WB实验常见问题与解决方案
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应用：广泛用于检测蛋白水平的表达
一、WB基本原理的理解
Western Blot（WB）原理：
通过电泳区分不同组分，并转移至固相支持物，通过 特异性试剂（抗体）作为探针，对靶物质进行检测，蛋白 质的WESTERN 印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固 相免疫测定的特异敏感等多种特点，可检测到低至1~5ng （最低可到10~100pg）中等大小的靶蛋白。
含SDS 不含SDS
二、样本的制备和抗体的选择 —— 抗体的选择
一抗的种属来源： 一般市面上主要的一抗来源是鼠和兔，一抗的选择 应与你现有的二抗相匹配，例如：
如果你的一抗是小鼠源的单克隆抗体，二抗则选 ，
抗小鼠的二抗（山羊抗小鼠或者兔抗小鼠等均可）； 如果一抗是从兔血清里制备的兔源多克隆抗体或者兔 单抗，则相应的二抗需要选择抗兔的二抗。
很好
细胞核转录因子提取 很好
含蛋白酶抑制剂
是
含磷酸酯酶抑制剂
是
主要用途
WB, IP,co-IP
很好 是 是 WB, IP
很好 是 是 WB, IP
很好 是 是 WB, IP, co-IP
很好
很好
是
是
是
是
WB, IP,coIP
WB, ChIP
二、样本的制备和抗体的选择 ——样本制备
样本中蛋白酶抑制剂的使用
WB
一、WB基本原理的理解
基 本 原 理 示 意 图
红色箭头：目标抗原 绿色箭头：靶抗体 黄色箭头：标记二抗
WB
一、WB基本原理的理解
基 本 过 程 示 意 图
二、样本的制备和抗体的选择 ——样本制备
WB样本来源：大部分细胞或组织裂解物
蛋白位置 全细胞
胞浆（可溶性蛋白）
推荐样本裂解buffer NP-40 or RIPA
二、样本的制备和抗体的选择 —— 抗体的选择
一抗属于哪个类或亚类：
针对单克隆抗体，除了要与一抗的种属来源相一致，二抗还需 与一抗的类别或亚类相匹配。
单克隆抗体的类别及亚类通常会在产品说明书中都会有描述， 如果您的一抗是小鼠IgM，那么相应的二抗就应当是抗小鼠IgM抗体。如果 单克隆一抗是小鼠 IgG的某一亚类（IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3），那么 几乎所有的抗小鼠IgG都可以与之结合，或者您也可选择专门针对这一亚类 的二抗，例如，如果您的一抗是小鼠IgG1，那么您可以选择抗IgG1的二抗 ，此种抗体在双标记实验中尤其适合。
含β-巯基乙醇或DTT， 含SDS
含SDS
Reduced -Native
还原，不变性
含β-巯基乙醇或DTT， 不含SDS
不含SDS
Oxidized - Denatured Oxidized - Native
不还原，变性
不还原，不变 性
不含β-巯基乙醇或DTT， 含SDS
不含β-巯基乙醇或DTT， 不含SDS
抑制剂名称
作用
P属蛋白水解酶
Cocktail(蛋白酶抑 根据混合物的成为不同，抑制各种蛋白酶的作用 制剂混合物) （一般包括PMSF ，EDTA ，胃蛋白酶抑制剂 ， 亮抑蛋白肽酶 等蛋白酶抑制剂混合物）
Na3VO4
激活的矾酸钠具有抑制去磷酸化的作用
（原矾酸钠）
NaF （氟化钠）
Western及IP细胞 裂解液
RIPA裂解液(强)
RIPA裂解液(中)
RIPA裂解液(弱)
NP-40裂解 液
SDS裂解液
有效裂解成分
1% Triton X-100
1% Triton X-100, 1% deoxycholate, 0.1% SDS
1% NP-40, 0.5% deoxycholate
生物化学中，氟化物常被用作抑制丝丝氨酸/苏氨 酸磷酸酶
…
…
二、样本的制备和抗体的选择 ——样本制备
样本浓度的测定
方法
凯氏定氮法
测定范围
还原，变性
蛋白种类之间 差异性
特点
标注方法，准确，操作麻
小
烦，费时，灵敏度低，适
用于标准的测定
紫外分光光度法 100~1000
大
灵敏，快速，不消耗样品， 核酸类物质有影响
二、样本的制备和抗体的选择 —— 抗体的选择
二抗的种属来源： 不同的种属来源与二抗的质量没有必然的联系！ 主要应用：双标实验里 例如：如果其中一个一抗是山羊来源的，一个是
