到
其对抗原的单克隆抗体，是抗体制备的关键步骤。
1. 合成抗原或者从天然资源中获取抗原：合成抗原包括多肽抗原
（如biotin-GSH等）和糖蛋白抗原（如活性细胞皮质激素等）；从天然
资源中获取抗原则包括病毒样本和免疫原，比如结核分枝杆菌的血清浆及
其他微生物。
2.接种抗原：根据抗原的不同，采用不同的接种方法，比如多肽抗原，可以采用皮下或肌肉注射的方法将抗原接种于雌配子小鼠身上，以致于小
鼠体内产生对抗原的抗体。
3.分离抗体：通过血液和胸腺组织中抗体的分离筛选，获取单克隆抗体。
4. 抗体克隆：从抗体分离所获得的抗体，经过细胞学的方法进行抗
体克隆。
克隆过程中，可以利用多肽抗原，利用细胞杂交的方法进行对单
克隆抗体的从cloned。
5.筛选单克隆抗体：利用免疫染色的方法进行抗体筛选和确认，以确
定抗体株。
6.抗体纯化：经过单克隆抗体筛选和确认后，可以利用离子交换柱等
方法进行抗体纯化，从而获得高纯度的抗体制剂。
杂交瘤法制备单克隆抗体的过程
杂交瘤法制备单克隆抗体的过程杂交瘤法是一种常用的制备单克隆抗体的方法，其基本过程包括四个步骤：免疫原制备、小鼠免疫、脾细胞与肿瘤细胞的融合、单克隆抗体筛选与鉴定。
首先，免疫原制备是制备单克隆抗体的关键步骤之一、免疫原即所要制备单克隆抗体的目标抗原。
免疫原的选择应根据研究目的和要求进行，如对特定蛋白质、细胞表面分子等的免疫。
免疫原制备一般包括两个步骤：蛋白纯化和蛋白改性。
对于蛋白纯化而言，可以通过胶体电泳技术或柱层析技术等方法获得纯化的蛋白质。
对于蛋白改性而言，可以通过蛋白质偶联剂的使用，将蛋白质与载体相结合。
其次，小鼠免疫是为了获得特异性抗体。
将制备好的免疫原注射到小鼠体内，激发其免疫系统产生抗原特异性抗体。
为了增强免疫效果，一般需要多次免疫，同时还可以使用辅助剂和佐剂来提高免疫效果。
然后，脾细胞与肿瘤细胞的融合是为了制备杂交瘤。
在免疫小鼠体内产生特异性抗体后，需要收集小鼠的脾脏，分离脾细胞。
肿瘤细胞一般采用无髓腔瘤细胞系，如SP2/0或NS1等。
通过使用聚乙二醇等融合剂，将脾细胞和肿瘤细胞融合，从而获得杂交瘤细胞。
杂交瘤细胞中的每个细胞包含有来自小鼠脾细胞的抗体产生能力和来自肿瘤细胞的无限生长能力。
最后，单克隆抗体的筛选与鉴定是为了获得特异性的单克隆抗体。
杂交瘤细胞在发育培养基中进行培养，筛选出产生特异性抗体的杂交瘤细胞克隆，并进行克隆扩增。
筛选方法一般包括ELISA、免疫荧光细胞分选等。
通过克隆扩增后，可以进行进一步的鉴定与验证，如免疫沉淀、西方印迹等方法。
总结起来，杂交瘤法制备单克隆抗体的过程包括免疫原制备、小鼠免疫、脾细胞与肿瘤细胞的融合、单克隆抗体筛选与鉴定。
通过这些步骤，可以获得高特异性的单克隆抗体，为科研和临床应用提供有力的工具。
2.杨霞,赵蕊.杂交瘤制备单克隆抗体技术[J].生物技术通报,2024(3):170-173.。
简述单克隆抗体的制备过程
简述单克隆抗体的制备过程随着生物技术的发展和应用的广泛，单克隆抗体作为一种重要的生物分子工具，在医学诊断、治疗和科学研究领域发挥着重要作用。
单克隆抗体是通过体外复制细胞免疫应答过程中产生的单一克隆抗体分子，具有高度特异性和亲和力。
下面将简要介绍单克隆抗体的制备过程。
第一步：免疫原的选择制备单克隆抗体的第一步是选择适当的免疫原。
免疫原可以是蛋白质、多肽、糖类、脂类等生物大分子，也可以是一种特定的细胞、细胞表面分子或化合物。
免疫原的选择应根据需要检测或研究的目标来确定。
第二步：免疫动物的选择和免疫过程为了制备单克隆抗体，需要选择适当的免疫动物。
常用的免疫动物包括小鼠、兔子、大鼠等。
免疫过程分为初次免疫和加强免疫两个阶段。
初次免疫是将免疫原注入免疫动物体内，刺激机体产生免疫应答。
加强免疫是在初次免疫后再次注入免疫原，以增强机体的免疫应答。
第三步：细胞融合和杂交瘤的建立细胞融合是制备单克隆抗体的关键步骤。
它是将免疫动物体内产生的抗体产生细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞。
常用的骨髓瘤细胞包括SP2/0和NS0等。
