抗体与抗体动物种属来源
大分子药物的免疫原性评价
免疫原性评价PK/TK数据处理
方式： A：在计算平均值前剔除产生ADA个体的PK、TK数据 B:对影响PK行为的个体剔除数据 C:不管ADA产生，所以数据参与平均值计算 D:科学判断，Case By Case E：剔除和未剔除产生ADA的个体分别计算
基于风险评估的原则评判免疫原性，为临床免疫原性评价 和风险评估提供参考
很多拟用于人的生物制品对动物有免疫原性，因此该类产品进行长期毒性试验时,给药 期间应检测抗体以帮助解释试验结果。应明确抗体反应特点，如滴度、出现抗体的动 物数、中和或非中和抗体等，并将抗体的出现与所有药理和/或毒理的变化综合考虑。 尤其在解释数据时应考虑抗体形成对药代动力学/药效参数、影响范围和/或不良反应的 严重程度、补体活化或出现新毒性作用等的影响，也应注意评价与免疫复合物形成和 沉积有关的病理变化。《治疗用生物制品非临床安全性技术审评一般原则》
免疫原性分析方法的挑战
一、多结构域药物：
多结构域药物类型： Fc、HSA融合蛋白 PEG化药物 双特异性抗体 ADC药物
多结构域药物结构上的复杂性使其免疫原性风险更为复杂，分析方法 建立更为复杂
注意点：通常需要在临床试验中区分与药物结合的表位，根据结合功 能区来区分ADA的风险
策略：基于风险、基于目的、基于数据
免疫原性分析方法的挑战
二、多聚体：
多聚体是天然结构或变性蛋白组成的高分子量聚合体 生产各环节、产品运输、保存、给药等过程均可能产生 多聚体产生会增高产品免疫原性风险，并导致严重的副作用
免疫原性分析方法的挑战
三、游离药物干扰ADA检测：
游离药物与游离ADA结合，影响ADA检出，导致假阴性
同种属来源一抗在免疫荧光双标记染色中的可行性
同种属来源一抗在免疫荧光双标记染色中的可行性陈曦;刘哲;邓茂林;冯轼【摘要】目的探讨同种属来源一抗在免疫荧光双标记染色中的可行性.方法本研究采用顺序法对小鼠结肠组织IL-17和肠神经胶质细胞源性神经营养因子GDNF 的特异性受体亚基GFR-α1进行同种属来源一抗的免疫荧光双标记染色.结果炎症状态下小鼠结肠组织黏膜及黏膜下层可见被绿色荧光和红色荧光双重标记的阳性细胞,提示IL-17+的Th17细胞表面有GDNF特异性受体亚基GFR-α1表达.结论采用顺序法进行免疫荧光双标记染色,尤其是当已知两种目标抗原表达位置不同时,向一种属来源的一抗仍可得出可信的实验结果.【期刊名称】《四川解剖学杂志》【年(卷),期】2015(023)001【总页数】4页(P13-15,19)【关键词】免疫荧光双标记染色;白介素-17/IL-17;GDNF家族受体-α1/GFR-α1【作者】陈曦;刘哲;邓茂林;冯轼【作者单位】成都大学附属医院消化内科,成都610041;成都大学附属医院消化内科,成都610041;成都大学附属医院消化内科,成都610041;成都大学附属医院消化内科,成都610041【正文语种】中文【中图分类】R329近年来，免疫荧光染色技术在生物及基础医学的科学研究中运用越来越广泛，当需要在同一组织／细胞上检查两种不同抗原时，则需要进行免疫荧光双标记染色［1］。
顺序法免疫荧光双标记染色因为操作流程复杂、操作时间长等缺点而濒于淘汰，但实际的科研工作中受实验经费、条件等限制，常常遇到一抗种属来源相同无法进行同步法免疫荧光双标记染色的情况。
本研究通过对小鼠结肠组织白细胞介素-17（Interleukin-17，IL-17）［2］和肠神经胶质细胞源性神经营养因子（Glial cell line-derived neurotro-phic factor，GDNF）特异性受体亚基 GFR-α1（GDNF family receptor-α1，GFR-α1）［3］进行的种属来源一抗顺序法免疫荧光双标记染色，探讨了特异性分泌IL-17的肠Th17细胞中GDNF受体的表达，并对如何避免同种属来源一抗的交叉染色等问题进行了分析讨论。
抗体相关基本知识
抗体相关基本知识抗体相关基本知识抗体(antibody)是⽣物体在抗原物质刺激下，由B细胞分化成的浆细胞所产⽣的、可与相应抗原发⽣特异性结合反应的免疫球蛋⽩(Ig)。
按抗体的来源，可将其分为天然抗体和⼈⼯制备的抗体，是通过对特定⽣物体免疫接种特定抗原物质后⽽获得。
⼈⼯免疫动物制备的抗体应⽤甚为⼴泛，既可以⽤于科学研究，也可以⽤于疾病的预防、诊断和治疗。
体⼀、抗体的基本结构的基本结构经x线晶体衍射结构分析发现，抗体Ig由四条多肽链组成，各肽链之间由数量不等的链间⼆硫键连接。
Ig可形成“Y”字型结构，称为I g 单体，是构成抗体的基本单位。
（⼀）重链和轻链天然Ig分⼦含有四条异源性多肽链，其中，分⼦量较⼤的两条链称为重链(heavy chain,H)，⽽分⼦量较⼩的两条链称为轻链(Light chain,L)。
同⼀Ig分⼦中的两条H链和两条L链的氨基酸组成完全相同。
1.重链分⼦量为50000～75000，由450～550个氨基酸残基组成。
重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同，其抗原性也不同。
据此，可将抗体Ig分为5类(class)，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE,其相应的重链分别为µ链、δ链、γ链、α链和ε链，商品化的抗体绝⼤部分都是IgG。