1% NP-40, 0.25% deoxycholate
1% NP-40
1% SDS
裂解强度 对膜蛋白的提取 对胞浆蛋白的提取 对核蛋白的提取
温和 一般 很好 较好
胞浆磷酸化蛋白提取 很好
强 很好 很好 很好
很好
中 较好 很好 较好
很好
温和 一般 很好 较好
很好
温和 一般 很好 较好
很好
强 很好 很好 很好
Western blot常见问题及对策
报告人： 南京巴傲得质检部负责人 沈健
一、WB基本原理的理解
蛋白质印迹法(免疫印迹试验)即Western Blot 的起源： 蛋白质印迹的发明者 ：一般认为是上个世纪是美国斯坦 福大学的乔治·斯塔克(George Stark)
蛋白质印迹法(免疫印迹试验)即Western Blot ：首次在尼 尔·伯奈特(Neal Burnette)于1981年所著的《分析生物化学 》(Analytical Biochemistry)中首次被称为Western Blot 。
非离子表面活性剂(或称去污剂),能溶解脂质，以增加 抗体对细胞膜的通透性。
TERGITOL(TM)NP-40表面活性剂 , 可以破坏细胞膜， 但是保留核膜。
SDS
阴离子去污剂,表面活性剂,作为变性剂和助溶试剂,
破坏蛋白分子高级结构。
脱氧胆酸钠 生物活性分子，破膜。
产品名称
二、样本的制备和抗体的选择 ——样本制备
考马斯亮蓝法 BCA法 …
50~500 50~500
…
大
灵敏度高，稳定，误差较 大，颜色会转移
大
灵敏度高，稳定，干扰因 素少，费时较长
…
…
二、样本的制备和抗体的选择 ——样本制备
根据待测蛋白状态确定电泳条件：
待测蛋白状态 Reduced - Denatured
凝胶条件 还原，变性
上样buffer
电泳buffer
Tris-HCl
胞浆（骨架结合蛋白） 膜蛋白 核蛋白
Tris-Triton NP-40 or RIPA RIPA or 核蛋白提取试剂盒
线粒体蛋白
RIPA or 线粒体分离试剂盒
二、样本的制备和抗体的选择 ——样本制备
Triton-X100，NP-40，SDS和脱氧胆酸钠
试剂名称
作用推荐
Triton-X100 NP-40
一、WB基本原理的理解
Western Blot（WB）原理：
通过电泳区分不同组分，并转移至固相支持物，通过 特异性试剂（抗体）作为探针，对靶物质进行检测，蛋白 质的WESTERN 印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固 相免疫测定的特异敏感等多种特点，可检测到低至1~5ng （最低可到10~100pg）中等大小的靶蛋白。
含SDS 不含SDS
二、样本的制备和抗体的选择 —— 抗体的选择
一抗的种属来源： 一般市面上主要的一抗来源是鼠和兔，一抗的选择 应与你现有的二抗相匹配，例如：
如果你的一抗是小鼠源的单克隆抗体，二抗则选 ，
抗小鼠的二抗（山羊抗小鼠或者兔抗小鼠等均可）； 如果一抗是从兔血清里制备的兔源多克隆抗体或者兔 单抗，则相应的二抗需要选择抗兔的二抗。
很好
细胞核转录因子提取 很好
含蛋白酶抑制剂
是
含磷酸酯酶抑制剂
是
主要用途
WB, IP,co-IP
很好 是 是 WB, IP
很好 是 是 WB, IP
很好 是 是 WB, IP, co-IP
很好
很好
是
是
是
是
WB, IP,coIP
WB, ChIP
二、样本的制备和抗体的选择 ——样本制备
样本中蛋白酶抑制剂的使用
WB
一、WB基本原理的理解
基 本 原 理 示 意 图
红色箭头：目标抗原 绿色箭头：靶抗体 黄色箭头：标记二抗
WB
一、WB基本原理的理解
基 本 过 程 示 意 图
二、样本的制备和抗体的选择 ——样本制备
WB样本来源：大部分细胞或组织裂解物
蛋白位置 全细胞
胞浆（可溶性蛋白）
推荐样本裂解buffer NP-40 or RIPA
二、样本的制备和抗体的选择 —— 抗体的选择
一抗属于哪个类或亚类：
针对单克隆抗体，除了要与一抗的种属来源相一致，二抗还需 与一抗的类别或亚类相匹配。