融合细胞的选择和优化是确保制备高效单克隆抗体的重要因素。
第四步：筛选和克隆单克隆抗体细胞融合细胞后，需要进行单克隆抗体细胞的筛选和克隆。
常用的筛选方法包括限稀稀释法、酶联免疫吸附试验等。
通过这些筛选方法可以筛选出产生目标抗体的单个细胞克隆。
第五步：单克隆抗体的生产和纯化筛选出单克隆抗体细胞后，需要进行大规模培养和生产。
单克隆抗体的生产可以通过体外培养细胞和动物体内生产两种方式进行。
体外生产是将单克隆抗体细胞培养在培养基中，利用生物反应器等设备进行大规模培养。
动物体内生产是将单克隆抗体细胞移植到合适的动物体内，利用动物自身的机制产生单克隆抗体。
之后，通过各种纯化方法，如蛋白A/G亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等，从培养物中纯化出单克隆抗体。
第六步：单克隆抗体的特性研究和应用制备得到的单克隆抗体需要进行进一步的特性研究和应用。
单克隆抗体制备过程
单克隆抗体制备过程
1.免疫兔子或小鼠
2.筛选细胞
在免疫宿主体内产生特异性抗体后，需要从免疫宿主的脾脏或骨髓中
获取淋巴细胞以进一步制备单克隆抗体。
常用的方法是将免疫宿主的细胞
与肿瘤细胞进行融合，产生杂交瘤细胞（hybridoma）。
3.杂交瘤筛选
将杂交瘤细胞分装于微孔板中，每个孔内只包含一个杂交瘤细胞克隆。
随后，将孔内细胞培养在含有特定抗原的培养基中，促使杂交瘤细胞产生
单克隆抗体。
通过酶联免疫吸附试验（ELISA）或细胞培养物免疫荧光染
色等技术进行筛选，确定含有特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞克隆。
4.扩增细胞
从筛选出的单克隆杂交瘤细胞克隆中获取单个细胞，将其分别培养在
含有抗生素的培养基中，以增殖和扩增单克隆抗体产生的细胞。
5.收获单克隆抗体
收获扩增的单克隆抗体细胞后，可通过离心将细胞沉淀，并用特定的
缓冲液洗涤和纯化单克隆抗体。
6.验证单克隆抗体
为了验证制备的单克隆抗体是否具有特异性和高亲和力，可以使用多
种技术进行鉴定。
例如，酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫印迹（Western blotting）和流式细胞术等。
7.扩大生产
验证通过的单克隆抗体可进一步进行扩大生产。
可以选择适合的体外
培养条件和生产规模，以获得足够的单克隆抗体用于科学研究或临床应用。
总结起来，制备单克隆抗体的过程包括免疫动物、获得淋巴细胞、杂
交瘤筛选、细胞扩增、抗体收获、抗体验证和扩大生产等步骤。
通过这些
步骤，可以获得特异性、高亲和力的单克隆抗体，用于疾病诊断、治疗和
科学研究等领域。
单克隆抗体制备流程图
单抗制备流程1975年,Kohler与Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞与绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合,形成的杂交细胞既可产生抗体,又可无限增殖,从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。
这一技术上的突破不仅为医学与生物学基础研究开创了新纪元,也为临床疾病的诊、防、治提供了新的工具。
制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产,要经过几个月的一系列实验步骤,下面按照制备单克隆抗体的流程顺序,逐一介绍其实验方法。
一、细胞融合前准备(一) 免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功,获得高质量的McAb至关重要。
一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫,免疫方案应根据抗原的特性不同而定。
1、颗粒性抗原免疫性较强,不加佐剂就可获得很好的免疫效果。