不同类的Ig具有不同的特征，如链内和链间⼆硫键的数量和位置、结构域的数量及铰链区的长度等均不完全相同。
即使是同⼀类的Ig，其铰链区氨基酸组成和重链⼆硫键的数量、位置也不同，据此⼜可将同类Ig分为不同的亚类(subclass)。
IgG的亚类利⽤不同种属动物制备的IgG存在不同的亚类，常见的不同种属IgG亚类如下：兔:IgG（⽆亚类）⼩⿏:IgG1,IgG2a,IgG2b,IgG2c,IgG3⼤⿏:IgG1,IgG2a,IgG2b,IgG2c,IgM⼭⽺:IgG1,IgG2在进⾏某些抗体相关实验(如IF和FCM)的时候，我们常常需要仔细看⼀下所订购商品化抗体的IgG亚类，以⽅便我们选择同型对照(isotype control)IgG(即与⽬的蛋⽩抗体相同来源种属的相同类型正常IgG)作为抗体的阴性对照进⾏平⾏实验，以排除可能的⾮特异性染⾊结果。
WB检测抗体如何选择(下)
WB检测抗体如何选择WB检测之二抗二抗选择二抗是用一抗免疫动物制备的抗一抗的抗体，选择范围较窄，基本是商品化的，在不考虑二抗修饰类型的前提下，二抗的选择需要遵循以下原则：二抗来源种属、一抗来源种属和抗原来源种属互不相同。
例如如果研究对象是人的蛋白X，选择了鼠抗X一抗，则可选择兔抗鼠二抗或者羊抗鼠二抗。
二抗选择要考虑的问题有：①对单抗类一抗，二抗需与一抗的类别或亚类相匹配（多抗类一抗主要是IgG类免疫球蛋白故相应二抗就是抗IgG F(ab’)2二抗，避免各种Ig保守结构域导致的交叉反应。
然而各种Ig仍具有保守的轻链结构域，因此还是有一定程度的交叉反应。
WB检测之内参抗体Western Blot检测方法不仅能检测靶蛋白存在与否，还能比较不同条件下或者不同组织中靶蛋白的相对表达量，可作为蛋白表达水平最直接的证据。
在WB实验中有众多不确定因素影响靶蛋白表达水平的测定，如方法学本身性质、操作误差等。
为准确衡量靶蛋白表达水平，需要精确一致的上样量，使用内参的意义即是保证上样量的一致。
内参即内部参照（Internal Control），对哺乳动物细胞一般指管家基因的表达蛋白(Housekeeping Proteins)。
此类蛋白在各组织和细胞中的表达相对恒定，可作为检测蛋白表达水平变化的参照物。
当内参条带亮度基本一致时，基本可以确定上样量是一致的，通常采用比较靶蛋白和内参蛋白条带亮度比值来进行相对定量。
WB实验中涉及到的蛋白-抗体结合是一个复杂的活性生物大分子间的相互作用，众多因素都会影响实验的结果。
例如时间、温度、浓度、离子强度等，在实验设计时就需要有严谨的对照方案，通过对照就容易判断问题所在，严谨的WB实验中需要设立蛋白分子量标准、空白载体对照、未诱导对照、已知量标准物正对照和内参。
内参使用方法1.标记内参：酶标的内参抗体可避免二抗结合总蛋白中某些免疫球蛋白产生的杂带，使用时只需在二抗孵育时加入酶标内参抗体，按照正常操作即可。
抗体与抗体动物种属来源
（CD79A）IGBP-1 ( lmmunog lobuin binding protein-1)免疫球蛋白结合蛋白S-0298R -1◆兔抗人、大鼠、小鼠CD79A多克隆抗体◆200ul/800.00 1ml/2200.00 (100ug/200ul 500ug/1ml)亲和纯化抗体◆WB=1:300-600 Elisa=1:500-1500 IP=1:50-150 IHC=1:300-600◆CD79a表达于从前B细胞到浆细胞的整个B细胞发育阶段。
CD79a与C D79b构成B细胞受体复合体，在介导lgM从细胞内转到细胞膜上起重要作用.CD79a是B细胞常用标记物。
抗体动物种属来源缩写：R-兔、M-小鼠、r-大鼠、Sh-山羊、H-人CD133 antigen造血干细胞抗原S-0209R ◆兔抗人、大鼠、小鼠CD133多克隆抗体◆200ul/800.00 1ml/2200.00 (100ug/200ul 500ug/1ml)亲和纯化抗体◆WB=1:300-600 Elisa=1:500-1500 IP=1:50-150 IHC=1:300-600◆一般认为，VEGFR2（血管内皮生长因子受体2）是HSCs（造血干细胞）的特异性标志。
近来经研究发现DD133分子是HSCs（造血干细胞）特异性标志。
抗体动物种属来源缩写：R-兔、M-小鼠、r-大鼠、Sh-山羊、H-人CEA（Carcino embryo nic Antigen）人癌胚抗原S-0060R ◆兔抗人人癌胚抗原多克隆抗体◆200ul/600.00 1ml/1800.00 (100ug/200ul 500ug/1ml)亲和纯化抗体◆WB=1:300-600 Elisa=1:500-1500 IP=1:50-150 IHC=1:300-600◆癌胚抗原（Carcino embryo nic Antigen,CEA）是一种血浆糖蛋白，可用于早期辨认某些肿瘤，存在于胚胎中，刚出生后却不能被测出，以后当出现恶性肿瘤时能再次形成。
抗体的制备方法与原理
抗体的制备方法与原理一、抗血清的制备有了质量好的抗原，还必须选择适当的免疫途径，才能产生质量好（特异性强和效价高）的抗体。
（一）用于免疫的动物作免疫用的动物有哺乳类和禽类，主要为羊、马、家兔、猴、猪、豚鼠、鸡等，实验室常用者为家兔、山羊和豚鼠等。
