小鼠睾丸细胞染色体标本的制备及观察

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科目细胞生物学实验题目小鼠睾丸细胞染色体标本的制备及观察学号

小鼠睾丸细胞染色体标本的制备及观察

一．实验目的

1．了解快速制备动物染色体标本的方法，掌握小鼠睾丸细胞染色体标本的制备方法。

2．观察小鼠睾丸染色体的数目及其形态特征。

3．掌握小鼠睾丸染色体标本制备基本过程，了解操作步骤的原理。

二．实验原理

（一）染色体

染色体是基因的载体。真核细胞染色体的数目和结构是重要的遗传指标之一。制备染色体标本无疑是细胞学最基本的技术之一，优良的染色体制片是进行染色体显带、组型分析、原位杂交等的先决条件。

染色体的制备在原则上可以从所有发生有丝分裂的组织和细胞悬浮液中得到。最常用的途径是从骨髓细胞、血淋巴细胞和组织培养的细胞中制备染色体。本实验采用的方法是从小鼠的睾丸细胞中获取。

染色体的形态结构在细胞增殖周期中是不断地运动变化的，一般在有丝分裂中期，染色体的形态最典型、最易辨认和区分。因此，制备染色体标本获取的是中期细胞。

染色体特征：

1.数目（2n=？）

2.长度（绝对长度、相对长度）

3.着丝粒位置（M/SM/ST/T）

4.随体与次溢痕的数目、大小和位置

5.带型分析

（二）操作方法

小型动物的染色体制片最好最有效的材料就是骨髓组织（由于分裂活动旺盛，睾丸也可以）。利用睾丸细胞的制片技术虽然需要离心以及细致的操作，但其基本程序是简便的。在小鼠睾丸中，细胞有丝分裂和减数分裂比较旺盛，因此不需要体外培养就可以直接得到分裂中期细胞。通过小鼠睾丸得到染色体比较简便，一般不需要无菌操作。用秋水仙素作为有丝分裂的抑制剂。

由于小鼠睾丸细胞分裂活动旺盛，具有高度的分裂能力，本实验采用这一材料，通过前处理、低渗、固定、制片、染色等步骤制得染色体标本，可观察到许多处于分裂中期的染色体，可以进行染色体组型分析。

减数分裂是细胞分裂染色体数目减半时发生在性细胞的形成过程中。哺乳动物在性成熟以后，精巢内的性细胞总是在分批分期不断的成熟，因此，对哺乳动物的精巢进行一定的技术处理，随时都可以获得减数分裂过程中各个时期染色体的标本。

用适量的秋水仙素溶液注入动物腹腔内，可以阻止分裂细胞纺锤丝的形成，

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从而积累大量处于分裂中期的细胞。利用上述原理，通过常规的制片方法，观察小鼠睾丸细胞的染色体。

（三）Giemsa染色法

MGG由May-Grunwald染料和Giemsa染料组成。前者化学名为曙红亚甲基蓝Ⅱ，对胞质着色较好；后者对胞核着色较好。因此MGG染色，可兼两者的优点，常用于细胞涂片染色。

染色结果：染色将细胞核染成紫红色，细胞质和核仁染成蓝紫色。

其优点：染色方法简单，且兼有瑞氏、姬氏两种染色的优点，并且涂片可保存十多年而不退色。MGG染色对胞质胞核染色效果均较好，结构清晰，所染细胞亦比HE染色的细胞大；同时对细菌、霉菌及胆固醇结晶的显示也很清楚。因此适用于淋巴造血系统的细胞标本、胸腹水、穿刺标本等。尤其对鉴别恶性淋巴瘤的类型，MGG染色更有帮助。

三．实验材料

1．材料

小白鼠。

2．试剂

秋水仙素、0.3% KCl、固定液（甲醇：冰醋酸=3:1）、0.9%的NaCl 、Giemsa 染液等。

3．器材

注射器、针头、解剖盘、解剖剪、镊子、玻璃吸管、10ml刻度的离心管、离心机、载玻片（冰片）、显微镜、铜网、擦镜纸、小烧杯、吸水纸、天平等。四．实验步骤

实验步骤：预处理→取睾丸→剪碎→离心→低渗→离心→固定→离心→固定→滴片→染色→观察

1．取雄性小鼠以每克体重4μｇ注射秋水仙素，经14～16小时后，断头法杀死小鼠，取出睾丸用生理盐水（0.9%的NaCl）洗去血污。

2．放入装有1ml 0.3%KCl液的小烧杯中剪碎（呈乳白色）。

3．用铜网过滤到刻度离心管中，再加0.3%KCl液至4ml。

4．37℃静置30min，进行低渗处理。

5．离心：800-1000r/min 离心8 min ,弃上清。

6．加入2ml甲醇冰醋酸固定液（3:1），并用吸管吹气，轻轻打散细胞，固定8min。7．再以800-1000r/min离心8 min。

8．弃去上清液，加1ml固定液，制成细胞悬液固定5min。

9．取洁净的低温预冷载片，距载片10～15cm高度滴下2～3滴细胞悬液，从载片一边向另一边轻轻吹气，并同时轻轻敲打载片，以使细胞均匀分布和促使染色体展开。

10．用滤纸擦去载片上多余液体，在背面做上标记，空气干燥。

11．用 Giemsa染色20-30min(采用倒置染色法，目的在于可使载玻片充分接触

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染液，若有杂质也可沉降至底部，不会和玻片直接接触)，细水冲洗玻片背面，去多余染液，气干。

11．镜检：低倍镜下寻找分散良好、染色适中的分裂相，高倍镜下观察染色体形态并计数。

五．实验结果

1.实验结果如下图所示

图1 小鼠睾丸细胞中期染色体观察图（10×40）

图2 小鼠睾丸细胞中期染色体观察图放大图（10×40）

由图2，能看到清晰的分裂中期的染色体，清楚地看到着丝点。可以大致数出染色体的数目为32条。视野中还有许多细胞的染色体没有完全展开，或者没有破裂，可能原因有：滴片时的高度过低，导致细胞没有破裂，或者是低渗处理没处理好，染色体没充分展开。

六．思考与讨论

1．注意事项

⑴用一定剂量的秋水仙素破坏纺锤丝的形成，使细胞分裂停滞在中期,使中期染色体停留在赤道面处。