微生物学-10-10微生物的分类和鉴定

传代而来。
型（form）： 一般特性很难加以区分，某种特殊 的特性可以区分。 如：结核菌的人型、牛型、禽型。
斑马鱼肠道中一株红酵母（Rhodotorula）的鉴定与系统发育 分析
戚冰洁 胡秀彩 顾丹 梁爽 吕爱军*
（徐州师范大学生命科学学院，江苏 徐州 221116）
摘要：采用马铃薯葡萄糖培养基（PDA），从野生斑马鱼肠道中分离到 一株酵母菌，编号为ZF-2，进行形态学观察、生理生化特征、PCR扩增 26S rDNA D1/D2区以及基因测序分析，并构建系统发育进化树。结果表
明ZF-2分离株为粉红色菌落、菌体呈椭圆形，出芽繁殖；可以同化利用葡
萄糖、乳糖、蔗糖等糖类，基本符合红酵母属（Rhodotorula）特征，初 步确定为红酵母。PCR扩增获得26S rDNA D1/D2区序列长度为642bp (HQ323251)，采用BLAST和ClustalX程序进行序列比对分析，结果表明 与斯鲁菲亚红酵母（R. Slooffiae）序列相似性在99%-100%之间，构建 的系统发育进化树显示菌株ZF-2与R. Slooffiae (EU583485)关系最近，最 终鉴定ZF-2菌株为斯鲁菲亚红酵母。这是首次从斑马鱼肠道中分离到斯鲁 菲亚红酵母。 关键词：斑马鱼，红酵母，分离鉴定，序列分析
二、Ainsworth等人的菌物分类系统纲要
《安.贝氏菌物词典》第八版（1995年）
第四节 微生物分类鉴定的方法 四个不同水平： （1）细胞的形态和习性水平 （2）细胞组分水平 （3）蛋白质水平 （4）核酸水平 分类依据： • • • • 微生物形态 生理特性 抗原特性 分子生物学方法
一、微生物分类鉴定中的经典方法
R.H.Whittaker (1969) proposed a five kingdom classification. The kingdoms defined by him were named Monera, Protista, Fungi, Plantae & Animalia.
三域学说： 1977年，美国C.R.Woese等人对大量微生物和其他
草鱼肠道中弗氏柠檬酸杆菌的分离鉴定与PCR-SSCP分析
郑璐1，吕爱军1*，胡秀彩2，曹成亮1，蒋继宏2 (1.徐州师范大学生命科学学院，江苏 徐州 221116； 2.江苏省药用植物生物技术重点实验室，江苏 徐州 221116)
摘要：从草鱼（Ctenopharyngodon idellus）肠道中分离到3株细菌，暂时编
新种(species nova, sp. nov)：是指权威性的分类、鉴 定手册中从未记载过的一种新分离并鉴定过的微生物。
• 变种(Variety) ：一个微生物的种的某种特性已 起了明显的变化，这种特性的改变是与过去人 们在自然界中分离获得的菌种所描述的特性相 比较而确定的，而且这种变异的特性又是比较 稳定的，这种变异的菌株称为变种。 亚种(subspecies, subsp) 亚种是进一步细分种时所用的单元，一般指除 某一明显而稳定的特征外，其余鉴定特征与模 式种相同的种，是变种的同义词。
《伯杰氏细菌鉴定手册》（Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology），第九版的伯杰氏手册基于细 胞壁的特性将原核生物分成四大类群，其中薄壁菌和厚壁菌两 个类群物种数量最多。 类群I：薄壁菌（革兰氏阴性菌） 组1：暗细菌纲（不进行光合作用） 组2：不产氧光合细菌纲（光合细菌，不产氧） 组3：产氧光合细菌纲（光合细菌，产氧） 类群II：厚壁菌（革兰氏阳性菌） 组1：厚壁菌纲 组2：放线菌纲 类群III: 无壁菌 组1：柔膜菌纲（缺乏细胞壁的原生质体） 类群IV: 疵壁菌 古生菌纲
