肝细胞原代培养实验方案
遗传学实验课：实验一肝细胞的原代分离与培养
血球计数板使用方法
• 静置片刻，待细胞沉降到计数板，不再随液 体漂流
• 如细胞位于大方格的双线上，计数时则数上 线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。
血球计数板使用方法
• 计数重复3次，取其平均值 • 使用完毕，用自来水清洗血球计数板，勿用
硬物洗刷
• 计数板计算公式
细胞数/ml=(4个大方格内的细胞数/4)×104×稀释倍数
细胞存活率计算
• 细胞存活率=活细胞数/细胞总数×100%
思考题
• 1、什么是细胞的原代培养与传代培养？ • 2、除了台酚蓝染液，还有哪些染液可用于细胞死活
的鉴定？ • 3、简述采用灌流方法分离肝细胞的技术有哪些？ • 4、血球计数板的使用方法及注意事项？并计算本实
验中的细胞数量。
操作步骤
3、用手术剪将肝脏剪成小块（约1mm3）， 再用玻片充分研磨，转移到离心管，离心 1000 rpm，5min。
注意：玻片研磨既需要充分又不能用力太大
操作步骤
4、视组织或细胞量加入5-6倍（3-5mL）胰酶， 37℃水浴中消化20分钟，每隔5分钟振荡一 次，或用吸管轻柔吹打一次，使细胞分离。
操作步骤
2、用针头将小鼠四肢固定在泡沫板上,腹部朝上。镊 子捏起腹部皮肤，剪刀剪一小口，暴露腹壁。
注意：不要一刀剪破腹壁，这样毛容易进入腹腔， 里面就不是无菌的了。 镊子夹起腹壁，剪开腹腔，取出肝脏，置于培养 皿中，剔除脂肪、结缔组织、血液等杂物，转移 到另一个盛有PBS液的平皿中。
镊子捏起腹部皮肤，剪刀剪一小口，暴露腹壁。 镊子夹起腹壁，剪开腹腔，取出肝脏，
9、细胞计数前，先用台酚蓝染料染色，细胞悬液与 0.4%台酚蓝溶液以9:1混合均匀，用血球计数板计 数，计数活细胞。
细胞毒理学实验一小鼠肝细胞原代培养
6. 用手术剪将肝脏剪成小块（1mm3）,无血清培养基 冲洗三次。
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7. 将组织转移到一次性培养皿中，排列贴附于皿底。 组织块间间隔约0.5-1cm,静置数分钟。
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8. 待组织粘附后，缓缓加入含血清的培养基，切勿 将组织块冲起，做好标记，转入培养箱培养，镜 检观察。
② 实验后，请将解剖器械、离心管冲洗干净（自来水-去 离子水-三蒸水），放入烘箱烘干，超净工作台内擦拭 干净，酒精喷洒消毒，并将酒精擦干净，打开紫外灯 灭菌。
③ 各个实验小组的同学负责将垃圾带走，值日生打扫实 验室卫生。
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光源
目镜 光亮度调节
电源开关
环状光阑
物镜 粗/细准焦螺旋
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取出的剩余肝组织充分剪碎后，用剪过的蓝枪头将其转入离心 管，1000rpm离心5min，弃上清，根据组织量的多少加入 0.25%胰蛋白酶1-1.5ml。
37℃水浴消化约10-15min，每间隔5min，振荡一次，促使 细胞分离。
待组织变得疏松，略发白时，加入1ml含血清的DMEM培养 基，终止胰蛋白酶的消化作用。
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1. 总结原代培养的实验步骤以及在操作过程中需要 注意的问题。
2. 绘图表示所观察到的实验结果，并对其予以分析。
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1. 你认为原代培养中最关键的步骤是什么？为什么？ 2. 在毒理实验的检测中，原代培养细胞具有什么样
的优势？
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2. 将胎鼠或新生小鼠引颈处死，置于75%消毒酒精浸 泡2~3s，带入超净工作台。
大鼠肝星状细胞原代培养实验具体步骤及方法
大鼠肝星状细胞原代培养实验具体步骤及方法将小鼠的肝细胞从机体中取出，经胰酶、螯合剂（常用EDTA）处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。
步骤一、实验材料准备1. 动物：雄性SD大鼠(体重250-450 g)。
2. 试剂：戊巴比妥钠，小牛血清(或胎牛血清，则更好)，DMEM，酶消化液I、Ⅱ(以HBSS配)，18% Nycodenz(以GBSS配)，D-Hanks' 液(KCl 0.4 g/L，KH2PO4 0.06g/L，NaCl 8.0 g/L，NaHCO3 0.35 g/L，Na2HPO4·7H2O 0.06 g/L或Na2HPO4 0.053 g/L，可加酚红0.02 g/L)，HBSS，台盼兰等。
3. 器械：手术器械，200目尼龙网，相差显微镜，荧光显微镜。
二、原代培养方法1. 大鼠腹腔麻醉后在超净台上剖腹，进行门静脉插管，以D-Hanks'液灌注，同时剪开下腔静脉，冲掉血液后，改灌以100 ml酶消化液I(0.05% IV型胶原酶)。
2. 待肝脏变软后，离体肝脏并剪碎，继续以酶消化液II(含20 U/ml DNase I的0.05% IV型胶原酶)消化15 min，尼龙网过滤后以450 g 离心5 min(4℃，下同)。
3. 以HBSS重悬沉淀至10 ml，再混以20 ml Nycodenz液，分置于离心管中，并分别覆以2-3 ml HBSS，1450 g离心16 min后取界面细胞。
4. 以HBSS重悬后再次离心收集细胞，以DMEM重悬后进行细胞计数，并判断存活率和产量，最后按照常规方法接种(105细胞/cm2)，次日换液，以后每2-3天换液一次。
