酶解核桃粕制备降压肽工艺优化

碱性蛋白酶水解核桃粕制备降压肽工艺优化
小组成员：席嘉佩刘淑霞程瑶瑶
编号：SRP2015187
降压肽作为一种ACE抑制剂可以预防、降低高血压疾病的威胁，而血管紧张素转化酶（ACE）是一种广泛存在于人体组织及血浆中的含锌二肽羧基肽酶。

通过对肾素-血管紧张素系统（RAS）和激肽释放酶-激肽系统（KKS）的控制，ACE可实现对人体血压的控制[1, 2]。

现已有众多人工合成药物（ACE抑制剂）如卡托普利、依那普利等用以治疗高血压[3]，但因长期服用后会丧失味觉、损害肾功能，甚至会影响神经方面的行为[4]故而从食源性蛋白中直接提取或酶法水解得到安全无毒的ACE抑制剂成为食品和医药学界最热门的课题之一[5]。

目前，国内外学者成功从鸡蛋蛋白[6]、牡蛎蛋白、大豆蛋白[8]、蚕蛹蛋白、海地瓜蛋白[10, 11]、花生蛋白[12]等蛋白水解液中分离得到高水解活性的ACE抑制肽。

从食源性植物蛋白中得到的ACE 抑制肽受到广泛关注，已被列为国家“九五”计划项目的生物活性肽研究[13]，利用现代生物技术对蛋白质进行深加工，在未来有良好发展前景。

核桃是一种营养和经济价值都很高的珍贵果木，2014年6月数据显示我国核桃年产50万吨，但由于对核桃的开发利用远远不够，产品附加值低，造成了资源严重浪费。

目前，核桃粕多用于动物饲料的制作，国内外对核桃粕深加工利用研究较少，对核桃蛋白进行的大量研究多集中在分离纯化、功能特性、营养价值上[14, 15]。

酶法水解核桃蛋白制备降血压肽[8, 16]操作条件温和容易控制，同时还可以提高核桃蛋白的利用率及营养价值。

脱脂核桃粕中蛋白含量高达86.67%，以其作为原料酶解制得ACE抑制肽，不但可以拓展食源性可辅助降压的蛋白原料提取来源，而且可以促进核桃粕深加工，实现资源综合利用，有良好现实意义及经济价值。

本实验以脱脂核桃粕为原料，以水解度和ACE抑制率为指标，使用风味蛋白酶对核桃蛋白进行酶解，采用响应面法优化酶解工艺，以得到高水解活性的ACE抑制肽，为核桃综合利用和深加工技术发展提供理论支持及后期发展提供技术支持。

1材料与方法
1.1材料
1.1.1实验材料、主要试剂
核桃粕购于康福寿核桃油加工有限公司；
木瓜蛋白酶、风味蛋白酶购于sigma公司；
中性蛋白酶购于北京博奥拓达科技有限公司；
正己烷、盐酸、浓硫酸、氢氧化钠、浓硫酸、硫酸铜、硫酸钾等均为国产分析级。

1.1.2仪器
快速恒温数显水浴锅金坛市医疗仪器厂；
PHS-3C雷磁pH计上海精科仪器；
BS 2000 S电子天平北京赛多利斯科学仪器有限公司；
ELx808酶标仪Thermo公司；
冷冻干燥器上海爱朗仪器有限公司；
PDU-1200冷冻干燥机北京四环科学仪器厂；
SH 21-1磁力搅拌器上海梅颖浦仪表制造有限公司；
DNP-9272电热恒温培养箱上海精宏实验设备有限公司；
Neofuge 15R台式高速冷冻离心机力康发展有限公司；
紫外分光光度计上海市浦东张江高科技园区；
GRX-9073A型热空气消毒箱上海一恒科技有限公司；
EQ-200VDE型双频数控超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司
1.2原料组分分析
蛋白质含量测定：凯氏定氮法，GB5009.5-2010；
粗脂肪含量测定：索氏抽提法，GB5497285；
水分含量测定：105℃恒质量法，GB5512285；
灰分的测定：550-600℃灰化法，GB/T550528；
总糖含量测定：还原糖测定方法，GB/T 5009.7-2008；
1.3核桃脱脂粕制备
核桃粕经粉碎后过80目筛，收集后用正己烷：核桃粕粉5：1（v/m）的比例在磁力搅拌器上提取1h后抽滤，取滤渣，重复用正己烷提取，直到滤液无色透明，收集滤渣得脱脂核桃粉，通过95%醇洗（100：1，V/m），过滤，滤饼于恒温干燥箱干燥12h，处理好的核桃粉装于中型广口瓶于4℃冰箱保存备用。

1.4核桃蛋白提取
采用碱溶酸沉法，参照周慧江[16]、毛晓英[17]等的方法提取核桃蛋白。

取10g核桃粉，加入260ml去离子水，用2mol/LNaOH调节pH至11.0，在53℃下用磁力搅拌机搅拌1.5h，7000r/min常温离心15min，取上清液，再用2mol/LHCL调节pH至4.5，搅拌1h，7000r/min 常温离心15min,收集沉淀得核桃蛋白，调节pH至中性后用冷冻干燥机冻干，于4℃冰箱保存备用。