单克隆抗体的类别及亚类通常会在产品说明书中都会有描述， 如果您的一抗是小鼠IgM，那么相应的二抗就应当是抗小鼠IgM抗体。如果 单克隆一抗是小鼠 IgG的某一亚类（IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3），那么 几乎所有的抗小鼠IgG都可以与之结合，或者您也可选择专门针对这一亚类 的二抗，例如，如果您的一抗是小鼠IgG1，那么您可以选择抗IgG1的二抗 ，此种抗体在双标记实验中尤其适合。
含β-巯基乙醇或DTT， 含SDS
含SDS
Reduced -Native
还原，不变性
含β-巯基乙醇或DTT， 不含SDS
不含SDS
Oxidized - Denatured Oxidized - Native
不还原，变性
不还原，不变 性
不含β-巯基乙醇或DTT， 含SDS
不含β-巯基乙醇或DTT， 不含SDS
抑制剂名称
作用
P属蛋白水解酶
Cocktail(蛋白酶抑 根据混合物的成为不同，抑制各种蛋白酶的作用 制剂混合物) （一般包括PMSF ，EDTA ，胃蛋白酶抑制剂 ， 亮抑蛋白肽酶 等蛋白酶抑制剂混合物）
Na3VO4
激活的矾酸钠具有抑制去磷酸化的作用
（原矾酸钠）
NaF （氟化钠）
Western及IP细胞 裂解液
RIPA裂解液(强)
RIPA裂解液(中)
RIPA裂解液(弱)
NP-40裂解 液
SDS裂解液
有效裂解成分
1% Triton X-100
1% Triton X-100, 1% deoxycholate, 0.1% SDS
1% NP-40, 0.5% deoxycholate
生物化学中，氟化物常被用作抑制丝丝氨酸/苏氨 酸磷酸酶
…
…
二、样本的制备和抗体的选择 ——样本制备
样本浓度的测定
方法
凯氏定氮法
测定范围
还原，变性
蛋白种类之间 差异性
特点
标注方法，准确，操作麻
小
烦，费时，灵敏度低，适
用于标准的测定
紫外分光光度法 100~1000
大
灵敏，快速，不消耗样品， 核酸类物质有影响
二、样本的制备和抗体的选择 —— 抗体的选择
二抗的种属来源： 不同的种属来源与二抗的质量没有必然的联系！ 主要应用：双标实验里 例如：如果其中一个一抗是山羊来源的，一个是
1% NP-40, 0.25% deoxycholate
1% NP-40
1% SDS
裂解强度 对膜蛋白的提取 对胞浆蛋白的提取 对核蛋白的提取
温和 一般 很好 较好
胞浆磷酸化蛋白提取 很好
强 很好 很好 很好
很好
中 较好 很好 较好
很好
温和 一般 很好 较好
很好
温和 一般 很好 较好
很好
强 很好 很好 很好
Western blot常见问题及对策
报告人： 南京巴傲得质检部负责人 沈健
一、WB基本原理的理解
蛋白质印迹法(免疫印迹试验)即Western Blot 的起源： 蛋白质印迹的发明者 ：一般认为是上个世纪是美国斯坦 福大学的乔治·斯塔克(George Stark)
蛋白质印迹法(免疫印迹试验)即Western Blot ：首次在尼 尔·伯奈特(Neal Burnette)于1981年所著的《分析生物化学 》(Analytical Biochemistry)中首次被称为Western Blot 。
非离子表面活性剂(或称去污剂),能溶解脂质，以增加 抗体对细胞膜的通透性。
TERGITOL(TM)NP-40表面活性剂 , 可以破坏细胞膜， 但是保留核膜。
SDS
阴离子去污剂,表面活性剂,作为变性剂和助溶试剂,
破坏蛋白分子高级结构。
脱氧胆酸钠 生物活性分子，破膜。
产品名称
二、样本的制备和抗体的选择 ——样本制备
考马斯亮蓝法 BCA法 …
50~500 50~500
…
大
灵敏度高，稳定，误差较 大，颜色会转移
大
灵敏度高，稳定，干扰因 素少，费时较长
…
…
二、样本的制备和抗体的选择 ——样本制备
根据待测蛋白状态确定电泳条件：
待测蛋白状态 Reduced - Denatured
凝胶条件 还原，变性
上样buffer
电泳buffer
Tris-HCl
胞浆（骨架结合蛋白） 膜蛋白 核蛋白
Tris-Triton NP-40 or RIPA RIPA or 核蛋白提取试剂盒
线粒体蛋白
RIPA or 线粒体分离试剂盒
二、样本的制备和抗体的选择 ——样本制备
Triton-X100，NP-40，SDS和脱氧胆酸钠
试剂名称
作用推荐
Triton-X100 NP-40