三、传代方法弃去培液后以D-Hanks'液洗两次，加0.125%胰酶(原代最好加0.05% EDTA)消化，镜下观察细胞突起回缩(2-5 min左右)，以完全培液(DMEM+10% NBS)终止反应(若不用EDTA，可以不需离心)，充分吹打后以1:2-1:3接种，然后继续培养(5%CO2，37℃)。
原代肝细胞培养
原代肝细胞培养原代肝细胞培养1．实验材料灌流液：NaCl、KCl、NaH2PO4.2H2O、Na2HPO4.H2O、NaHCO3、HEPES、EDTA、Glucose （国药或阿拉丁）。
消化液：Collagenase IV（Yeasen，翊圣生物，产品货号：40510ES60，100 mg ，279￥）、CaCl2。
Percoll：Percoll（GE Healthcare，17-0891-02）我买的是分装的100ml，450￥的17-0891-01-1。
麻醉剂：10%水合氯醛。
实验器材：200目细胞筛、20ml 注射器、头皮针、手术剪3把、手术镊3把（实验前灭菌），细胞培养皿2个，离心机，实验前备冰盒及水浴锅，鼠板及大头针（实验前酒精及紫外消毒）。
2. 实验前准备1) 灌流液Perfusion SolutionNaCl KCl NaH2PO4.2H2O Na2HPO4.H2O NaHCO3 HEPES EDTA Glucose离子）。
用前37℃温育。
每只老鼠消耗15ml灌流液。
2）消化液100× CaCl2：560mg CaCl2，加入10 ml PBS/ ddH2O，分装-20℃保存。
10× CollagenaseIV：100 mgCollagenaseIV粉末溶于20 mlDMEM（无血清），0.22 uM滤膜过滤除菌，每管1.5ml分装。
消化液：13.5 mlDMEM（无血清）加入150 μl100× CaCl2（终浓度5 mM），再加入1.5 ml10× CollagenaseIV（终浓度0.5 mg/ml），于37℃温育。
每只老鼠消耗15ml消化液。
3）40%Percollg/L 8.0 0.4 0.078 0.151 0.35 2.380 0.19 0.9调节pH 7.2-7.4，配好后过滤除菌。
（不能高压灭菌，其中含葡萄糖及HCO3-16.2 ml 100%percoll原液，加入1.8 ml10×PBS，再加入27ml 1×PBS，得45 ml。
心肌细胞或肝细胞原代培养的方法
心肌细胞或肝细胞原代培养的方法下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。
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细胞生物学实验-小鼠肝细胞原代培养
小鼠肝细胞原代培养小鼠肝细胞原代培养实验目的：1.了解并掌握原代细胞培养的相关原理2.了解并掌握小鼠肝细胞原代培养的方法实验器材：二氧化碳培养箱、光学显微镜、无菌操作台、恒温水浴锅、酒精灯、培养皿、烧杯、镊子、酒精棉、离心管、电动移液器、移液管、细胞计数板、幼鼠、DMEM培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素、0.125％胰蛋白酶（含0.1%胶原酶）、D-Hanks或者PBS等。
原代培养是从供体中取得组织或细胞后在体外进行的首次培养。
原代培养不仅是建立各种细胞系的第一步，也是从事组织或细胞培养工作人员应熟悉和掌握的最基本的技术。
原代培养的组织或者细胞的生物学特性没有发生很大变化，仍具有二倍体遗传物质，最接近和反映体内生长特性，很适合作药物测试、基因表达测试、细胞分化等实验研究。
原代培养是获取细胞的主要手段，但原代培养的组织由多种成分组成，比较复杂，即使同一类型细胞如成纤维样细胞或上皮样细胞，细胞间也存在很大差异。
如果供体不同，即使组织类型、部位相同，个体差别也可以在细胞上反映出来。
因而原代细胞的部分生物学特征尚不稳定，如要做较为严格的对比性实验研究，还需要对原代培养的细胞进行短期传代后再进行（需要注意的是有些细胞在传代后可能会发生一些生物学特性的变化）。
一般采用2-5代的细胞进行实验。
当然特殊情况和一些终端分化细胞如神经细胞、巨噬细胞、心肌细胞除外。
原代培养的方法很多，最基本和最常用的为组织块原代培养法和离散细胞原代培养法（消化法）。
组织块原代培养：组织块原代培养法是原代细胞培养常用的基本方法，适用于各种组织的原代培养，特别是难以消化的组织，组织块原代培养法操作程序简单，培养前不经过酶液处理，细胞损伤较小。
但由于培养过程中细胞移动受到较大限制，完成原代培养所需的时间较长。
组织块培养的程序一般为：1.组织块修整：将组织块用平衡缓冲液反复冲洗，然后在灭菌的培养皿中剪碎至碎块的直径小于1mm3。
2.贴壁：将组织块间隔（小块之间的间隔为1cm）放在培养皿中，培养基需要浸没组织块底部但不能使组织块浮起。
小鼠肝细胞原代培养实验
小鼠肝细胞原代培养实验一、实验材料准备1. 动物：小鼠。
2. 试剂：DMEM(含血清)、无血清DMEM 培养基、胰酶、PBS 。
3. 器械：饭盒、纱布、小剪子、小镊子、大镊子、大烧杯、平皿、研磨玻片、滤网、离心管(15/50 ml)、6孔培养板、吸管、移液管、手套、微量加样器。
4. 准备：酒精擦拭台面后把物品摆放好，开紫外线灯照30分钟后开鼓风机吹至实验结束。
二、方法1. 将小鼠断颈致死，置75%酒精泡2-3秒钟，取肝脏，置于盛有PBS 的平皿中。
2. 剔除脂肪、结缔组织、血液等杂物，转移到另一个盛有PBS 液的平皿中。
实验方法原理将小鼠的肝细胞从机体中取出，经胰酶、螯合剂（常用EDTA ）处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。
实验材料小鼠试剂、试剂盒 DMEM 无血清DMEM 培养基胰酶PBS仪器、耗材饭盒纱布剪子镊子烧杯平皿研磨玻片滤网离心管6孔培养板吸管移液管手套微量加样器2.3 用手术剪将脏器剪成小块(大小约1mm2)，玻片研磨，转到离心管，离心(1 000 rpm，5 min)。
