单克隆抗体制备实验过程
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单克隆抗体制备实验过程
一、免疫动物
免疫动物是用目的抗原免疫小鼠,使小鼠产生致敏B淋巴细胞的过程。一般选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠,按照预先制定的免疫方案进行免疫注射。抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官,刺激相应B淋巴细胞克隆,使其活化、增殖,并分化成为致敏B 淋巴细胞。
说明:FCA,弗氏完全佐剂;FIA,弗氏不完全佐剂;Quickantibody,北京康碧泉公司研制的佐剂。上表中第四种免疫方法产生的抗体大部份都为IgM,存在亲和力弱等缺点,慎用。
PS:1、一般皮下注射每个注射点注射30-50ul左右混有佐剂的抗原,每只小鼠注射6-8个点为宜。
2、腹腔注射时,如果抗原混有弗氏佐剂,建议注射在左侧腹腔,如果采用右侧腹腔注射,则在免疫过程中,很容易导致小鼠脾脏与腹膜粘连的情况,造成后期取出脾脏麻烦。
3、冲击免疫完成后,应在96小时内完成细胞融合,否则相应的B细胞数量会下降到未冲击前的水平。
二、细胞融合(Cell fusion)
【材料和试剂】
(1)骨髓瘤细胞悬液选好骨髓瘤细胞株,取体外培养对数生长期细胞或体内生长的肿瘤分离骨髓瘤细胞,制备细胞悬液。
(2)免疫小鼠脾细胞悬液取3天前加强免疫的小鼠,眼眶放血,•分离血清冻存备用。拉颈处死小鼠,浸泡于75%酒精中3~5min。无菌操作取出脾脏,置入盛有5ml不完全培养液的平皿中洗涤,剪去
周围的结缔组织,将脾脏移入另一盛有5ml不完全培养液的平皿中的钢网上,先用剪刀剪成3~5个小块,然后用注射器内芯研磨。将脾脏细胞悬液移至50ml离心管中,加不完全培养液50ml,1000r/min 离心5min,弃上清,再以同法洗涤离心一次。然后将沉淀细胞重新悬浮于10ml不完全培养液中,计活细胞数,一般一只小鼠可得0.5~2×108个脾细胞。
(3)饲养细胞将小鼠致死、体表消毒和固定后,用消毒剪镊从后腹掀起腹部皮肤,暴露腹膜。用酒精棉球擦拭腹膜消毒。用注射器注射10ml不完全培养基至腹腔,注意避免穿入肠管。右手固定注射器,使针头留置在腹腔内,左手持酒精棉球轻轻按摩腹部1分钟,随后吸出注入的培养液。1000r/min离心5-10分钟,弃上清。先用5ml HAT培养基将沉淀细胞悬浮,根据细胞计数结果,补加HAT培养基,使细胞浓度为2×105/ml,备用。
(4)主要试剂的配制
①细胞培养基杂交瘤技术中使用的细胞培养基主要有RPMI-1640或DMEM (Dulberco Modified Eagles Medium)两种基础培养基,配好后过滤除菌(0.22um),分装,4℃保存。
不完全RPMI-1640培养基:
不完全DMEM培养基:
完全RPMI-1640或DMEM培养基:
HT或HAT培养基:
称取1.76mg氨基喋呤(Aminopterin MW 440.4),溶于90ml超纯水或四蒸水中,滴加1mol/L NaOH 0.5ml中和,再补加超纯水或四蒸水至100ml。过滤除菌,分装小瓶(2ml/瓶),-20℃保存。
③次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷(HT)贮存液(100×,H:10-2mol/L,T:1.6×10-3mol/L)
称取136.1mg次黄嘌呤(Hypoxanthine,MW 136.1)和38.8mg胸腺嘧啶核苷(Thymidine,MW 242.2),加超纯水或四蒸水至100ml,置45-50℃水浴中使完全溶解,过滤除菌,分装小瓶(2ml/瓶),-20℃冻存。用前可置37℃加温助溶。
④L-谷氨酰胺(L.G.)溶液(100×,0.2mol/L)
称取2.92g L-谷氨酰胺(L-glutamine,MW 146.15),用100ml不完全培养液或超纯水(或四蒸水)溶解,过滤除菌,分装小瓶(4-5ml/瓶),-20℃冻存。
⑤青、链霉素(双抗)溶液(100×)
取青霉素G(钠盐)100万单位和链霉素(硫酸盐)1g,溶于100ml灭菌超纯水或四蒸水中,分装小瓶(4-5ml/瓶),-20℃冻存。
溶液
⑥7.5% NaHCO
3
7.5g,溶于100ml超纯水或四蒸水中,过滤除菌,分装
称取分析纯NaHCO
3
小瓶(4-5ml/瓶),盖紧瓶塞,4℃保存。
⑦HEPES溶液(1mol/L)
称取23.83g HEPES(N-2-Hydroxyethylpiperazine-N,-2-ethanesulfonic acid,N-2-羟乙基哌嗪- N,-2-乙基磺酸,MW 238.3)溶于100ml超纯水或四蒸水中,过滤除菌,分装小瓶(4-5ml/瓶),4℃保存。
⑧8-氮鸟嘌呤贮存液(100×)
称取200mg 8-氮鸟嘌呤(8-azaguanine,MW 152.1),加入4mol/L NaOH 1ml,待其溶解后,加入超纯水或四蒸水99ml,过滤除菌;分装小瓶,-20℃冻存。使用时按1%浓度加入到培养液中(即终浓度为20ug/ml)。
⑨50% PEG
称取PEG 1000 或4000 20-50g于三角瓶中,盖紧,60-80℃水浴融化,0.6ml 分装于青霉素小瓶中,盖紧,8磅高压蒸汽15分钟,-20℃存放备用。临用前加
调PH至8.0,或购买Sigma 热融化,加等量不完全培养基,用少许7.5% NaHCO
3
或Gibco公司现成产品。
(5)24孔及96孔培养板等细胞培养所用材料和试剂。
【操作步骤】
(1)将准备好的骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按1:5~1:10比例混合,•加入20~50ml RPMI-1640液。
(2)1000r/min×6~10min离心弃上清,将上清尽量吸净。
(3)用手指轻轻击打离心管底部,使沉淀细胞分散,将离心管置37℃水浴中。
(4)吸取1ml 37℃预温的50%PEG•缓慢滴入离心管内,45秒