1.5酶解工艺
水解底物（料液比）→灭酶（90℃，10-15min）→冷却→调pH（3mol/L的NaOH ）→加一定量蛋白酶→水解（温度，时间）→灭酶（90℃，10-15min）→冷却至室温→离心（8000r/min,15min）→取上清液→测产物ACE抑制率和水解度
1.6蛋白酶筛选
各种蛋白酶对WPI的酶切位点的不同，为使酶解反应充分进行，使酶显示最高活性，需选用适
宜蛋白酶。

准确配置20g/L的蛋白质溶液，分别将中性蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶三种蛋白酶，在酶添加量8000U/g、各自的最适温度和pH条件下按酶解工艺流程水解4h，测定ACE抑制率和水解度。

酶解条件见表1。

和水解度。

表1 四种商业酶最适作用条件和酶活力
Table 1 The optimum hydrolysis conditions and the enzymatic activity of four commercial enzymes
酶种类最适pH 最适温度(℃) 酶活力(U/g)
碱性蛋白酶8.5 50 7.1×104
中性蛋白酶7.0 40 6.3×105
风味蛋白酶 6.5 50 2.0×104
木瓜蛋白酶 6.8 55 8.2×105
表
1.7单因素实验条件确定
以核桃降压肽的ACE抑制率及水解度为指标分别考察底物浓度（g/L），蛋白酶添加量（U/g），酶解时间（h），酶解温度(℃)和pH对ACE抑制肽制备的影响，进行单因素实验。

1.7.1蛋白酶添加量确定
最优蛋白酶在最适pH和温度条件下，反应时间2h，底物浓度20g/L，设定加酶量2000U/g、3000U/g、4000U/g、5000U/g、6000U/g、7000 U/g六个水平，考察ACE抑制率和水解度的变化趋势。

1.7.2蛋白酶的反应时间确定
最优蛋白酶在最适pH和温度条件下，底物浓度20 g/L,加酶量5000U/g，设定反应时间 1.5h、2.0h、2.5h、3.0h、3.5h、4.0h六个水平，考察ACE抑制率和水解度的变化趋势。

1.7.3底物浓度确定
最优蛋白酶在最适pH和温度条件下，反应时间2h,加酶量5000U/g，设定底物浓度5g/L、10g/L、15g/L、20g/L、25g/L、30g/L六个水平，考察ACE抑制率和水解度的变化趋势。

1.7.4最优蛋白酶pH 的确定
最优蛋白酶在最适温度条件下，反应时间2h，底物浓度20 g/L，加酶量5000U/g，设定pH为5.5、6.0、6.5 、7.0 、7.5、8.0 六个水平，考察ACE抑制率和水解度的变化趋势。

1.7.5最优蛋白酶酶解温度的确定
最优蛋白酶在最适pH下，反应时间2h，底物浓度20 g/L，加酶量5000U/g，设定温度40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃六个水平，考察ACE抑制率和水解度的变化趋势。

2检测指标
2.1水解度测定
采用pH-Stat法来测定WPI 酶解物的DH%。

酶解 WPI 的主要目标物是活性肽，使用的酶大多为内切蛋白酶。

在水解过程中，释放的氨基酸会使溶液pH 明显下降，所以将pH 稳定在8.5左右，每隔一段时间记录加入的碱液（NaOH 溶液）消耗量来计算水解度[18]。

p
ax a
m h N B DH ⨯⨯⨯⨯=
α100%
B 为碱液消耗的体积/mL ，a N 为碱液的浓度，α为α-2NH 的平均解离度，，ax h 为底物蛋白总肽键数/（mmol/g Pro ）取8.38，p m 为蛋白质量/g 。

2.2 ACE 抑制率测定
采用分光光度法进行ACE 抑制率的测定。

按表2 设计，在96孔酶标板上添加反应物， 340nm 波长下用酶标仪测定吸光值A1；37℃反应30min ，测定吸光值A2，做3组平行。

ACE 抑制率计算公式如下：
100-1(%)a ⨯⎪⎪⎭⎫
⎝
⎛∆∆=b A A ACE 抑制率 ； 21A A A -=∆
式中：ΔA b 为加入缓冲基质时吸光度在30min 内变化；ΔA a 为加入抑制剂时吸光度在30min 内的变化。

测定见表2。

表2 ACE 抑制活性的测定
Table 2.The determination of ACE inhibition activity
添加物 样品孔/uL
空白孔/uL
ACE(U/mL) 10 10 FAPGG(1mmol/L) 50 50 ACE 抑制剂 40 0 超纯水
40
1、FAPGG （测血管紧张素转换酶的底物）（1.0 mmol/L ）:取3.994mgFAPGG 加基质缓冲液2定容至10mL ，溶解混合，于4℃避光放置；
2、基质缓冲液1：pH8.
3、100mmol/L 的硼酸缓冲液；
3、基质缓冲液2：pH8.3、100mmol/L 的硼酸缓冲液（含300mmol/LNaCl ）。