例1：苏云金芽孢杆菌蜡螟亚种 Bacillus thuringiensis subsp．galleria 例2：酿酒酵母椭圆变种 Saccharomyces cerevisiae var．ellipsoideus
(三)有关学名的其他知识 1 .属名 是一个表示该微生物主要特征的名词或用作名词的
形容词，单数第一个字母应大写。
号为Ci-1、Ci-7和LCi-40，结果表明3株菌株均为弗氏柠檬酸杆菌
（Citrobacter freundii）；系统发育分析结果表明，3株弗氏柠檬酸 杆菌16S rDNA序列与DSM 30039模式株同源性分别为99.59%、 99.47%和99.53%，且位于系统发育树的同一分支。
关键词：草鱼；弗氏柠檬酸杆菌；致病性；16S rDNA
（1）亲缘关系相近的种，两者的GC比也接近，反之， GC 比相 近的两个种，它们的亲缘关系则不一定都很接近。
（2） GC 比差距很大的两种微生物，亲缘关系必然较远。
（3）GC比是建立新分类单元时的可靠指标： GC比相差低于2%时，没有分类学上的意义；种内各菌株间的差
别在2.5%~4%间；若相差在5%以上时，就可认为属于不同的种，
步骤:
(1)计算两菌株间的相关系数 a+d Ssm= a+b+c+d a Sj= a+b+c
(2)列出相似度矩阵 每两个菌株配对,计算相关系数,填入相似度矩阵 中,按高低重新排列 (3)将矩阵图转化为树状谱 表元或表观群,不能作严格分类单元
（2）列出相似度矩阵
（3）将矩阵图转换成树状图
（二）常用分类方法：
第二节
微生物在生物界的地位
Байду номын сангаас一、生物的界级分类学说
动物界 植物界 林奈
动物界 植物界 原生生 物界 Haeckel
植物界 动物界 原始生 物界 菌界 Copeland
植物界 五界上 动物界 加上病 原核生物界 毒界 原生生物界 真菌界 Whittaker
细菌域 古生菌域 真核生物域 美国 Woese
第十章 微生物的分类和鉴定
微生物分类学
微生物系统学
第一节 通用分类单元
一、7级分类单元
界 门
纲
目
科
属
种
瑞典植物学家林奈（Linneaus） 于1753年创立
二、学名
（一）双名法 指一个物种的学名由前面一个属名和后面一个种名加词两部 分组成 学名=属名+种名加词+（首次定名人）+现名定名人+现名定 名年份 例：大肠埃希氏菌（大肠杆菌） Escherichia coli (Migula) Castellani et Chalmers 1919 ( 二) 三名法 当某种微生物是一个亚种或变种时，学名就按三名法拼写。 学名=属名+种名加词+符号subsp或var+亚种或变种的加词
3、 rRNA寡核苷酸编目分析 一种通过分析原核或真核细胞中最稳定的rRNA寡核苷酸序列同源 性程度，以确定不同生物间的亲缘关系和进化谱系的方法。 是“三域学说”提出的科学根据。 为何说16S rRNA或18SrRNA是“分子进化尺”？ （1）普遍存在于一切细胞内 （2）生理功能既重要又恒定 （3）在细胞中的含量较高、易提取 （4）编码rRNA的基因十分稳定。 （5）序列非常保守 （6）相对分子质量适中
4、微生物全基因组序列测定
（二）细胞化学成分作用鉴定指标
1. 细胞壁的化学成分：肽桥，肽尾 2. 全细胞水解液的糖型（放线菌分类） （1）阿拉伯糖、半乳糖；（2）马杜拉糖 （3）无糖；（4）木糖，阿拉伯糖 3. 磷酸类脂的成分分析 4. 枝菌酸的分析：“诺卡氏菌形放线菌”
5. 醌类的分析（放线菌鉴定）
二、微生物分类鉴定中的现代方法 （一）通过核酸分析鉴定微生物遗传型 1、DNA碱基比例的测定 是指（G+C）mol%值，简称“GC比”，表示DNA分子中鸟 嘌呤G和胞嘧啶C所占的摩尔百分比值 （G+C） mol%=G+C/A+T+G+C *100%
通过（G+C）mol%对微生物进行分类有以下几个特点：
《伯杰氏鉴定细菌学手册》