4. 视组织或细胞量加入5-6倍(3-5 ml)胰酶，37℃中消化20分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。
5. 加入3-5 ml含血清的培养液以中止胰酶消化作用。
6. 用100目孔径滤网滤过，除去未消化的大组织块。
7. 再次离心5 min，弃上清液。
8. 加入无血清培养液5 ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。
9. 加入含血清的培养液1-2 ml(视细胞量)，血球计数板计数。
10. 将细胞调整到5×105/ml左右，转移至6孔培养板中，37℃下培养。
原代肝细胞培养方法
原代肝细胞培养方法原代肝细胞培养是一种重要的技术手段，它可以使我们更好地理解肝细胞的生物学特性和功能，同时也被广泛应用于药物筛选、毒性研究和肝脏疾病模型的建立。
本文将探讨原代肝细胞培养的方法。
原代肝细胞是从动物（如小鼠、大鼠、猪等）或人体新鲜肝组织中分离得到的肝细胞。
它们具有种独立性和细胞特异性功能，是进行体外研究的理想模型细胞。
原代肝细胞培养的主要步骤包括：肝组织的分离、肝细胞的分离和纯化、肝细胞的培养和维持。
首先，肝组织的分离是原代肝细胞培养的起始步骤。
一般来说，选择健康的动物或人体捐赠的新鲜肝组织，快速解剖分离，并将其置于含有冷蘸过消毒的生理盐水或缓冲液的离心管中。
然后，用小剪刀对肝组织进行切细，使其暴露于细胞分离液或酶溶液中。
常用的细胞分离液包括肝素-胰酶、胰酶、胶原酶、凝集酶及胰蛋白酶。
这些酶能够降解结缔组织，使肝细胞从肝组织中游离出来。
接下来，肝细胞的分离和纯化是确保原代肝细胞培养成功的关键一步。
一般而言，将细胞分离液转移至新离心管，并用对应的培养基对其停滞，使浮游的肝细胞顺应性地附着在组织培养器皿的底部。
在培养基的作用下，非肝细胞（如纤维细胞和非肝上皮细胞）会悬浮离开，而肝细胞则紧密附着在培养器皿上。
此时，我们可以通过控制等粘附时间、细胞数目、培养基的组分和浓度，使纯化程度达到最佳。
然后，肝细胞的培养和维持是原代肝细胞培养的持续关键步骤。
首先，选择合适的培养基是非常重要的。
常用的培养基包括DMEM、威利精简培养基和L-15培养基等。
这些培养基中会添加适量的营养物质（如葡萄糖、氨基酸和维生素）和生长因子（如胰岛素、胆固醇和转铁蛋白）。
其次，细胞密度的控制也非常重要。
通常，当细胞趋于稳定时，可以通过减少培养皿内细胞的数量来避免细胞互相竞争和过度分泌胺碱酸等蛋白质。
此外，保持培养环境的稳定也是原代肝细胞培养的重要环节。
温度、湿度、CO₂浓度和培养基的更新等因素都会对肝细胞的生长和功能有一定的影响。
肝细胞原代培养标准操作规程
细胞培养室肝细胞原代培养标准操作规程实验试剂培养基：William’s E Medium(GiBCO 12551-032), 谷氨酰胺(GiBco 21051-024-100g)292mg/L，双抗（GiBco 15140-122 penicillin +10,000Units/mL, streptomycin +10,000μg /mL）5mL/500mL, 胰岛素(GiBCO 12585-014 4 mg/mL)8μg/mL, 地塞米松（中国药品生物制品检定所）5mg/L。
D-Hanks’液（CaCl2 0.55g/L, NaCl 8.0g/L, KCl 0.4g/L, KH2PO4 0.06g/L, Na2HPO4•7H2O 0.06g/L, NaHCO3 0.35g/L, 三蒸水溶解，NaHCO3调pH 7.2-7.4, 4℃保存）0.05%胶原酶Ⅳ溶液(（Sigma C5138-1G） D-Hanks’液溶解, 0.22μm微孔滤膜过滤除菌, -20℃保存）)PBS预灌流溶液（NaCl 8.0g/L, KCl 0.2g/L, KH2PO40.2g/L, Na2HPO4•7H2O 1.56g/L, EDTA 0.1mM, 三蒸水溶解, NaHCO3调pH 7.2-7.4, 0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存）鼠尾胶原（GiBCO A10483-01 20mL/ 瓶）（0.05 mg/ mL）用0.02M 的醋酸稀释,临用现配）0.02M 的醋酸：115μL的醋酸(大于99%)用水稀释至100mL0.05 mg/ mL-200μL鼠尾胶原（5 mg/ mL）用0.02M的醋酸稀释至20 mLOverlay(0.25 mg/ mL的Matrigel（BD 356237）(用William’s E Medium稀释，视具体批号而定稀释倍数，临用现配）Hanks’液（CaCl2 0.14g/L, NaCl 8.0g/L, KCl 0.4g/L, KH2PO4 0.06g/L, MgCl2•6H2O 0.10g/L, MgSO4.7H2O 0.10g/L, Na2HPO4•7H2O 0.09g/L, NaHCO3 0.35g/L, D-葡萄糖 1.0 g/L，三蒸水溶解，NaHCO3调pH 7.2附近，4℃保存）实验仪器CO2 恒温培养箱（日本SANYO 公司）；Sigma高速离心机；IX-51 型荧光倒置显微镜（日本尼康公司）；DHL-A电脑恒流泵（上海青浦沪西仪器厂）；液相-质谱联用分析系统（LC/MS/MS）由美国Thermo系列四元泵、在线脱气机、自动进样器、以及Thermo Finnigan LTQ线性离子阱质谱检测器，系统工作软件为XcaLibur（美国）；Sigma5310离心机；ZHWY-103B多振幅轨道式恒温培养振荡器（上海智城分析仪器制造有限公司）。
原代肝细胞培养
试验动物:８～９周龄健康雌性小鼠１０只。
供试小鼠自由饮食，二级饲养，试验前２４ｈ禁食。