动物种类的选择主要根据抗原的生物学特性和所要获得抗血清数量，如一般制备抗r-免疫球蛋白抗血清，多用家兔和山羊，因动物反应良好，而且能够提供足够数量的血清，用于免疫的动物应适龄，健壮，无感染性疾患，最好为///雄性，此外还需十分注意动物的饲养，以消除动物的个体差异以及在免疫过程中死亡的影响。
若用兔，最好用纯种新西兰兔，一组三只，兔的体重以2～3kg为宜。
（二）免疫途径免疫途径有多种多样，如静脉内、腹腔内、肌肉内、皮内、皮下、淋巴结内注射等，一般常用皮下或背部多点皮内注射，每点注射左右。
途径的选择决定于抗原的生物学特性和理化特性，如激素、酶、毒素等生物学活性抗原，一般不宜采用静脉注射。
（三）佐剂由于不同个体对同一抗原的反应性不同，而且不同抗原产生免疫反应的能力也有强有弱，因此常常在注射抗原的同时，加入能增强抗原的抗原性物质，以刺激机体产生较强的免疫反应，这种物质称为免疫佐剂。
佐剂除了延长抗原在体内的存留时间，增加抗原刺激作用外，更主要的是，它能刺激网状内皮系统，使参与免疫反应的免疫活性细胞增多，促进T细胞与B细胞的相互作用，从而增强机体对抗原的细胞免疫和抗体的产生。
常用的佐剂是福氏佐剂（Freundadjuvant）,其成分通常是羊毛脂1份、石腊油5份，羊毛脂与石腊油的比例，视需要可调整为1：2～9（V/V），这是不完全福氏佐剂，在每毫升不完全佐剂加入1～20mg卡介苗就成为完全佐剂。
配制方法：按比例将羊毛脂与石蜡油置容器内，用超声波使之混匀，高压灭菌，置4℃下保存备用。
免疫前取等容积完全或不完全佐剂与免疫原溶液混合，用振荡器混匀成乳状，也可以在免疫前取需要量佐剂置乳钵中研磨，均匀后再边磨边滴加入等容积抗原液（其中加卡介苗3～4mg/ml或不加），加完后再继续研磨成乳剂，滴于冰水上5～10min内完全不扩散为止。
免疫组织化学实验之常用染色方法 百度文库
免疫组化的相关知识！一、免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)免疫组织化学是利用抗原抗体的特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。
免疫组织化学染色技术不仅有较高的敏感性和特异性，其特点是将形态学改变与功能、代谢变化结合起来，直接在组织切片，细胞涂片或培养细胞爬片上定位一些蛋白质和多肽类物质的存在，并可精确到亚细胞结构水平，结合电子计算机图像分析系统或激光扫描共聚集显微术等技术，对被检物质进行定量分析。
二、免疫组化实验所用的组织和细胞标本有哪些？实验所用主要为组织标本和细胞标本两大类，前者包括石蜡切片(病理大片和组织芯片)和冰冻切片，后者包括组织印片、细胞爬片和细胞涂片。
其中石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回顾性研究；石蜡切片制作过程对组织内抗原暴露有一定的影响，但可进行抗原修复，是免疫组化中首选的组织标本制作方法。
三、石蜡切片为什么要做抗原修复？有哪些方法？石蜡切片标本均用甲醛固定，使得细胞内抗原形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇，同时蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。
所以要求在进行IHC染色时，需要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。
常用的抗原修复方法有微波修复法，高压加热法，酶消化法，水煮加热法等，常用的修复液是pH6.0的0.01 mol/L的柠檬酸盐缓冲液。
四、免疫组化实验用抗体的选择1、一抗选择要点(1)选择单克隆还是多克隆抗体。
由一种克隆产生的特异性抗体叫做单克隆抗体，单克隆抗体能目标明确地与单一特异抗原决定簇结合，就象导弹精确地命中目标一样。
另一方面，即使是同一个抗原决定簇，在机体内也可以由好几种克隆产生抗体，形成好几种单克隆抗体混杂物，称为多克隆抗体。
免疫双标,抗体如何选择？
免疫双标，抗体如何选择？注意几点：1）最好是不同种属来源的一抗，而且最好都是单抗。
这样就要选择相应不同种属来源的二抗，避免同种属来源的二抗与两个一抗的交叉反应。
选择单抗也是避免交叉反应和假阳性。
好的抗体真的还是很重要。
2）如果条件所限，只找到一种抗体，而且说明书没有明确说可以做免疫荧光怎么办？这个可能不是说就一定不能做，也可能是厂家没做这方面的实验，可以大胆的try3)为何免疫双标一般是免疫荧光为主？一方面是不同抗体标记不同的荧光，图片漂亮；另一方面也是为了避免SP和ABC法中还要封闭内源性过氧化物酶等可能会引起假阳性反应。
4）是否可以用不同荧光染料直接标记的不同一抗来做？可以做，过程还可省一步。
但是注意没有二抗的放大效应，结果可能有时很难出来。
5）免疫双标荧光的图像如何整合？可以用扫描共聚焦，或者用园子的软件整合。
注意及时照相，荧光过段时间会淬灭。
免疫双标中，最为关键的是一抗、二抗的选择以及恰当的搭配：1. 免疫双标做得好的基本原则是：一抗种属不同，二抗匹配对应的一抗，二抗不同颜色标记，二抗之间无交叉反应2. 抗体的选择一般根据本实验相关的一些关键词（抗体名称、编号、目标动物种属、实验方法...）来检索一些档次较高的文献，看看图片较好的文献中研究者们用的哪个公司的什么编号抗体，不见得知名公司的抗体就一定做得出来，实践检验过了的才是金标准。
