拼接和修复操作流程

拼接和修复操作流程

一：拼接

1、引物登记：

新引物到时，认真核对引物条数，按照基因名详细记录在引物登记本上。

2、溶引物：

将引物按顺序隔排排放到96孔平板上，（注意将GR基因两条重复的首尾引物各取出一条）向每管引物中加入300ul1*TE，并在每管管盖上标记出基因名称和引物序列号，注意不要错标。测序引物单独拿出来，交由测序人员保存，用时再溶解。

3、振引物：

将每板引物用涡旋震荡器震荡均匀，每板引物震荡时间不少于2分钟。

4、写拼接方案：

根据每条基因的引物条数对其进行分段，每段引物在12-18条之间，标示出各段的基因长度，并依据基因的平均Tm值以及GC%选择一个合适的退火温度。一般退火温度稍高于平均Tm值，并根据GC%进行调整。若GC%大于60%时，要适量加入DMSO，最后写好基因的重叠延伸方案。

5、混引物：

按照拼接方案的分段方法，对各段引物进行混合，每条引物取5ul混合于1.5ml离心管中，充分震荡，混合均匀。

6、准备反应：

找到各段的首尾引物，按顺序与混合引物排列好，准备好一管灭菌水和总管。总管配置方法如下：

5*pfu Buffer 10ul * 40 400ul

pfu DNA 聚合酶0.6ul 24ul

dNTP 1ul 40ul

H2O 13.4ul 540ul 注意配置总管是要确保每个成分的质量，每次新领取的成分用之前要检测。

7、预扩增反应：

反应体系如下：反应程序下：

混合引物3ul 1、94℃2min

2、94℃20s

3、退火温度+4℃20s

总管25ul 4、72℃14s

H2O 22ul 5、94℃20s

6、退火温度20s

7、72℃14s -

8、94℃20s

9、55/60/65 20s

10、72℃14s

11、72℃2min

注意：配好反应体系后要离心，确保PCR管中没有气泡。如有气泡会影响Pfu 酶的活性。其中2-4号程序是个降落PCR（Touch down PCR）每个循环退火温度下降1度，运行4循环，5-7号程序,运行8个循环，8-10号程序，运行8个循环。

其中延伸温度根据片段大小决定，pfu的聚合速度为1kb/30s

8、二次扩增反应：

反应体系如下：反应程序如下：预扩产物1ul 1、94℃2min

首引物2ul 2、94℃20s

尾引物2ul 3、55/60/65 20s

总管25ul 4、72℃视片段大小设定

H2O 20ul 5、72℃2min

2-4号程序，运行18个循环

9、二扩产物检测：

取2ul二扩产物进行电泳检测，若二扩产物有很好的纯度和浓度，可直接用其做模板进行下一步的重叠延伸。若二扩产物纯度不够，则需要对其进行胶回收，回收完后做模板。若二扩产物浓度不够但很单一则需检测其首位引物的浓度。若二扩产物浓度及纯度都不好则考虑更改拼接方案。对拼接好的片段作好标记，对不理想的片段作好记录。

10、第一轮重叠延伸：

反应体系如下：反应程序如下：预扩产物1/2 各1ul 1、94℃2min

首引物2ul 2、94℃20s

尾引物2ul 3、55/60/65 20s

总管25ul 4、72℃视片段大小设定-

H2O 19ul 5、72℃2min

2-4号程序，运行18个循环

11、对重叠延伸产物跑回收胶，对其电泳情况进行记录，对好的片段进行胶回收。

12、以回收好的第一轮重叠延伸产物为模板，做下一轮重叠延伸，直至得到全长。

二：基因修复

1.基因修复的过程：

（1）一般早上9：30－10：30之间，办公室下修复方案。修复方案下后，首先用修复方案本（不用修复本，因为在将方案誊写至修复本上时有一定出错率，直接用修复方案本可以保证不拿错质粒等）找到所需的原始质粒和所需基因的引物板。放于自己实验桌上。然后将方案誊写于修复本上（注意写好片段大小）。