主要试剂:1.Solution C:480Mm KCL120Mm MgSO4120Mm KH2PO42.Buffer A(1L):NaCL 7gNaHCO3 2g1M HEPES Ph7.45 5mlSolution c 10mlGlucose 1gAdd ddw and adjust pH to 7.43.灌洗液A:Buffer A with 1Mm EGTA +PS 过滤，37度温浴待用4.灌洗液B（50ml）：Buffer A with 5Mm CaCL2, 25mg胶原酶IV + PS 过滤，37度温浴待用5.胶原酶Ⅳ，购自Ｓｉｇｍａ公司；6.ＲＰＭＩ－１６４０细胞培养液7.透析胎牛血清（ＦＢＳ）8.青霉素－链霉素双抗9.0.4%的Trypan Blue：0.4g Trypan Blue to 100ml ddw用NaOH调PH值7.2-7.3, 4度储存。
步骤:1.经腹部注射巴比妥钠（50-100ｍｇ／ｋｇ）麻醉供试小鼠，5-10min。
70％乙醇消毒皮肤后，将小鼠移至超净工作台，固定于消毒的聚乙烯泡沫板上.2.剪开小鼠腹部，剥离皮肤，将静脉留置针插入肝脏门静脉，剪开下腔静脉，灌注预热（37 ℃）的灌注液A，保持灌注液流速为10～15ｍＬ／ｍｉｎ3.至小鼠肝脏完全变灰黄、下腔静脉已无血丝流出时，改用３７～３８℃预热的灌注液B继续灌注小鼠肝脏，同时在下腔静脉插入留置针，通过医用输液管收集消化酶液，循环灌注液B，保持灌注液流速为10～15ｍＬ／ｍｉｎ，持续灌注10～15min，使肝脏完全充盈消化酶液；4.剪下整个肝脏组织，将肝脏置于60mm培养皿中用10％ＦＢＳ的ＲＰＭＩ－１６４０细胞培养液终止消化，撕去肝包膜，用移液管轻轻吹吸两次，经100目网过滤到50ml离心管中，去除未消化肝脏组织块，补至30ml，于室温下1500转/分钟（50-80g）离心5ｍｉｎ重复2-3次，收集纯化的小鼠肝细胞，将纯化的小鼠肝脏细胞重悬于10ｍＬＲＰＭＩ－１６４０培养液中。
小鼠原代肝细胞实验报告
一、实验目的1. 掌握小鼠原代肝细胞的分离和培养方法；2. 了解肝细胞在体外培养过程中的生物学特性；3. 探讨肝细胞培养条件对细胞生长和功能的影响。
二、实验材料1. 实验动物：昆明小鼠（体重20-25g）；2. 培养基：RPMI 1640培养基（含10%新生牛血清、1%双抗、1%非必需氨基酸、1%谷氨酰胺）；3. 试剂：0.25%胰蛋白酶、0.2%胶原酶、台盼蓝染色液；4. 仪器：超净工作台、倒置显微镜、离心机、培养箱等。
三、实验方法1. 小鼠原代肝细胞的分离（1）处死小鼠，取出肝脏；（2）将肝脏放入含有RPMI 1640培养基的培养皿中，用剪刀剪成1mm³左右的小块；（3）加入0.25%胰蛋白酶，37℃水浴消化10min；（4）加入0.2%胶原酶，37℃水浴消化30min；（5）消化过程中每隔5min轻轻摇动培养皿，使肝细胞充分释放；（6）消化结束后，将消化液过滤，收集肝细胞悬液；（7）用RPMI 1640培养基洗涤肝细胞悬液2次，去除未消化的组织碎片；（8）将肝细胞悬液离心（1000r/min，5min），弃去上清液；（9）用RPMI 1640培养基重悬肝细胞，调整细胞浓度为1×10⁶个/ml。
2. 肝细胞培养（1）将肝细胞悬液接种于培养皿中，置于37℃、5%CO₂的培养箱中培养；（2）每隔2-3天更换新鲜培养基；（3）观察肝细胞的生长情况，记录细胞贴壁、伸长、伪足形成等过程；（4）利用台盼蓝染色法检测细胞存活率；（5）观察肝细胞在培养过程中的形态学变化。
3. 肝细胞功能检测（1）收集培养24h后的肝细胞，用RPMI 1640培养基洗涤2次；（2）加入0.5%台酚蓝染液，37℃水浴染色30min；（3）用RPMI 1640培养基洗涤细胞，去除未结合的染料；（4）用酶标仪检测吸光度（A）值，计算肝细胞对台酚蓝的摄取量。
四、实验结果1. 肝细胞分离与培养（1）分离得到的肝细胞形态为圆形、椭圆形或不规则形，细胞核清晰可见；（2）细胞存活率约为64.1%；（3）细胞在培养过程中呈典型的上皮样细胞形态，胞浆内有空泡和脂滴，相邻细胞伸长的伪足相互连接。
肝细胞的原代培养
肝细胞的原代培养1．准备工作及肝细胞的分离（1）对所要用的工具和器械进行高温高压消毒，对所要的培养液，平衡盐溶液，蛋白酶消化液用微孔滤膜过滤除菌（手术剪，镊子，止血钳，空针，解剖针，不锈钢呢绒晒网，培养皿，小烧杯，吸管，离心管，三角瓶，棉球，血细胞技术板）（2）工作台面取材前30分钟紫外线消毒，酒精棉球擦洗（3）操作者洗手着装（新洁尔灭浸泡前臂1min）（4）试验动物消毒（70％或75％乙醇浸泡）（5）切取动物组织，洗取血污，剔去多余部分，将所取组织放入不含Ca2＋的HEPES缓冲液（培养液）的培养皿中（6）将所取组织切碎，将组织块连同组织液用吸管吸至离心管中静置片刻待组织块下沉后吸去上清液（7）将组织块转移至一加入含0。
05％胶原酶－2和5mMCacl2的HEPES的小烧杯或小培养瓶中37C恒温床消化15－45min（也可加磁力棒）（8）用吸管吸去含酶溶液加入不含Ca2＋的HEPES 缓冲液并用吸管吹打使组织块刚好散开（9）用不锈钢筛网过滤，若未过滤组织块较多重复（7）（10）对过滤液离心，转速80－1000r /min 时间5－10min（50×g？）（11）弃上清液，将细胞沉淀用少量培养液重新悬浮（12）重复（10）（11）3次（13）用血细胞计数板计数密度（14）用培养液调节细胞悬液密度至期望密度（每75ml烧瓶8×106个细胞）准备接种2．培养(1) 培养基：75％Eagle MEM＋25％medium 199＋10nginsulin/m+0.2%bovin serum albumin+10%fetal calf serum(2) 将分离的肝细胞种在10ml培养基里(3) 过12小时换液(4) 以后每天换液且加入7×10-5 hydrocortisone hemisaccinate（去小牛血清加入1.5%的二甲基亚砜）。
大鼠肝细胞原代分离培养方法
大鼠肝细胞原代分离培养方法