下面以细胞性抗原为例的免疫方案:初次免疫1×10７／0、5ml ip (腹腔内注射)↓2～3周后第二次免疫1×10７／0、5ml ip↓3周后加强免疫(融合前三天) 1×10７／0、5ml ip或iv(静脉内注射)↓取脾融合2、可溶性抗原免疫原性弱,一般要加佐剂,常用佐剂:福氏完全佐剂,福氏不完全佐剂。
要求抗原与佐剂等体积混合在一起,研磨成油包水的乳糜状,放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态。
商品化福氏完全佐剂在使用前须振摇,使沉淀的分枝杆菌充分混匀。
初次免疫 Ag 1～50μg 加福氏完全佐剂皮下多点注射│(一般0、8～1ml 0、2ml／点)↓3周后第二次免疫剂量同上,加福氏不完全佐剂皮下或ip│(ip剂量不宜超过0、5ml)↓3周后第三次免疫剂量同上,不加佐剂,ip│ (5～7天后采血测其效价,检测免疫效果)↓2～3周后加强免疫,剂量50～500μg为宜,ip或iv↓3天后取脾融合目前,用于可溶性抗原(特别就是一些弱抗原)的免疫方案也不断有所更新,如①将可溶性抗原颗粒化或固相化,一方面增强了抗原的免疫原性,另一方面可降低抗原的使用量。
单克隆抗体的实验流程
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单克隆抗体制备实验过程一、免疫动物免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞的过程。
一般选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠，按照预先制定的免疫方案进行免疫注射。
抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官，刺激相应B淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏B 淋巴细胞。
说明：FCA，弗氏完全佐剂；FIA，弗氏不完全佐剂；Quickantibody，北京康碧泉公司研制的佐剂。
上表中第四种免疫方法产生的抗体大部份都为IgM，存在亲和力弱等缺点，慎用。
PS：1、一般皮下注射每个注射点注射30-50ul左右混有佐剂的抗原，每只小鼠注射6-8个点为宜。
2、腹腔注射时，如果抗原混有弗氏佐剂，建议注射在左侧腹腔，如果采用右侧腹腔注射，则在免疫过程中，很容易导致小鼠脾脏与腹膜粘连的情况，造成后期取出脾脏麻烦。
3、冲击免疫完成后，应在96小时内完成细胞融合，否则相应的B细胞数量会下降到未冲击前的水平。
二、细胞融合（Cell fusion）【材料和试剂】（1）骨髓瘤细胞悬液选好骨髓瘤细胞株，取体外培养对数生长期细胞或体内生长的肿瘤分离骨髓瘤细胞，制备细胞悬液。
（2）免疫小鼠脾细胞悬液取3天前加强免疫的小鼠，眼眶放血，•分离血清冻存备用。
拉颈处死小鼠，浸泡于75％酒精中3～5min。
无菌操作取出脾脏，置入盛有5ml不完全培养液的平皿中洗涤，剪去周围的结缔组织，将脾脏移入另一盛有5ml不完全培养液的平皿中的钢网上，先用剪刀剪成3～5个小块，然后用注射器内芯研磨。
将脾脏细胞悬液移至50ml离心管中，加不完全培养液50ml，1000r/min 离心5min，弃上清，再以同法洗涤离心一次。
然后将沉淀细胞重新悬浮于10ml不完全培养液中，计活细胞数，一般一只小鼠可得0.5～2×108个脾细胞。
（3）饲养细胞将小鼠致死、体表消毒和固定后，用消毒剪镊从后腹掀起腹部皮肤，暴露腹膜。
用酒精棉球擦拭腹膜消毒。
用注射器注射10ml不完全培养基至腹腔，注意避免穿入肠管。
右手固定注射器，使针头留置在腹腔内，左手持酒精棉球轻轻按摩腹部1分钟，随后吸出注入的培养液。
1000r/min离心5-10分钟，弃上清。
先用5ml HAT培养基将沉淀细胞悬浮，根据细胞计数结果，补加HAT培养基，使细胞浓度为2×105/ml，备用。
（4）主要试剂的配制①细胞培养基杂交瘤技术中使用的细胞培养基主要有RPMI-1640或DMEM （Dulberco Modified Eagles Medium）两种基础培养基，配好后过滤除菌（0.22um），分装，4℃保存。