3. 封闭液的选择封闭液作用就是尽量封闭掉能与二抗结合产生非特异性染色的抗原。
所以，封闭液尽量选择与二抗种属同源的血清封闭液。
比如，二抗是“驴抗羊FITC、驴抗兔CY3”，那么最佳封闭液就是驴血清封闭液。
免疫双标一抗的选择主要有两种形式:第一：一抗种属来源相同：即一抗A和B都是小鼠抗大鼠，或者都是兔抗大鼠；对于这种情况，采用的双标方法是顺序法，即把免疫组化的过程走两遍，一抗不能同时加。
第二：一抗种属来源不同：比如一抗A是小鼠抗大鼠，一抗B是兔抗大鼠，即A的种属来源是小鼠，B的种属来源是兔；针对的组织是大鼠。
抗体制备
二、免疫动物
为获取高质量的抗体，除了需制备高纯度 的抗原外，还需选择适宜的动物和设计有 效可行的免疫方案，如抗原的剂量、剂型、 注射途径、注射次数、注射间隔和接种动 物的年龄均与免疫效果密切的关系。
1.免疫动物的选择
选择动物时应考虑以下因素： ①抗原来源与动物种属的关系。抗原的来源与免疫动物 种属差异越远，其免疫源性越强，免疫效果越好，而 同种系或亲缘关系越近，免疫效果越差。 ②动物个体的选择。适龄、健康、体重符合要求的正常 动物（以雄性为佳）；抗体需要量少时，选用家兔、 豚鼠和鸡等小动物；抗体需要量大时，可选用绵羊、 山羊、马、驴等大动物。 ③抗原性质与动物种类。
第十一章 抗体制备
抗体的制备技术经历了三代： 第一代抗体是传统的抗体制备方法即利用抗原免 疫动物后获得抗体，称为多克隆抗体（polyclonal antibody）； 第二代抗体是通过杂交瘤技术制备出针对抗原中 某一抗原决定簇的抗体称为单克隆抗体 (monoclonal antibody, McAb)； 第三代抗体是利用基因工程技术制备而来，称为 基因工程抗体(genetic engineering antibody)。本 章主要介绍三种类型抗体的制备方法。
一、杂交瘤技术的基本原理
一、杂交瘤技术的原理及流程
二、单克隆抗体制备技术
1. 主要材料
2. 细胞融合前准备
3. 细胞融合
4. 抗体的初筛和克隆化
5. 杂交瘤细胞冻存与复苏
6. 单克隆抗体的批量生产
7. 单克隆抗体的纯化与鉴定
（一）主要材料：
RPMI1640培养液 FCS 10% 谷氨酰胺 2mmol/L 青霉素 100IU/ml 链霉素 100Ug/ml
抗体的制备
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C、凝胶层析法：利用凝胶的多孔网状结构， 大分子在凝胶颗粒间很快通过，小分子 进入网孔，难于洗脱，将抗原分为大、 中、小三种。属区带分离法。
D、离子交换层析：利用带离子基团的纤维 或凝胶，吸附带相反电荷的抗原。
凝胶过滤层析( 分子筛)的作用机理
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E、亲和层析：利用生物学分子间所具有的 专一亲和性而设计的层析方法。Ag-Ab, 激素-受体，酶-酶配体，酶蛋白-辅酶。
+ 蛋白的含量—定氮（紫外光280nm等） + 分子的质量—电泳、质谱
+ 蛋白的纯度—电泳等
+ 免疫学活性—免疫双扩散、免疫印迹
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(二)半抗原免疫原的制备：利用某些功能
团将半抗原连接到载体上。
1、载体的选择： A、蛋白质：人/牛/兔白蛋白、牛甲状腺球蛋
白和血蓝蛋白等。最常用牛白蛋白。
B、多肽聚合物：多为人工合成(多聚赖氨酸)。
B、明矾：硫酸钾铝在一定pH下产生 氢氧化铝胶体。制备方法是：Ag+NS， 搅拌下缓慢滴入10%的硫酸铝钾溶液， 以NaOH校正pH至6.5，离心、NS洗 涤。
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C、福氏佐剂：分为不完全佐剂(石蜡油+ 羊毛脂)和完全佐剂(石蜡油+羊毛脂+卡 介苗)。1:1与抗原混合研磨均匀即可。 但完全福氏佐剂局部注射因易形成肉 芽肿和持久溃疡而不用于人体免疫。
E、表面活性剂处理：在一定的条件下，表 面活性剂能与细胞膜脂蛋白形成微泡， 使膜的通透性发生改变而使细胞破碎。 提取核酸时常用此法。
F、自溶法：利用组织和微生物的自身酶系， 在一定条件下使细胞溶解。
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(2)蛋白质抗原的制备：破碎的细胞按一定 要求纯化，可获得不同成分的抗原。
WB检测抗体如何选择(下)
WB检测抗体如何选择WB检测之二抗二抗选择二抗是用一抗免疫动物制备的抗一抗的抗体，选择范围较窄，基本是商品化的，在不考虑二抗修饰类型的前提下，二抗的选择需要遵循以下原则：二抗来源种属、一抗来源种属和抗原来源种属互不相同。
例如如果研究对象是人的蛋白X，选择了鼠抗X一抗，则可选择兔抗鼠二抗或者羊抗鼠二抗。
二抗选择要考虑的问题有：①对单抗类一抗，二抗需与一抗的类别或亚类相匹配（多抗类一抗主要是IgG类免疫球蛋白故相应二抗就是抗IgG F(ab’)2二抗，避免各种Ig保守结构域导致的交叉反应。
然而各种Ig仍具有保守的轻链结构域，因此还是有一定程度的交叉反应。