（1）麻醉及灌流：将大鼠以7%水合氯醛（0.5ml/100g）麻醉，75%乙醇消毒后移至工作台，0.45mm头皮针连接蠕动泵，打开蠕动泵，调整蠕动泵灌流速度为7ml/min，抽取37℃预热的灌流液I并排空装置内的空气。
打开腹腔，将胃肠结构推向左腹上侧，分离出下腔静脉（肾上段）、肝门静脉，剪开隔膜，动脉夹夹闭下腔静脉肝上段，将头皮针插入下腔静脉（肾上段），动脉夹夹闭固定，打开蠕动泵，灌注37℃预热的灌流液I，确定肝脏均匀膨胀后剪开肝门静脉，继续灌流至肝脏变成土黄色且肝门静脉剪断处流出无色灌流液为止，更换预先预热的37℃灌流液II，直至肝脏表面出现白色裂纹时停止灌流。
剪下肝脏，置于无菌D-Hanks溶液中。
（2）肝细胞的收集：将肝脏在PBS溶液中洗2次，然后放入高糖DMEM培养基中，眼科镊撕开肝包膜，此时肝细胞会分散在培养基中，然后用200目不锈钢细胞筛过滤，将滤液转移至15ml无菌离心管。
（3）肝细胞纯化：将收集的滤液以800rpm离心5min，弃去上清，用高糖DMEM完全培养基重悬细胞，用200目不锈钢细胞筛再次过滤，离心收集细胞沉淀。
用高糖DMEM肝细胞生长培养液重悬细胞。
（4）肝细胞计数及活力检测：取0.1ml肝细胞悬液与0.1ml PBS、0.1 ml40g/l的台盼蓝储备液混合后，用血细胞计数板计数收获的肝细胞总量及存活率。
（5）将肝细胞悬液调整细胞5x105/ml接种于铺有鼠尾胶原的培养瓶中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。
24h后换液，用高糖DMEM肝细胞生长培养液继续培养。
后续隔天换液培养。
小鼠肝细胞原代培养
1. 处死及消毒：脱颈处死小鼠, 浸入75% 酒精中1min, 沥干。 2. 取材：剪开腹部皮肤,撕开皮肤,暴露腹 膜,打开腹腔,取出肝脏。 3. 解剖：修剪除去肝门区血管结缔组织,剪 取一块蚕豆大小的肝组织。 4. 剪切：把肝组织剪成1 ～ 2mm３小块, 用无血清培养液淋洗2～3次。
5. 消化：将肝组织块移入小瓶中, 加8ml混合消 化液, 37℃、40min, 每隔5～10min顺时针摇 匀。 6. 过滤：消化液过100目筛网, 收集滤液, 移入 离心管。 7.离心：离心800rpm, 5min, 吸弃上清液。 8. 洗涤：用无血清培养液离心洗涤１次。 9. 重悬浮及计数：用RPIM1640培养液(含10%胎 牛血清)重悬浮肝细胞, （取样计数）。 10.接种及培养：将细胞接种于培养瓶中, 密度 为106/ml (2×105/cm2), 37℃、5%CO2培养。
注意事项
根据组织类型选择适当的消化液。 控制消化时间，尽量减少细胞损伤。 尽快促进细胞贴壁，必要使用生长基质 涂抹瓶壁，或先少量细胞悬液接种，培 养3～5 h后，补足培养液。 适当提高细胞接种密度。
肝脏细胞培养方案实验操作版本
肝脏细胞的分离及培养一、试验器械及用品1. 肝细胞分离器械及用品1.1 分离器械及用品1）20 mL注射器3个2）输液管2条3）普通剪刀（大）1把4）手术剪刀1把5）眼科剪刀2把6）手术结扎线1圈（不小80 cm长）7）止血钳2把8）动脉夹1个9）纱布（擦血）2条（长宽不限，每条至少可擦2次）10）纸巾（擦血）10条（卷纸，每条用三截折叠，共可擦10次）11）托盘两个12）1 mL枪及枪头1把和1盒13）大镊子1把14）温水（37°C左右）1~2 L（在实验当天开始前准备好）15）玻璃分针两支1.2 试剂：（准备量可适当加大）1）灌流液A 250 mL 1瓶2）灌流液B 250 mL 1瓶，100 mL 2瓶3）CaCl2溶液（60 g/L） 5 mL4）IV型胶原酶（20 g/L） 5 mL5）麻醉剂（犬眠宝，动物医院）2支6）肝素钠（1750 IU/mL）2支1.3 相关试剂配制（剂量可根据试验需要准备）1）无Ca2+、Mg2+ PBS溶液：称8 g NaCl、0.20g KCl、1.83 g Na2HPO4•12H2O、0.2g KH2PO4、2 g葡萄糖，溶于三蒸水中，调pH值至7.2，定容至1000mL，0.22 µm微孔滤膜过滤除菌，分装后4°C保存。
（约2L）2）灌流缓冲液A：无Ca2+、Mg2+ PBS溶液加入终浓度为5 mM的EDTA，0.22 µm微孔滤膜过滤除菌，分装后4°C保存。
(约1L)3）灌流缓冲液B：不含EDTA的无Ca2+、Mg2+ PBS溶液，分装，4°C保存。
灌流缓冲液B1：在无Ca2+、Mg2+PBS溶液中缓慢滴加无菌的60g/LCaCl2溶液，使含有0.6g/L CaCl2和0.4g/L胶原酶，分装后4°C保存。
（或者现配现用）约需300ml。
4）灌流缓冲液C：在无Ca2+、Mg2+PBS溶液中缓慢滴加无菌的60g/L CaCl2溶液，然后加入20g/L IV胶原酶，使含有0.6g/L CaCl2和0.4g/L胶原酶，分装后4°C保存。
小鼠肝脏细胞原代培养
1瓶
RPMI1640培养液 1瓶
废片缸
1
（四）实验步骤
1.75%酒精棉球擦拭超净台，将试验所 需试剂、耗材等置于超净台中紫外照 射30min后，关闭紫外灯打开照明，通 风15min。
2.取一只小鼠置于含乙醚的废片缸中使 其麻醉，脱臼处死，75%酒精中浸泡并 移置于超净工作台内，将小鼠放在无 菌平皿中，用手术剪和镊子撕开腹部 皮肤，再换一套手术剪和镊子剪开腹 膜暴露内脏。
3.取另一无菌平皿，倒入少许PBS置于 一旁备用 4.用镊子取出肝脏置于含有PBS的无菌 平皿内,清洗2次，除去杂物后，用手术 剪将肝脏剪成1mm³小块。
组织块法：
用镊子夹取组织块并将其转移到克氏 瓶底部，组织块之间有一定间隔（5mm 左右），等组织块粘在克氏瓶上不滑动， 将培养瓶翻转180度组织块朝上，加入 2ml含10%胎牛血清DMEM培养液，盖上 瓶盖，做好标记，37℃ 5% CO2培养箱中 静置培养4小时后待组织块完全粘在克氏 瓶上轻轻翻转克氏瓶，使组织块浸入培 养液中，隔天换一次液，观察细胞是否 贴壁。