（2）将原始质粒稀释20倍。首先写好稀释质粒EP管的编号（标明1：20）（原始质粒一般用mark笔的粗头写，所以我们稀释质粒最好用mark笔的细头写，以便区分）。然后分别吸取原始质粒2uL至对应空管中，再加入38uL的无菌水（水要将原始质粒冲至管底）。最后在振荡器上振荡一下。

（3）利用修复本将首尾引物排好顺序,至于板上。然后将稀释质粒相应的排好（同时核对是否出错）。写好PCR管，相应把引物和质粒加于相应PCR管中（稀释质粒、首末端引物各2mL）。加入25uL的总管。最后用无菌水将其配成50uL体系。

（4）上PCR仪：因为各台PCR仪功效不一样，运行时间长短可能悬殊比较大。，所以尽量一批PCR都在一台机器上运行(一些难做的基因除外）。其GC％在40％和60%之间的可以直接用60度退火；GC％在60％左右的片段，可以加入1uLDMSO（DMSO毒性极低，是一种水溶性的化合物，能溶解绝大多数有机化合物，减少DNA的二级结构，降低退火温度）在60度上退火，或直接在65度上退火；GC％在65％或更高一点的片段，可以加入2uL 的DMSO在60度上退火，或加入1uLDMSO在65度上退火；对于GC％达到75％左右的基因可以加入2/3uLDMSO（DMSO最多可加至3uL，再多的量将逐渐抑制反应）在68度或65度上退火，有些基因甚至可以用70度或72度退火；GC%在40％或更低的片段，可以在55度上退火，有些更低GC％的，可以至50度退火。新pfu酶活性为每30S合成1kb片段，据此，设置延伸时间。

程序是

1 94度2min

2 94度20s

3 设定的退火温度值20s

4 72度13s

5 72度3min

2至4号程序跑18个循环

（5）胶回收：在PCR产物下来之前须注意一下是否有回收胶。PCR产物下来后在板上排好顺序，加入一点loading buffer，拿好胶，进行点样。点样时尽量减少损失。在胶跑好前，写好2mL的EP管。胶跑好后，核对片段大小，割胶（胶需割得较薄，以保证没有杂带混入）；加入450uL的溶胶液（即使胶非常厚45mL已经足够，加入过多的溶胶液，在下面的步骤中容易引起污染）放入63度下水浴；写好套管和1.5mLEP管并排序（注意不能写错管子和弄错顺序）；在观察胶已溶好后，将其转至套管中，并其按顺序排在离心机上；3000r/min （相对于5000r/min其更利于DNA的吸附），1分钟；10000r/min，30S（很关键，时间太短可能会导致DNA中残留溶胶液，影响测序反应，时间太长可能导致少量DNA损失）；倒掉溶胶液，加入漂洗液，5000r/min，1min；倒掉，再漂洗一次；倒掉漂洗液后，10000r/min，1min(关键步骤，时间太短会引起酒精残留，影响后续实验）；将套管转至1.5mL的管中，放入烘箱，3－4min；取出，加入30uLTE（加至管底，而不是打在管壁上）。

（6）继续做下一轮PCR，直至得到所需基因全长。

（7）模板、原始质粒、稀释质粒和修复引物的整理：原始质粒用已写上日期的小袋装好，放于冰箱中；稀释质粒和模板按照日期排序于96孔板上，约一个月以前的东西整理倒袋子中。这样只要查一下修复本和修复方案本就可以迅速找到所需东西。一般一个月内的东西十分钟内能找到，一个月以前的东西半小时内能找到。

（8）基因进度整理：修复方案本上的方案在其被誊写到修复本上时，在此方案前打勾，在此方案被完成后，用红笔在其右侧标上连接编号和日期（以保证没有漏做的基因）。每天中午时候观察平板生长情况，如遇不好情况，采取相应措施；对于难做的基因尽量多花时间，尽快做完，从而不影响基因的整体进度。一般的修复方案尽量在当天就完成，最迟第二天，必须完成。