WB检测之内参抗体Western Blot检测方法不仅能检测靶蛋白存在与否，还能比较不同条件下或者不同组织中靶蛋白的相对表达量，可作为蛋白表达水平最直接的证据。
在WB实验中有众多不确定因素影响靶蛋白表达水平的测定，如方法学本身性质、操作误差等。
为准确衡量靶蛋白表达水平，需要精确一致的上样量，使用内参的意义即是保证上样量的一致。
内参即内部参照（Internal Control），对哺乳动物细胞一般指管家基因的表达蛋白(Housekeeping Proteins)。
此类蛋白在各组织和细胞中的表达相对恒定，可作为检测蛋白表达水平变化的参照物。
当内参条带亮度基本一致时，基本可以确定上样量是一致的，通常采用比较靶蛋白和内参蛋白条带亮度比值来进行相对定量。
WB实验中涉及到的蛋白-抗体结合是一个复杂的活性生物大分子间的相互作用，众多因素都会影响实验的结果。
例如时间、温度、浓度、离子强度等，在实验设计时就需要有严谨的对照方案，通过对照就容易判断问题所在，严谨的WB实验中需要设立蛋白分子量标准、空白载体对照、未诱导对照、已知量标准物正对照和内参。
内参使用方法1.标记内参：酶标的内参抗体可避免二抗结合总蛋白中某些免疫球蛋白产生的杂带，使用时只需在二抗孵育时加入酶标内参抗体，按照正常操作即可。
抗体的选择和保存指南
抗体的选择和保存指南展开全文当我们要检测目的蛋白在组织中表达情况的时候，如何选择适合我们实验需要的抗体，并恰当保存使用，是每个科研人员需要细心考虑的。
抗体种类繁多，品牌众多，技术参数不一，价格和质量更是相差甚大，如何购买到高质量价格合适的抗体，并准确地做出我们想要的结果，其中有很多细节需要注意。
一、怎样选择适合你实验需要的抗体？1. 一抗选择要点（1）确定抗体的名字，注意中英文名字、它名、亚型等信息。
（2）确定你的实验类型，Elisa，WB，IHC，ICC，还是FACS。
一般抗体的说明书都会列出该抗体经验证过适用于何种实验的类型，如果抗体说明书没有提及的应用类型，并不意味着该抗体不适用于此种分析应用类型，而仅是说明尚未经过此种实验验证，请根据说明书列出的已验证的类型来选择适合你实验的抗体。
（3）确定实验样本的种属，Human，Mouse，还是Rat。
一般抗体说明书都列出该抗体经试验验证过适用于何种物种实验，请根据说明书列出已验证的种属来选择适合你实验的抗体。
（4）样本蛋白的结构性质。
了解样本蛋白的结构性质有助于选择最合适的抗体，待测样本蛋白的结构域和样本在提取和处理过程中是否会变性，蛋白空间构象的改变，会影响抗体的免疫亲和反应。
（5）单多克隆抗体的选择。
市面上的抗体还是以多克隆抗体为主，一般单克隆抗体特异性强，但亲和力相对小，检测抗原灵敏度相对就低；而多克隆抗体特异性稍弱，但抗体的亲和力强，灵敏度高，但易出现非特异性染色（可以通过封闭等避免）。
2. 二抗选择要点（1）种属来源。
主要根据一抗种属来源来决定购买二抗来源，如一抗是小鼠来源，那二抗就买抗小鼠的即可（羊、兔等均可）。
（2）标记物的选择。
有HRP、Biotin、荧光素等标记物。
一般SP三步法二抗选择Biotin标记的二抗，以与后面的SP结合反应，而免疫荧光染色就需要购买不同荧光素标记的二抗，如罗丹明、FITC、Cy3等常用荧光素。
二、抗体的稳定性1. 抗体的稳定性是自然界长期进化的结果。
β-Amyloid(1-42) β淀粉样肽(1-42)要点
S-0107R
◆兔抗人、大鼠、小鼠β-Amyloid（1-42）多克隆抗体
◆200ul/1200.00 1ml/4200.00 (100ug/200ul 500ug/1ml)亲和纯化抗体
◆WB=1:300-600 Elisa=1:500-1500 IP=1:50-150 IHC=1:300-600
抗体动物种属来源缩写：R-兔、M-小鼠、r-大鼠、Sh-山羊、H-人
Apaf-w1(C端)凋亡蛋白活性因子-1
S-0058R
◆兔抗人、大鼠、小鼠Apaf-1(CT)多克隆抗体
◆200ul/1000.00 1ml/2900.00 (100ug/200ul 500ug/1ml)亲和纯化抗体
◆WB=1:300-600 Elisa=1:500-1500 IP=1:50-150 IHC=1:300-600
◆APAF-1(Apoptosis protease activating factor-1)调节细胞色素C依赖的Caspase-9原有的自动催化活性，导致Caspase-3的激活和引起凋亡。Apaf-1在成年人的脾脏、外周血白细胞、肾脏、肺和胎儿脑、肾、肺中高水平表达。
抗体动物种属来源缩写：R-兔、M-小鼠、r-大鼠、Sh-山羊、H-人
◆血管紧张素原是一种大分子糖蛋白和α2球蛋白，分子量为55-65KDa,广泛分布于血液循环、淋巴、脑、肾脏等组织。
抗体动物种属来源缩写：R-兔、M-小鼠、r-大鼠、Sh-山羊、H-人
◆AR(Androgen Receptor; dihydro testosteroneR)是一个由920个氨基酸组成的蛋白质，位于雄激素靶组织细胞中或细胞表面上的特异分子部位或结构。AR在前列腺癌中起着重要作用，研究表明AR的表达与组织分型形成一定的相关性，AR在高分化的肿瘤中表达的较多，而在低分化的肿瘤中表达较少。分子量为：101KDa。
同型对照
同型对照同型对照的主要目的是确定一抗的结合是特异性的，而不是非特异性的Fc受体或与其他蛋白的相互作用。