3.吸取上层清液加入到1.5mlEP管中， 配平，800rpm，10min，离心。离心 后弃上清，沉淀用1mlPBS重悬，吹打 混匀，1000rpm离心10min，弃上清， 加入RPMI1640(10%胎牛血清)1ml重悬， 吸取20μl加入到含等体积0.4%台盼蓝 的1.5mlEP管中，混匀吸取20μl血球计 数板计数。
1.组织块法: 2.消化法:细胞数:
将细胞浓度调整到2*106个/ml， 细胞稀释 倍
细胞生长状态: 培养基颜色: 更换培养基次数:
（六）注意事项
1.工作台面上在实验前要用酒精棉擦， 用品要布局合理。 2.用过的培养瓶、离心管等需及时清洗。 3.实验结束后及时清洗用过的玻璃器材、 收拾台面、倒垃圾。
小鼠原代肝细胞培养
一种改良的小鼠原代肝细胞培养方法1材料与方法1.1动物2～4周龄BALB/C小鼠，雌雄不限（湖北省防疫站动物房提供）。
1.2试剂D-hank's液；消化液Ⅰ：含1 g/L胰蛋白酶、10 g/L聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrolidone, PVP)及0.3 g/L EDTA(武汉中健公司提供)；消化液Ⅱ：含2 g/L胶原酶Ⅳ（上海华美生物工程公司提供）及10 g/L PVP；基础培养液为DMEM，另含青霉素100u/ml、链霉素100 μg/ml、50 mmol/L HEPES、30 g/L谷氨酰胺（武汉中健公司提供）；小牛血清（BS，GIBCO公司提供）；培养基内其他因子：胰岛素5 μg/ml 、转铁蛋白5 μg/ml (上海华美生物工程公司产品)、促甲状腺素释放因子10－6 mol/L（Sigma公司产品）、促肝细胞生长因子20 μg/ml、氢化可的松10－6 mol/L（广东阳江制药厂产品）。
1.3鼠肝组织块培养1）断头处死动物，置于75%酒精浸泡2-3分钟，无菌分离肝组织后均在冰浴下操作。
2）肝组织用4℃D-hank's液（PBS）或不含BS的培养液洗净血污，剥除包膜及纤维成分；3）将肝组织切为约1mm3小块，再用上述液体尽量洗去残留血污，最后一次清洗后800r/min离心4 min，弃上清，4）加入消化液Ⅰ（5-6倍体积），37℃孵育12 min，再用培养液洗3次以清除胰酶。
5）将消化好的肝组织块贴于25cm2培养瓶中，加少许含100 ml/L BS培养液置37℃、5% CO2条件下2～3h后再补充6 ml含100 m l/L BS培养液。
待细胞长出生长晕后改为50 ml/L BS培养液。
1.4鼠肝细胞单层培养动物和肝组织处理同上，加入消化液Ⅱ，置4℃过夜消化，去除消化液加含100 ml/L BS培养液，用滴管轻轻吹打成细胞悬液，经200目尼龙筛网过滤后用培养液洗2次，4 ℃50 g离心4 min，收集肝细胞，台盼蓝活细胞计数>80%,按5×105/ml密度接种，于37℃、5% CO2条件下培养，待细胞贴壁生长后改为50ml/L BS培养液。
原代肝细胞
原代肝细胞分离培养与方法肝细胞的分离和培养是体外组合性生物人工肝研究的基础，但单纯机械分离法对肝细胞损伤较大，分离后的肝细胞体外培养的难度亦较大，方法复杂，成本较高体外培养肝细胞的关键是如何分离得到形态完整、体外代谢活性高的肝细胞.1 非酶分离细胞法1．1 直接分离法：麻醉或处死动物后，取出肝脏，剪成小块，通过机械方法(挤压、剪碎、震荡、吹打)得到单个细胞，多与 EDTA螯合法、灌注法相结合，即先用 EDTA溶液进行充分的灌流，再剪成组织小块，然后用各种机械的方法分离得到肝细胞。
该方法操作简单、流程短，不需要复杂仪器和昂贵的胶原酶。
但实验操作对细胞的损伤大，尤其是造成细胞表面蛋白不可逆的机械性损伤，导致细胞的获得率和存活率较低。
1．2 组织块培养法：用麻醉剂 (乙醚、戊巴比妥纳等 )将动物麻醉或直接断头处死，取出肝脏，用缓冲液充分洗涤后，剥离肝被膜，将其剪成 1 mm。
的组织小块，充分洗涤后，以 0．5 cm的间隔接种于培养器皿中(25 m L的培养瓶中可接种 3O块 )，先加入少量的培养基，静置培养 12～ 24 h后再加入足量的培养基。
该操作过程短，污染少，损伤小，细胞成活率很高而成本低。
但纯度不高，且形成典型上皮细胞层所需时间较长，在细胞爬出后还需剔除组织块，易造成二次污染。
可能是因为成年动物的结缔组织比新生动物的结缔组织致密，肝细胞难以迁出，故此法多用于 1～ 6 d的新生动物或动物胚胎。
2．离体肝脏酶消化分离法2．1 胰蛋白酶、胶原酶消化法：麻醉或处死动物后，取出肝脏，用缓冲液充分洗涤后，剥离肝被膜，将其剪成 1 mm。
的组织小块，充分洗涤后，在 37℃下用胰酶或 (和)胶原酶消化，待消化物成蓬松的絮状物后加入培养基终止消化，吹打均匀后经 200目不锈钢网筛过滤后，离心、重悬即可获得肝细胞。
胶原酶只消化细胞间质而对肝细胞机械性损伤较小，也能较完整地保存膜蛋白¨7]，分离效果好。
牛肝细胞原代培养
牛肝细胞原代培养1材料1.1牛肝脏来源用于获得原代细胞的牛肝脏来自南京市郊某小牛血清制备厂，小牛年龄1–2d。
1.2 主要试剂II型胶原酶( collagenase II)和DMEM/F12培养基为Invitrogen公司产品，小牛血清为明海生物工程有限公司产品，HEPES sodium salt、两性霉素B、L-谷氨酰胺、EGTA、牛血清白蛋白(BSA)为Amresco公司产品，转铁蛋白、牛胰岛素、台盼蓝为Sigma公司产品，地塞米松为Promega公司产品，6孔细胞培养板为costar公司产品。
1.3 采肝脏、灌注消化及分离肝细胞所用的器械大号手术剪刀3把，小手术剪刀2把，止血钳4把，长镊子4把，手术刀柄2个，刀片2片，小镊子4个，乳胶手套4付，100 mL玻璃注射器2个，导液管3条，铝饭盒3个，500 mL、100 mL烧杯各2个，瓶皿2个，200目不锈钢网筛1个，50 mL塑料离心管2个，细胞计数板3个。
1.4 主要仪器普通光学显微镜，细胞培养箱，倒置显微镜，超净工作台，冰箱，电热恒温水浴锅，低速离心机，电子天平。