2.修复中可能出现的问题以及注意事项

（1）看胶时出现一系列异常情况：所有片段都没有出，或只有个别片段有很弱的带，说明总管有问题，或个人实验中出错；一条基因的全部片段都没有出，可能是原始质粒拿错，或退火温度不对；一条基因的部分片段没出，说明此基因的部分引物不好、原始质粒（一般原始质粒都好用）不好，或该基因的此片段处于GC高峰或低谷处，也有可能东西拿错；杂带呈现几条比较清晰的带，可能是模板加入量太多或两模板加入的量悬殊太大；杂带呈现为，主带上面弥散呈一片，说明该基因重复序列严重。

（2）对于难扩的基因：基因中存在GC%高峰或低谷的片段，可以单独拿出来用更高或更低的温度退火（强行做的话，可能会出现缺段现象）；GC%含量很高，可以用68度、70度甚至72度退火，同时加入适量的DMSO；GC%含量很低的基因可以在55度或50度上退火：对于一些易出杂带并且较弱的基因可以多跑上一些循环（较常用)，或者做2管回收时并在一起（一般情况下不用此方法,因为弱带很可能并不是比较纯的目的片段）；对于重复序列严重的基因，首先要大量稀释模板，有些可以稀释至500至1000倍（能减少杂带出现几率），其次需要提高退火温度（减少非特异性扩增），并且严格限制延伸时间（延伸时间需正好卡在目的片段延伸所需时间的点上)。

三：连接扩增，

当一个基因的GC含量位于40%-60%之间时，我们可以通过拼接直接将基因的片段分小段直接拼出全长，如果该基因GC含量过高或过低，或有比较严重的重复序列时，我们就要考虑用连扩将这条基因分小段拼出，一旦小段出来，就能重叠延伸得出该基因的全长。

我们在做连接扩增前先提一下Taq DNA连接酶的功能，

Taq DNA连接酶能够催化磷酸二酯键的形成，使杂交到同一互补靶DNA链上的两条契合寡核苷酸链的5“磷酸末端和3“羟基末端通过形成磷酸二酯键连接。这个连接反应只有当两条寡核苷酸链和互补靶DNA链完全配对并且两者之间没有空隙的条件下才可发生。这正好符合我们基因的设计引物的原则，在45度到65度的范围内，Taq DNA连接酶均有活性。

连接扩增的步骤可以分为以下三步

1.磷酸化过程

一般定20 ul的反应体系。

将分好小段的基因的引物按奇偶分开磷酸化，如1，3，5，7，9，11，13号引物各取2ul 放入200 ul的PCR管中，2，4，6，8，10，12，14号引物各取2ul放入200 ul的PCR 管中，再依次加入

ATP 2ul, 浓度为1m Mol/L

PNK buffer A 2ul,

PNK 0.4ul

加水定容至20ul。

置于37度的恒温箱中静置30min

2，连接反应

一般定25ul的反应体系，依次加入

奇数管已磷酸化好的反应物5ul

偶数管已磷酸化好的反应物5ul

Taq DNA连接酶buffer 2.5 ul

Taq DNA连接酶0.2-0.3 ul

加水定容至25ul。

我们用的Taq DNA连接酶是New England（纽英伦）公司的高浓度的Taq DNA连接酶，浓度为40U/ ul，一般情况下加0.2 ul足以，如果做得连接扩增比较多时，即大于3个，建议配个总管。

然后上PCR仪

连接反应的程序是

94度2min

每秒钟下降0.02度直至下降至设定的连接反应温度值。

维持在你设定的连接温度30min

连接温度的设定一般我们参考该基因的平均的GC含量，最低的Tm值和平均的Tm值，设定值一般在45度到65之间，在45度到65度的范围内，Taq DNA连接酶均有活性。

如果一次做多个连扩，我们可以设一个比较低的连接温度值，我们先要考虑到所有引物都能够退火。

3，扩增反应

一般定50 ul的反应体系

连接反应物 5 ul

首尾引物各 2 ul

总管25 ul

加水补足至50 ul

再看看该基因的平均GC含量和平均Tm值。如果是高GC含量和高平均Tm值的基因片段考虑加入1-2 ul的DMSO，有助引物的退火和Pfu DNA 聚合酶通过高GC区。

再上PCR仪，程序是

1 72度2min

2 94度2min

3 94度20s

4 设定的退火温度值20s

5 72度13s

6 72度3min

3至5号程序跑20个循环

片段下来检测其亮度。