1923年第一版
1925年第二版 1930年第三版 1934年第四版 1939年第五版
1948年第六版
1957年第七版 1974年第八版 1994年第九版
现书名已改为《伯杰氏系统细菌学手册》 （Bergey’ Mamual of Systematic Bacteriology) 特点：①表型特征 ②基因序列
例2：酿酒酵母椭圆变种 Saccharomyces cerevisiae var．ellipsoideus
（五）菌株(strain)
又称品系（在非细胞型的病毒中则称毒株或株），表示
任何由一个独立分离的单细胞（或单个病毒粒）繁殖而 成的纯遗传型群体及其一切后代。 模式菌株（Type strain)：是一个种的具体活标本，必须是 该菌种的活培养物，是由一个被指定为命名的模式菌株
属的模式
该属中一个具有代表性的种, 即模式种
种名
属名
定种人
年代
种的加词 Specific epithet
Bacillus Bacillus subtilis (Cohn, 1872)
保藏机构 及其保藏号
Type strain: ATCC 6051 =DSM 10 =CCTCC AB 92068
当微生物名称是一个亚种（subspecies，简称 “subsp．”，排正体字）或变种（variety，简称 “var．”，排正体字）时，学名就应按“三名法” 构成，即：
6. 气相色谱：分析代谢产物中脂肪酸和醇类等成分，对厌 氧菌的鉴定十分有用。
（三）数值分类法
200年前由Adanson(植物学家)提出 与电子计算机联系紧密,又称电子计算机分类学
OUT(操作分类单元): 待研究的菌株和有关典型菌 种的菌株
相关系统Ssm(简单匹配相关系统): 以被研究菌株间 共同特征的相关性为基础 特点:至少50个特征,越多越好
生物进行16S和18SrRNA的寡核苷酸测序，并比较其同源性水平后， 提出了一个与以往各种界级分类不同的新系统，称为三域学说。 三个域 是指细菌域、古生菌域和真核生物域。
第三节 微生物的分类系统纲要
1、《伯杰氏手册》 美国的《伯杰氏鉴定细菌学手册》，为各国微生物
分类学界公认的一本经典佳作。
2、前苏联克拉西尔尼可夫的《细菌和放线菌鉴定》 3、法国雷沃A.R.Prevot的《细菌分类学》 4、Ainsworth等人的菌物分类系统纲要：《安.贝氏 菌物词典》第八版（1995年）
芽孢杆菌属：Bacillus 2、种名 种名加词又称种加词，它代表一个物种的次要特征。 字首一律小写，可由形容词或名词组成， 可缩写成B. 或 Bac.
B. subtilis 。
（四）种(species) 种是一个基本分类单元，是一大群表型特征高度 相似、亲缘关系极其接近、与同属内的其他物种 有着明显差异的一大群菌株的总称。 典型菌株(type strain)、模式种(type species)
1. 经典分类法：将形态、结构特征作为初 步特征，再比较生理、生化特征，采用 双歧法整理结果，进行分类。 2. 数值分类法：根据数量特征进行分类， 可根据50~60个或100以上，用电脑进 行计算统计。 3. 遗传分类法：主要依据GC含量及DNA 杂交试样为依据
亲爱的同学们，最后祝你们生 活愉快、学习进步！通过自己 的努力，在微生物学领域有更 多收获!
相差在10%，可认为是不同的属。
测定DNA中GC的方法很多，其中的解链温度法较为常用。
XG+C = (Tm - 69.3)*2.44
2、核酸分子杂交法 按碱基的互补配对原理，用人工方法对两条不同来源的单链核酸 进行复性，以构建新的杂合双链核酸的技术，称为核酸杂交。 包括DNA- DNA、 DNA- rRNA和 rRNA-rRNA分子间的杂交。 一般认为， DNA- DNA杂交同源性超过60%的菌株可以是同种， 同源性超过70%者是同一亚种，而同源性在20%~60%范围内，则 属于同一个属。