还可以用来竞争性的结合抗体，与功能阻断抗体发挥同样的功能。
同型对照要与一抗的来源，Ig分型和标记完全一致。
同型对照（Isotype Control）：使用与一抗相同种属来源、相同亚型、相同剂量和相同的免疫球蛋白及亚型的免疫球蛋白，用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面而产生的背景染色。
如果一抗是多抗，可以用an normal serum（与一抗相同的正常血清）（must be the same species as primary antibody）。
This control is easy to achieve and can be used routinely in immunohistochemical staining.这个可以咨询试剂商。
同型对照为免疫荧光标记中的阴性对照。
由于荧光标记单抗的组来源不同，应选用相同来源的未标记单抗作为同型对照来调整背景染色。
举个例子：比如检测一抗为单抗的mouse anti rat CD11b，clone OX-42 purified IgG，那么它的isotype 是mouse IgG2a，所以可以用purified（纯化的）mouse IgG2a来做OX-42的同型对照（Isotype Control）。
一般的的生物技术公司和国内的代理都有出售。
同型对照：是指与MoAb相同的、未免疫小鼠的免疫球蛋白亚类，若使用直接免疫荧光染色法，同型对照也应标记荧光色素，如IgG1 FITC、IgG2ａ、PE等。
主要考虑了细胞的自发荧光、FC受体介导的抗体结合和非特异性抗体结合等影响因素。
此外，同型对照与MoAb 所标记的荧光色素、浓度、F：P比值（标记的荧光色素与免疫球蛋白分子的比值）应该相同为最佳，这对准确设定阴性与阳性细胞的界标有重要意义，切忌使用与MoAb不相匹配的同型对照，最好为同一实验室、采用相同工艺或方法制备（如同一品牌）的产品。
抗原抗体种属-概述说明以及解释
抗原抗体种属-概述说明以及解释1.引言1.1 概述抗原与抗体作为生物学中重要的概念，是免疫系统中的关键组成部分。
抗原是一种能够引起免疫系统产生应答的物质，可以来自于外界的微生物、毒素、异种细胞或者自身异常变化的细胞。
而抗体则是免疫系统识别并与抗原结合，进而中和或清除抗原的分子。
在正常情况下，免疫系统能够识别并清除抗原，从而维护机体健康。
不同种类的抗原和抗体具有多样性，这使得免疫系统能够对抗各种外来威胁和内源异常。
抗原和抗体的种属是指它们根据不同的特征进行分类。
对于抗原而言，可以根据其来源、结构、功能等进行分类；而抗体则可以根据其结构、产生的细胞类型以及作用方式来进行归类。
了解抗原和抗体的种属对于免疫系统的研究和应用具有重要意义。
首先，不同种类的抗原和抗体具有不同的免疫特性和生物学功能，研究和分类能够帮助我们更好地理解它们之间的作用机制和相互关系。
其次，抗原和抗体的种类繁多，可以广泛应用于医学诊断、药物研发和治疗等领域。
例如，通过检测特定抗原或抗体的存在，可以帮助医生判断某些疾病的发生程度或者预测治疗效果。
本文将重点介绍抗原和抗体的种属，包括它们的定义、分类和重要性，并以此为基础探讨其在科学研究和临床应用中的潜力和前景。
进一步了解抗原和抗体的种属将有助于我们深入理解免疫系统的基本原理，推动相关领域的科学发展和医疗进展。
同时，还有待进一步的研究和探索，以揭示未知的抗原和抗体类型，并开展更加深入的应用研究，从而为人类健康提供更有效的解决方案。
1.2 文章结构本文将按照以下结构进行论述：首先，引言部分将概述本文的主要内容和目的，为读者提供一个整体的认识；接下来，正文部分将分为两个主要部分，分别是抗原种属和抗体种属。
在抗原种属部分，将对抗原的定义和分类进行说明，并介绍其在生物学和医学领域中的重要性和应用。
而在抗体种属部分，将对抗体的定义和分类进行阐述，并探讨其在免疫应答中的功能和特点。
最后，在结论部分，将总结抗原抗体种属的重要性，并展望未来的研究方向，以期更好地理解和应用抗原抗体系统。
免疫荧光中二抗种属和封闭抗体种属
免疫荧光中二抗种属和封闭抗体种属一、概述免疫荧光技术是一种广泛应用于生物医学研究和临床诊断的方法，它利用免疫荧光染色可以快速准确地检测细胞或组织中特定的蛋白质分布和表达情况。
而其中二抗和封闭抗体的种属对于免疫荧光技术的成功应用至关重要。
二、免疫荧光中二抗种属1. 源自不同种属的抗体在免疫荧光技术中，二抗是指与待检测抗体相互作用的第二个抗体。
为了避免原发抗体与被检测物种属的冲突，二抗和原发抗体应来自不同的物种。
常用的二抗种属包括兔抗小鼠、小鼠抗兔等。
2. 减少假阳性结果使用源自不同种属的二抗有助于减少假阳性结果的发生，提高检测结果的准确性和可靠性。
在选择二抗种属时，应充分考虑原发抗体的种属，以确保实验结果的准确性。
三、封闭抗体种属1. 封闭抗体的种属选择在免疫荧光技术中，封闭抗体是指用于阻断非特异性结合的抗体，在免疫组织化学和免疫细胞化学应用中，封闭抗体能够有效地提高检测的特异性。
封闭抗体的种属选择应根据待检测标记物的来源和原发抗体的种属进行选择，以确保封闭抗体与原发抗体不发生交叉反应。
2. 提高检测结果的特异性封闭抗体的种属选择直接影响着检测结果的特异性，正确选择种属可有效降低背景信号，提高检测结果的清晰度和可读性。