不完全RPMI-1640培养基：不完全DMEM培养基：完全RPMI-1640或DMEM培养基：HT或HAT培养基：称取1.76mg氨基喋呤（Aminopterin MW 440.4），溶于90ml超纯水或四蒸水中，滴加1mol/L NaOH 0.5ml中和，再补加超纯水或四蒸水至100ml。
过滤除菌，分装小瓶（2ml/瓶），-20℃保存。
③次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷（HT）贮存液（100×，H：10-2mol/L，T：1.6×10-3mol/L）称取136.1mg次黄嘌呤（Hypoxanthine，MW 136.1）和38.8mg胸腺嘧啶核苷（Thymidine，MW 242.2），加超纯水或四蒸水至100ml，置45-50℃水浴中使完全溶解，过滤除菌，分装小瓶（2ml/瓶），-20℃冻存。
用前可置37℃加温助溶。
④L-谷氨酰胺（L.G.）溶液（100×，0.2mol/L）称取2.92g L-谷氨酰胺（L-glutamine，MW 146.15），用100ml不完全培养液或超纯水（或四蒸水）溶解，过滤除菌，分装小瓶（4-5ml/瓶），-20℃冻存。
⑤青、链霉素（双抗）溶液（100×）取青霉素G（钠盐）100万单位和链霉素（硫酸盐）1g，溶于100ml灭菌超纯水或四蒸水中，分装小瓶（4-5ml/瓶），-20℃冻存。
溶液⑥7.5% NaHCO37.5g，溶于100ml超纯水或四蒸水中，过滤除菌，分装称取分析纯NaHCO3小瓶（4-5ml/瓶），盖紧瓶塞，4℃保存。
⑦HEPES溶液（1mol/L）称取23.83g HEPES（N-2-Hydroxyethylpiperazine-N，-2-ethanesulfonic acid，N-2-羟乙基哌嗪- N，-2-乙基磺酸，MW 238.3）溶于100ml超纯水或四蒸水中，过滤除菌，分装小瓶（4-5ml/瓶），4℃保存。
⑧8-氮鸟嘌呤贮存液（100×）称取200mg 8-氮鸟嘌呤（8-azaguanine，MW 152.1），加入4mol/L NaOH 1ml，待其溶解后，加入超纯水或四蒸水99ml，过滤除菌；分装小瓶，-20℃冻存。
使用时按1%浓度加入到培养液中（即终浓度为20ug/ml）。
⑨50% PEG称取PEG 1000 或4000 20-50g于三角瓶中，盖紧，60-80℃水浴融化，0.6ml 分装于青霉素小瓶中，盖紧，8磅高压蒸汽15分钟，-20℃存放备用。
临用前加调PH至8.0，或购买Sigma 热融化，加等量不完全培养基，用少许7.5% NaHCO3或Gibco公司现成产品。
（5）24孔及96孔培养板等细胞培养所用材料和试剂。
【操作步骤】（1）将准备好的骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按1：5～1：10比例混合，•加入20～50ml RPMI-1640液。
（2）1000r/min×6～10min离心弃上清，将上清尽量吸净。
（3）用手指轻轻击打离心管底部，使沉淀细胞分散，将离心管置37℃水浴中。
（4）吸取1ml 37℃预温的50％PEG•缓慢滴入离心管内，45秒左右加完，边加边轻轻搅拌，37℃静置1～5min。
（5）在5min内滴加不完全完全培养液(37℃预温)20ml，第一分钟内滴加1ml，第2分钟2ml，第3分钟5ml，第4和第5分钟各6ml，同时应边加边轻轻地转动离心管，应沿管壁滴加，不应直接滴加在沉淀细胞上，以防将刚融合的细胞冲开。
然后加1640液至50ml使PEG 作用终止。
（6）800r/min×5～10min离心，弃上清。
（7）•将沉淀细胞轻轻悬浮于所需容积的HA T培养液中，接种24孔板（每孔1.0-1.5ml）或96孔培养板（每孔0.10-0.15ml）。
（8）接种完毕后，将培养板放入37℃5％CO2温箱中培养。
PS:1、冻存的骨髓瘤细胞在复苏后要2周时间才能处于适合于融合的状态，培养目标是使处于对数生长的时间尽可能长。
2、饲养层细胞应在使的前一天制备好，这样才能分泌足够的细胞因子。