2 方法2.1 实验方案新生小牛采血结束→无菌采取一部分肝后叶→4 ℃冲洗液冲洗掉血液并保存于4 ℃运送回实验室→37 ℃冲洗液冲洗让肝脏升温→37 ℃水浴锅里灌注消化肝脏→撕开肝被膜分散肝细胞→过滤沉淀离心→获得纯化的肝细胞→细胞计数和计算即时存活率→稀释细胞接种于牛尾胶原包被的细胞板→置37 ℃、5% CO2加湿环境中培养→观察记录细胞生长情况。
2.2 工作溶液的配制2.2.1 冲洗液A分别称取8.588 g HEPES sodium salt、7.468 g NaCl、0.234 g KCl、0.228 g EGTA、0.250 g Na2HPO4·12H2O，用1.0 mol/L HCl 调pH至7.6，用去离子水定容至1000 mL，0.22 μm 微孔滤膜过滤除菌，4 ℃贮存。
肝细胞原代培养实验方案
原代培养肝细胞是肝细胞移植、生物人工肝的最佳生物材料。
长期以来, 国内外众多学者对肝细胞分离方法、培养条件进行了大量的研究 , 但要获得高活率、功能好的肝细胞,至今仍非易事。
早期主要用非酶法分离肝细胞 ,包括机械法( 如匀浆法) 及螯合法。
机械法对肝细胞损伤大, 细胞活率低; 螯合法是用可结合 Ca2+ 、M g2 +的螯合剂(如枸橼酸盐或 EDTA) 分离肝细胞,但螯合剂单独使用效果不好 ,常需与酶法结合使用。
后期逐渐改为酶消化法分离肝细胞 ,包括胶原酶消化法、胰蛋白酶消化法。
后者对酶浓度及作用时间要求十分严格, 且由于胰蛋白酶是一种强蛋白质消化酶, 对肝细胞膜破坏严重 , 因而易造成肝细胞死亡 , 导致分离失败。
胶原酶消化法对肝细胞损伤较小 , 虽然肝细胞膜在消化过程中也会受到损害, 但经培养后可完全修复。
胶原酶在消化肝的同时解除了细胞间接触抑制或活化了潜在的蛋白激酶、生长因子或受体, 使肝细胞能逐渐适应消化分离过程中所发生的细胞内、外环境及细胞间的各种改变。
这些改变对离体肝细胞修复、生长及其功能有重要的促进作用 ,有利于肝细胞的培养。
这种适应性改变恰恰是机械分离法所没有的。
因此 ,要获取理想的肝细胞,酶消化这一重要环节不可缺少。
Seglen 二步灌注法为经典的胶原酶消化法,但所需设备较复杂 ,胶原酶消耗量大。
本研究在其基础上略加改进。
作者认为 ,采用胶原酶消化法 ,胶原酶的用量、作用时间及作用条件是分离成功与否的关键。
胶原酶的浓度过高 ,作用时间难以控制 ; 浓度过低 ,则作用时间过长、细胞活率降低。
事先用无Ca2 +、M g2+的灌注液进行预灌注, 去除 Ca2+依赖性粘附因子 ,使桥粒断裂; 然后用含 Ca2+的胶原酶消化 ,胶原酶的作用需要 Ca2+的活化 , 在 5 mmol/LCa2 +浓度下 ,用浓度为 500 mg/ L 的胶原酶 37 ℃条件下消化 15 min 最佳。
在进行肝细胞洗涤、离心、重悬等纯化操作时 ,温度需保持在 0 ～4 ℃。
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原代培养肝细胞是肝细胞移植、生物人工肝的最佳生物材料。
长期以来, 国内外众多学者对肝细胞分离方法、培养条件进行了大量的研究 , 但要获得高活率、功能好的肝细胞,至今仍非易事。
早期主要用非酶法分离肝细胞 ,包括机械法( 如匀浆法) 及螯合法。
机械法对肝细胞损伤大, 细胞活率低; 螯合法是用可结合 Ca2+ 、M g2 +的螯合剂(如枸橼酸盐或 EDTA) 分离肝细胞,但螯合剂单独使用效果不好 ,常需与酶法结合使用。
后期逐渐改为酶消化法分离肝细胞 ,包括胶原酶消化法、胰蛋白酶消化法。
后者对酶浓度及作用时间要求十分严格, 且由于胰蛋白酶是一种强蛋白质消化酶, 对肝细胞膜破坏严重 , 因而易造成肝细胞死亡 , 导致分离失败。
胶原酶消化法对肝细胞损伤较小 , 虽然肝细胞膜在消化过程中也会受到损害, 但经培养后可完全修复。
胶原酶在消化肝的同时解除了细胞间接触抑制或活化了潜在的蛋白激酶、生长因子或受体, 使肝细胞能逐渐适应消化分离过程中所发生的细胞内、外环境及细胞间的各种改变。
这些改变对离体肝细胞修复、生长及其功能有重要的促进作用 ,有利于肝细胞的培养。
这种适应性改变恰恰是机械分离法所没有的。
因此 ,要获取理想的肝细胞,酶消化这一重要环节不可缺少。
Seglen 二步灌注法为经典的胶原酶消化法,但所需设备较复杂 ,胶原酶消耗量大。
本研究在其基础上略加改进。
作者认为 ,采用胶原酶消化法 ,胶原酶的用量、作用时间及作用条件是分离成功与否的关键。
胶原酶的浓度过高 ,作用时间难以控制 ; 浓度过低 ,则作用时间过长、细胞活率降低。
事先用无Ca2 +、M g2+的灌注液进行预灌
注, 去除 Ca2+依赖性粘附因子 ,使桥粒断裂; 然后用含 Ca2+的胶原酶消化 ,胶原酶的作用需要 Ca2+的活化 , 在 5 mmol/LCa2 +浓度下 ,用浓度为 500 mg/ L 的胶原酶 37 ℃条件下消化 15 min 最佳。
在进行肝细胞洗涤、离心、重悬等纯化操作时 ,温度需保持在 0 ～4 ℃。
肝细胞分离时, pH 值宜维持在 7 . 4 左右, 不低于 7 . 2 ,最高不超过 7 . 6 , 否则将对肝细胞造成很大损伤。
在肝灌注液中加入适量的小牛血清或者牛血清白蛋白,可以维持细胞代谢和液体渗透压, 提高肝细胞成活率。
此外,门静脉插管应迅速置入,灌注速度必须保持一致。
培养板预处理及培养液选择采用铺过胶原的新培养板与没有铺过胶原的新培养板 ,铺过胶原的老培养板培养肝细胞比较 , 发现肝细胞在铺过胶原的新培养板中长势更好。
新的培养板使用 Sigm a公司提供的胶原铺胶 ,置于 37℃恒温箱中过夜后使用。
过去选择含 8%胎牛血清的 W E作培养基 ,效果不错 , 但 WE价格昂贵 ,我们试着采用含 10%胎牛血清的 RPM 1640培养基 , 并在其中加入胰岛素 , 地塞米松等生长因子 , 肝细胞生长好。
肝细胞的接种密度对其以后的生长状况有很大的影响 : 密度太小 ,细胞不易生长 ; 密度太大 , 肝细胞增殖受到抑制 , 培养板中缺少足够的空间供细胞伸展。