封闭抗体的种属选择是免疫荧光技术中至关重要的一环。
四、总结免疫荧光技术在生物医学研究和临床诊断中具有重要的应用价值，而其中二抗和封闭抗体的种属选择对于免疫荧光技术的成功应用至关重要。
正确选择二抗种属和封闭抗体种属可以有效减少假阳性结果，提高检测结果的准确性和特异性，为科研工作者和临床医生提供可靠的实验结果和诊断依据。
在进行免疫荧光实验时，科研工作者和临床医生应该充分考虑二抗和封闭抗体的种属选择，确保实验结果的准确和可靠。
五、实验设计中的考虑在进行免疫荧光实验设计时，正确选择二抗和封闭抗体的种属至关重要。
在实验设计中，应充分考虑以下几个方面：1. 样本来源不同样本来源可能含有不同种类的抗原和受体，因此在实验设计中，需要根据样本来源选择合适的二抗和封闭抗体的种属，以确保实验结果的准确性和特异性。
如何选择抗体的种属及特异性
说说抗体选择的那些事儿随着生命科学的发展，围绕蛋白进行的研究越来越多，抗体试剂在实验中的重要性越来越举足轻重。
面临着纷呈复杂的抗体试剂市场，如何选择到适合自己实验的抗体就变得尤为重要。
一、关于特异性的选择：特异性的选择主要需要考虑四个方面：蛋白特异性、种属特异性、实验方法特异性、标记物的特异性。
1、蛋白特异性：针对需要检测的蛋白查找抗体，几个细节要区分，重组表达的蛋白和内源性蛋白的检测，对抗体的要求是不一样的，注意查看抗体说明书的检测说明。
如果重组蛋白不是全长表达，则需要注意抗体的免疫原区域是否在重组蛋白区域内。
内源性蛋白最好能清楚其剪切与修饰的方式，特殊表型的蛋白需要进行序列比对，并结合抗体免疫原序列，查看交叉反应的情况。
磷酸化蛋白检测需要确定具体位点，不同位点的磷酸化意味着可能有不同的机制存在，不宜一概而论。
2、种属特异性：同种蛋白不同物种，有着或大或小的差异。
目前大部分商品化抗体都是以人源蛋白序列为模板重组蛋白或设计多肽抗原的，根据蛋白的同源性情况与其他种属发生交叉反应。
需要参照说明书注明的可反应种属信息。
一些稀有种属很难找到抗体，可以通过蛋白的序列比对，选择同源序列免疫的抗体，不过一般这种情况生产商不会受理其关于质量的申诉，如果可以申请到免费的抗体样品，则利于抗体选择。
3、实验方法特异性：目前使用抗体的实验方法有很多，不同的使用方法过程中，因为对蛋白样品的处理方式不一样，蛋白的含量有差异，对抗体的识别表位和效价要求都是不一样的。
具体的根据说明书注明的产品应用方法进行选择。
但是生产商一般不会将每个抗体都进行各种实验的检测，目前检测比较多的只是WB、IHC、IF等，如果针对具体的实验方法没有找到合适的抗体的，可以结合蛋白序列分析和抗体的抗原信息，选择尽可能有效果的抗体。
同样，申请到免费的抗体样品是个很好的途径。
4、标记物的特异性一般基于实验操作的实验方法不会使用带有标记的一抗，比如WB、IHC等，都是通过二抗类的试剂标记达到结果呈现的目的。
抗体小知识
科技名词定义中文名称：抗体英文名称：antibody;Ab定义1：能与相应抗原(表位)特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。
应用学科：免疫学（一级学科）；免疫系统（二级学科）；免疫分子（三级学科）定义2：在人和动物体内，由于抗原或半抗原入侵刺激机体而在细胞中产生的免疫球蛋白。
能可逆、非共价、特异地与相应抗原结合，形成抗原-抗体复合体。
应用学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；总论（二级学科）定义3：机体内B细胞在抗原刺激下所产生的具特异性免疫功能的球蛋白。
应用学科：水产学（一级学科）；水产生物病害及防治（二级学科）定义4：具有抗原结合部位，能与抗原分子上相应表位发生特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。
应用学科：细胞生物学（一级学科）；细胞免疫（二级学科）本内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布求助编辑百科名片Y型抗体结构示意图抗体(antibody)指机体的免疫系统在抗原刺激下，由B淋巴细胞或记忆细胞增殖分化成的浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。
主要分布在血清中，也分布于组织液及外分泌液中。
目录概念多克隆抗体的制备单克隆抗体的制备概述生物活性抗体结构抗体基因重排单克隆抗体抗体的多样性抗体的功能抗体规律抗体的分类按作用对象按理化性质和生物学功能按可见反应按抗体来源世界著名抗体公司Santa公司Abcam公司Abgent公司AbMARTProteintech GroupMBLCell Signaling Technology(CST) Zymed Laboratories公司台湾AbnovaChemiconPierce公司BDPeproTechCaymanAssay DesignDynal Biotech ASA.DSL公司罗氏公司（Roche）BioLegend公司eBioscience公司BioVision. Inc.MABTech电影基本信息上映日期剧情简介概念多克隆抗体的制备单克隆抗体的制备概述生物活性抗体结构抗体基因重排单克隆抗体抗体的多样性抗体的功能抗体规律抗体的分类按作用对象按理化性质和生物学功能按可见反应按抗体来源世界著名抗体公司Santa公司Abcam公司Abgent公司AbMARTProteintech GroupMBLCell Signaling Technology(CST) Zymed Laboratories公司台湾AbnovaChemiconPierce公司BDPeproTechCaymanAssay DesignDynal Biotech ASA.DSL公司罗氏公司（Roche）BioLegend公司eBioscience公司BioVision. Inc.MABTech电影基本信息上映日期剧情简介展开编辑本段概念最初有人用电泳证明血清中抗体活性在γ球蛋白部分，故曾把抗体统称为丙种(γ)球蛋白。