三、选择性培养原理：在HAT培养基中，未融合的骨髓瘤细胞因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，不能利用补救途径合成DNA而死亡。
未融合的淋巴细胞虽具有次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。
只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶，并具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性，因此能在HAT培养基中存活和增殖。
（1）接种24孔板或96孔板5天后，用HAT培养基换出1/2培养基。
（2）7-10天后用HT培养基换出HAT培养基；（第14天后可用普通完全培养基）。
PS:1、经常观察杂交瘤细胞生长情况，待其长至孔底面积1/10以上时吸出上清供抗体检测。
四、杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化杂交瘤细胞在融合后2周左右即可筛选，选用抗体检测方法的原则是快速、敏感、特异、可靠、花费小和节省人力，通常根据所研究的抗原和实验室的条件而定，一般制备单抗的目的决定了筛选克隆所用的方法。
由于融合后，细胞上清份数多，但每份体积有限，因此ELISA是最适合用于初步筛选的方法。
经过ELISA筛选出的阳性克隆即可进行克隆化，因为如果不进行克隆化，当阳性孔有非抗体分泌型的杂交瘤时，非抗体分泌型的杂交瘤由于生长速度更快，将会占主导生长，最终很难分离出目标杂交瘤以至丢失。
另外杂交瘤细胞培养的初期是不稳定的，有的细胞丢失部分染色体，可能丧失产生抗体的能力。
通常在得到针对预定抗原的杂交瘤以后需连续进行2-3次克隆化，有时还需进行多次。
克隆化的方法很多，如有限稀释法、软琼脂法、单细胞显微操作法、单克隆细胞集团显微操作法和荧光激活细胞分类仪（FACS）分离法。
（1）包被将抗原以pH 9.6的NaCO3-NaHCO3包被，每块酶标板以5-20 ug抗原为宜（如果抗原为多肽或小分子物质，则需要加大包被量）。
每孔的包被体积为50-100 ul。
37 ℃包被2 h或4 ℃包被过夜。
（2）封闭倒掉抗原，拍干酶标板孔内液体，以0.5-1% BSA（用PBST溶解）或5% 脱脂牛奶（PBST溶解）或1% 明胶（PBST溶解）于37 ℃封闭2 h或4 ℃封闭过夜，也可以使用10%小牛血清或其它无关物种血清封闭。
封闭完后可立即使用，也可以洗涤一次置于4 ℃密封保存以备后面使用。
（3）一抗封闭完后，弃去孔内液体，拍干，加入待检测细胞上清，每孔100 ul为宜。
在每块板子上做好记号。
37 ℃孵育1 h。
（4）二抗孵育完一抗后，弃去孔内液体，拍干，以PBST洗涤3次，每次5min。
根据二抗说明稀释好二抗，每孔加入100 ul.37 ℃孵育1 h。
（5）显色孵育完二抗后，弃去孔内液体，拍干，加入显色剂。
待颜色最深时用终止液终止反应。
用酶标仪读出各孔OD值，选择出阳性孔。
（1）有限稀释法从有限稀释的原理以及影响因素可以知道，其克隆化结果应该是一个修正的泊松分布：式中λ在有限稀释里的意义是稀释时设计的每孔细胞的平均数,k则代表可能出现的细胞个数。
材料：a、96孔细胞培养板等；b、HT培养基；c、活力强的杂交瘤细胞；d、小鼠腹腔细胞。
方法：a、制备饲养细胞（小鼠腹腔细胞）。
b、制备待克隆的杂交瘤细胞悬液，用含20%血清的HT 培养基稀释至每毫升含2.5、15和50个细胞3中不同的稀释度。
c、按每毫升加入5×104-1×105细胞的比例，在上述杂交瘤细胞悬液中分别加入腹腔巨噬细胞。
d、每种杂交瘤细胞分装96孔板一块，每个稀释度32孔，每孔量为0.2ml，每孔的杂交瘤细胞数分别为0.5、3和10。
e、37℃、7.5% CO2湿润培养7-10天，出现肉眼可见的克隆即可检测抗体；在倒置显微镜下观察，标出只有单个克隆生长的孔，取上清作抗体检测。
f、取抗体检测阳性孔的细胞扩大培养，并冻存。
g、本法中（b）、（c）、（d）也可简化为将计数后的杂交瘤细胞准确地进行系列稀释，直至每毫升含10个细胞，按每孔接种0.1ml细胞悬液，即每孔含1个细胞。