3数据统计分析
采用 Excel 、origin8.0、design-expert7.0数据处理软件进行分析处理，每组实验的数据均进行3次平行实验进行验证。

4结果与讨论 4.1核桃粕的组分分析
表3. 核桃粕的组分分析
Table 3. The main component analysis of walnut meal
原料蛋白质粗脂肪水分灰分总糖核桃粕(%) 29.65±1.25 11.95±0.15 10.19±0.45 6.24±0.12 18.45±0.22 核桃蛋白(%) 86.67±0.98 0.72±0.23 5.10±0.56 3.91±0.27 7.56±0.31 表4中可以得出，核桃粕提取的粗蛋白中提取得到的蛋白质含量可达到86.67%，说明该核桃粕原料具有很好的利用价值，并且其脂肪含量仅0.72%，达到了分离蛋白的要求，可作为酶解制备核桃降压肽的原料。

4.2蛋白酶筛选
图1 不同类型水解酶对酶解效果的影响
Fig.1.The effect of different types of effects on enzyme hydrolysis
由图 1 可知，四种蛋白酶对核桃粕蛋白酶解效果差异显著，这与蛋白酶的特异性有关。

其中碱性蛋白酶酶解效果最好，水解度可达18.7%，ACE抑制率达60.31%。

因为不同蛋白酶对底物的酶切位点不同，所产生的酶解物中游离氨基酸种类和肽段分子量存在较大差异，导致水解度[19]呈现较大区别。

从余娅[20]的实验可知，ACE抑制率强弱与短肽的相对分子质量有关。

使用风味蛋白酶水解核桃蛋白后产生的长度适宜的短肽数目最多，最适宜用来提取ACE抑制剂，可为将来产业化生产提供理论依据。

4.3蛋白酶酶解工艺
4.3单因素实验
4.3.1 pH对水解度和酶解液ACE抑制率的影响
表4 pH对水解度和酶解液ACE抑制率的影响
图2 pH对酶解液ACE抑制率和水解度影响
Fig.2 The influence of enzyme solution ACE inhibition rate and Hydrolysis degree by pH
4.3.2底物质量浓度对水解度和酶解液ACE抑制率的影响
表5 底物质量浓度对水解度和酶解液ACE抑制率的影响
图3 底物质量浓度对酶解液ACE抑制率和水解度影响
Fig.3 The influence of enzyme solution ACE inhibition rate and Hydrolysis degree by substrate concentration
4.3.3温度对水解度和酶解液ACE抑制率的影响
表6 温度对水解度和酶解液ACE抑制率的影响
图4 酶解温度对酶解液ACE抑制率和水解度影响
Fig.4 The influence of enzyme solution ACE inhibition rate and Hydrolysis degree by temperature
4.3.4加酶量对水解度和酶解液ACE抑制率的影响
表7 加酶量对水解度和酶解液ACE抑制率的影响
图5 加酶量对酶解液ACE抑制率和水解度影响
Fig.5 The influence of enzyme solution ACE inhibition rate and Hydrolysis degree by enzyme dosage 4.3.5酶解时间对水解度和酶解液ACE抑制率的影响
表8 酶解时间对水解度和酶解液ACE抑制率的影响
图6 酶解时间对酶解液ACE 抑制率和水解度影响
Fig.6 The influence of enzyme solution ACE inhibition rate and Hydrolysis degree by time
5 后期试验计划
5.1 核桃降压肽制备的单因素实验和响应面实验设计
在单因素研究的基础上，选取最优的温度(℃)、底物质量浓度(g/L)、加酶量(U/g)和pH 四个因素为响应变量，以ACE 抑制率为响应值，设计响应面分析实验。

因素水平及编码表见表2。

表9 因素水平及编码表
Table 9 The table of factors and level
水平 A pH B 酶解温度 /(℃) C 底物质量浓度
/(g/L) D 加酶量 /(U/g) -1 8.0 50 20 6000 0 8.5 55 30 7000 1
9.0
60
40
8000
5.2 验证试验
通过对Design-Expert 7.0软件进行分析，并做验证性试验，根据实验室条件调整酶解工艺参数。

若最终得到结果与软件得到的理论预测值接近，则说明碱性蛋白酶酶解WPI 得到核桃来源的ACE 可行且工艺最优。

6结论
(1) 研究分别用四种蛋白酶：碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和风味蛋白酶酶解核桃蛋白制备核桃降压肽，以酶解液的ACE 抑制率、水解度为指标，选出制备核桃降压肽的最优用酶，对比
结果筛选碱性蛋白酶为最优用酶。

(2) 实验用碱性蛋白酶水解核桃蛋白制备降压肽，最优工艺确定为：底物浓度15g/L、加酶量7000U/g、pH8.5，酶解温度55℃，酶解3h。

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