免疫学实验一抗,二抗的选择与搭配原则和方法
• 3二抗的偶联标记
➢ 主要有酶（辣根过氧化酶HRP和碱性磷酸酶AP或其衍 生物APAAP，PAP），荧光基团（FITC、Rhodamine、 Texas Red、PE、Rhodamine、Dylight等）、生物素、金 颗粒。
➢ 选用哪种探针的二抗主要取决于具体的实验。 对于Western Blot和ELISA，最常用的二抗是酶标二抗； 细胞或组织标记实验（细胞免疫化学，组织免疫化学，流
【Anti-IgG还是Anti-IgG, F（ab’）2 fragment】
➢在一些如胸腺、脾脏、血液的组织以及造血细胞、淋巴细胞、B细胞 等细胞内，通常含有较多的Fc受体，这时候选择二抗时最好选择AntiIgG, F（ab’）2 fragment这样的特异性二抗，这样就消除了由于Fc部 分与IgG的非特异性结合。 ➢常规的都有结合反应，即 与IgG的Fc的F（ab’）2片段都能结合； ➢由于IgG、IgM、IgA都有保守的轻链结构域，因此Anti-IgG （H+L） 与它们都有交叉反应。而Anti-IgG, F（ab’）2 fragment经过了IgG Fc 片段的吸附，因此只与IgG的F（ab’）2片段结合。
➢ 为减少二抗与样本的非特异性结合，可选择经过 血清吸附过的二抗
➢ 如检测样本是人源的蛋白，一抗是小鼠源的单克 隆抗体，二抗就需要选择抗小鼠源的二抗，如果 对实验的特异性要求很高，选择经过人血清吸附 过的抗小鼠源的二抗，这种二抗由于经过人血清 吸附而排除了与人源组织（如IgG等）可能发生非 特异性反应的IgG，因此将非特异性结合降低到最 低。
• IgM抗体的检测用于传染病的早期诊断中。 间接法ELISA一般仅适用于检测总抗体或 IgG抗体。如用抗原包被的间接法直接测定 IgM抗体，因标本中一般同时存在较高浓度 的IgG抗体，后者将竞争结合固相抗原而使 一部份IgM抗体不能结合到固相上。因此如 用抗人IgM作为二抗，间接测定IgM抗体， 必须先将标本用A蛋白或抗IgG抗体处理， 以除去IgG的干扰。
M2PK(pyruvateKinaseM2)丙酮酸激酶M2
M2-PK（pyruvate Kinase M2）丙酮酸激酶-M2S-0101R◆兔抗人、大鼠、小鼠M2-PK多克隆抗体◆200ul/1200.00 1ml/4200.00 (100ug/200ul 500ug/1ml)亲和纯化抗体◆WB=1:300-600 Elisa=1:500-1500 IP=1:50-150 IHC=1:300-600◆M2 分布于初上描述以外的其他组织（尤以肾脏最多）以及胎儿个组织。
PK业是一种癌胚蛋白，在恶性肿瘤中，增高的都是M2型。
抗体动物种属来源缩写：R-兔、M-小鼠、r-大鼠、Sh-山羊、H-人M2-PK（pyruvate Kinase M2）丙酮酸激酶-M2S-0102M◆兔抗人、大鼠、小鼠M2-PK多克隆抗体◆200ul/1200.00 1ml/4200.00 (100ug/200ul 500ug/1ml)亲和纯化抗体◆WB=1:300-600 Elisa=1:500-1500 IP=1:50-150 IHC=1:300-600◆M2 分布于初上描述以外的其他组织（尤以肾脏最多）以及胎儿个组织。
PK业是一种癌胚蛋白，在恶性肿瘤中，增高的都是M2型。
抗体动物种属来源缩写：R-兔、M-小鼠、r-大鼠、Sh-山羊、H-人Melan-A/MarT-1 黑色素-AS-0051R◆兔抗人、大鼠、小鼠黑色素-A多克隆抗体◆0.2ml /1000.00 1ml/2900.00 (100ug/0.2ml 500ug/1ml)亲和纯化抗体◆WB=1:300-600 Elisa=1:500-2000 IP=1:50-100 IHC=1:300-600◆Melan-A/MART-1是分化肿瘤抗原类别中具有代表性的成员，它表达于正常的黑色素细胞和大多数原发及转移的黑色素瘤中。
抗体动物种属来源缩写：R-兔、M-小鼠、r-大鼠、Sh-山羊、H-人MTR-1A(Melatonin receptor-1A) 褪黑素受体（松果体素受体）S-0027R◆兔抗人、大鼠、小鼠褪黑素受体多克隆抗体◆0.2ml /1000.00 1ml/2900.00 (100ug/0.2ml 500ug/1ml)亲和纯化抗体◆WB=1:300-600 Elisa=1:500-1500 IP=1:50-150 IHC=1:300-600◆黑色素是一种广泛存在于多个组织中并具重要正理活动的激素，分子量为38kDa。