当细胞密度为 5×105 / m l左右时 ,试剂及仪器主要试剂 : 胰岛素、高血糖素、转铁蛋白、表皮生长因子、地塞米松、Ⅳ型胶原酶、锥虫蓝等购自美国 Sig ma 公司。
鼠尾胶为自行配制。
Williams E 培养液、胎牛血清购自美国 Gibco 公司。
BT01-100
蠕动泵( 保定格兰蠕动泵有限公司)、Sorvall 低温离心机( 美国Kendro 公司), CL-800 全自动生化分化仪( 日本岛津), XD-101 倒置显微镜( 南京
光学显微镜公司)。
Heraeus CO 2孵箱( 美国 Kendro公司), KT-902 洁净室( 无锡康达净化空调设备厂)。
实验步骤：
一、原代大鼠肝细胞的分离
1.实验动物 Spragure- Dawley （ SD ）大鼠购自泸州医学院实验动物中心。
雄性，清洁级，体重 150～200g，8～12 周龄。
分笼饲养，喂饲标准的大鼠饲料，随意饮水，保持室温 20 ℃～25 ℃。
2.主要仪器设备: 倒置相差显微镜（）；自动平衡微型离心机：LDZ4- 0.8 北京医用离心机厂；套管针（）；超净工作台（）；电子分析天平（）；外科手术器械（）
3.主要试剂及药品：Ⅳ型胶原酶（）；RPMI1640培养基（）；胎牛血清（）；台盼蓝（）；Percoll分离液（）；PBS缓冲液（）；青霉素（80万U）及链霉素（100万U）（）胰岛素、高血糖素、转
铁蛋白、表皮生长因子、地塞米松
4.具体实验步骤： SD 大鼠，氯胺酮80 mg/kg 腹腔内麻醉．同时腹腔内注射 1 000 U 肝素钠注射液抗凝．固定大鼠仰卧位于超净工作台上（用前紫外灯照射超净台半小时），剪去胸腹部体毛，碘伏胸腹部皮肤消毒后，带无菌手套，铺洞巾，取腹部正中切口，可见鲜红的肝脏，暴露出门静脉和肝下下腔静脉，用弯头钳子钝性分离门静脉和
下腔静脉，并在各静脉下放置
1 根 4 零细线，暂不结扎，用套管针以约15°角在门静脉远端向近端平行刺入（注意针头刺入在距离门静脉 3 个分支处 0.5 cm，刺入过深势必影响灌注效果）．细线结扎后以封闭门静脉远端，再退出金属针心，并将套管针连接一次输液器一端，另一端接上输液瓶（预热灌流液的输液瓶用保温套保持温度以避免温度下降过快以影响酶的消化活性）．输液瓶高度距离灌流大鼠肝脏 120 cm．打开输液器输钮将预热至 37 ℃无钙灌流液 200mL 经一次性输液管道及连接其末端的套管针流入门静脉，控制流速约 20 mL/min；另一套管针头立即插入肝下下腔静脉，细线结扎固定以防针头由下腔静脉内脱出并退出金属针心，让血液和灌流液从下腔静脉流出，用无菌平皿接流出液，保持流出端无菌，同时打开胸腔结扎肝上下腔静脉，数分钟后肝脏逐渐肿胀变淡黄色．直到下腔静脉流出液颜色接近无钙灌流液．约 5～10 min，改输预热至 37 ℃的 0.05%Ⅳ型胶原酶灌流液 100 mL继续灌流，更换流出端的平皿，以回收胶原酶以循环使用，控制约 10 mL/min．灌流持续约 5～10min， 0.05%Ⅳ型胶原酶灌流过程中，取一根无菌湿棉签轻轻压迫肝脏表面，以判断肝脏消化的程度，待压迫肝脏后不再回缩．表面出现渗出、肝包膜下组织呈龟背状裂隙时判断肝脏已被消化充分，可以终止灌流。
离断肝脏血管、韧带及系膜，将肝脏完整取下（注意不要碰破胃肠组织，避免造成污染），置于无菌平皿。
用眼科镊钝性撕裂肝组织，4 ℃ RPMI 1640 完全培养基终止IV型胶原酶的消化作用，装入无菌 100 mL 三
角烧瓶置摇床上，100 r/min，摇 10 min，所得的肝细胞悬液经三层无菌纱布过滤，以除去一些大的细胞团块及被膜组织，再装入 50 mL 离心管，500 r/min，离心 3 min，弃上清，以4℃RPMI1640完全培养基重悬，反复离心 3 次，以除去血细胞、肝非实质细胞以及一些细胞碎片和少量的结缔组织。
离心之后得到的肝细胞沉淀以含 4 ℃RPMI1640 完全培养基对细胞沉淀进行重悬，用吸管轻轻反复吹打肝细胞悬液使肝细胞重悬均匀后即制备成肝细胞悬液。
二、原代大鼠肝细胞的纯化取无菌的 50 mL离心管置管架上，用弯头吸管沿管壁小心地将肝细胞悬液和 75%Percoll 分离液按 1:1 铺层，底层为 75%Percoll 分离液．肝细胞悬液铺加于上层，尽量减少震荡， 4 ℃， 800 r/min， 10 min离心后，离心管液体分四层，顶层为死细胞，第二层为混合肝细胞，第三层为肝实质细胞，底层为分离液．取第三层肝实质细胞用于重悬制成肝细胞悬液外，另吸取第二层混合肝细胞，加 PBS 液稀释，再次小心依次按 1:1:1 分铺底层50% Percoll、中层 25% Percoll、顶层混合肝细胞悬液，尽量减少震荡， 4 ℃， 800 r/min， 10min 离心，底层沉淀为肝实质细胞，吸除上层液，用完全培养基重悬底层沉淀的肝细胞制成肝细胞悬液．取肝细胞悬液与台盼蓝溶液混匀后 1 min 内滴入血细胞计数板上计数。
三、肝细胞原代培养详细步骤
RPMI1640完全培养基( 100 mL·L － 1胎牛血清RPMI1640培养基培养基
、青霉素105 U·L － 1、链霉素100 mg·L － 1和胰岛素160 U·L －1 ) 调整肝细胞悬液细胞密度，按每孔1 × 106 个细胞接种于铺有肝细胞悬液的6 孔培养板中，在37 ℃、50 mL·L － 1 CO2常规培养条件下培养。
4 h 后换液，用RPMI1640完全培养基继续培养，以后每24 h 换液1 次，在倒置显微镜下动态观察细胞的形态6 孔培养板中，在37 ℃、50 mL·L － 1 CO2常规培养条件下培养。
4 h 后换液，用RPMI1640完全培养基继续培养，以后每24 h 换液1 次，在倒置显微镜下动态观察细胞的形态变化。
（注：文档可能无法思考全面，请浏览后下载，供参考。
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