第十章 微生物的分类与鉴定(4学时)

一、微生物的分离

（一）稀释平皿分离法 （二）平皿划线分离法 （三）稀释摇管法 （四）单孢挑取法 （五）选择性培养基分离法
（五）选择性培养基分离法
选择性培养基分离法：采用适宜的选择性培养 基能自微生物混杂的基质内分离和鉴定某种微 生物的方法 不同微生物对营养物质和环境因素的要求不同 ：如在不含氮素的Ashby培养基可用于筛选固 氮细菌 不同微生物对不同的化学试剂如消毒剂、染料 、抗生素等具有不同程度的抵抗能力：如加入 青霉素的培养基能抑制大多数革兰氏阳性细菌 的生长

二、微生物的保藏技术
（一）菌种保藏的目的与原理 （二）菌种的保藏方法

（一）菌种保藏的目的与原理
菌种保藏：就是根据微生物菌种特性及保藏目 的的不同，给菌种以特定的条件，使其存活而 得以延续 目的：收集各种研究、教学和生产性菌种；高 质量保藏；可提供交换和使用 基本原理：将菌种保存于不良环境中，如干燥 、低温、缺氧、黑暗、营养饥饿等而使其代谢 速率极为缓慢或处于休眠状态；或将菌种不断 在新鲜培养基上转接传代

一、微生物的分离

（一）稀释平皿分离法 （二）平皿划线分离法 （三）稀释摇管法 （四）单孢挑取法 （五）选择性培养基分离法
（二）平皿划线分离法
平皿划线分离法：倒置琼脂平皿，用无菌接种 环挑取一定量的待分离材料，在培养基表面通 过各种方式的划线而达到分离的目的 这种方法是将微生物样品在固体培养基表面多 次作“由点到面”逐渐稀释，划到最后，常可 以形成单菌落 挑取该单菌落，便可得到纯培养
1~2 年
简便、中期 简便、 中长期
1~10 年
各大类微生物
5~15 年以 繁琐、长期 上
1、国内部分菌种保藏中心
普通微生物菌种保藏管理中心 (CCGMC)：中 科院微生物所，北京 (AS)，真菌、细菌；中科 院武汉病毒研究所，武汉 (AS-IV) ，病毒 工业微生物菌种保藏管理中心 (CICC)：轻工 业部食品发酵工业科学研究所，南京 (ID) ，真 菌 ；卫生部药品生物制品检定所，北京 (NICPBP) ，细菌；中国医学科学院病毒研究 所，北京 (IV) ，病毒
1、种的概念
种（species）：微生物分类的基本单位；是 指以某个“标准菌株”为代表的具有高度特征 相似性的菌株群 菌株（strain）：是单个微生物细胞在人工培 养基上繁殖而来的纯培养物；它是微生物分类 和研究工作中最基本的操作实体 分离物（isolate）：是指已分离到但尚未鉴定 的纯培养物

2、变型的概念


变型（ variety，var.）：是指微生物种以下， 用某些特殊的特征加以区别的类群
血清变型（serovar）：表示抗原结构不同 生物变型（biovar）：表示特殊的生化或生理特征 致病变型（pathovar）：表示某专一致病性 噬菌体变型（phagovar）：表示对噬菌体的特异性反应 形态变型（morphovar）：表示特殊的形态特征

一、微生物的分离

（一）稀释平皿分离法 （二）平皿划线分离法 （三）稀释摇管法 （四）单孢挑取法 （五）选择性培养基分离法
（三）稀释摇管法
稀释摇管法 ：对氧气敏感的厌氧性微生物所采 用的分离方法；将一系列盛无菌琼脂培养基的 试管加热使琼脂熔化后，冷却并保持在50℃左 右，用这些试管进行梯度稀释待分离材料，试 管均匀，冷凝，倾注一层灭菌液体石蜡和固体 石蜡的混合物，将培养基和空气隔开 培养后，菌落形成在琼脂柱的中间，挑取和移 植单菌落
微生物的纯培养
自然环境如土壤和水中，通常栖息着的是许多 不同微生物混杂在一起的群体 要研究微生物生长，首先必须把它从混杂的微 生物类群中分离出来 纯培养（pure culture）：微生物学中将在实验 条件下从一个单细胞繁殖得到的后代

（一）稀释平皿分离法
稀释平皿分离法：将分离样品作一系列的稀释 ，使样品中微生物细胞充分分散，并培养于琼 脂平皿上（内）长出微生物菌落的方法 如果稀释度合适，就可出现分散的单菌落，它 可能就是由一个微生物细胞或同源细胞组成的 微菌落繁殖形成的 挑取该单菌落，便可得到纯培养

4、分子遗传学分类法
分子遗传学分类法：根据遗传学指标（即遗传 机制和生物大分子，如DNA、蛋白质等的组成 ）对微生物进行分类 项目：DNA的G+Cmol%分析、DNA-DNA杂交 、DNA-rRNA杂交、16srRNA或18srRNA碱基 序列分析等

一、微生物的分类
（一）微生物的分类单元 （二）微生物的命名 （三）微生物的分类方法 （四）微生物的分类系统

二、微生物的保藏技术
（一）菌种保藏的目的与原理 （二）菌种的保藏方法

（二）菌种的保藏方法
方法
斜面冰箱 保藏 石蜡油 封藏 砂土管 保藏 冻干管 保藏
原理
低温、 传代 低温、 缺氧 干燥、 无营养 干燥、 无氧 、 无营养
适宜菌种
各大类微生物
保藏时间
3~6 月
特点
短期、简便
各大类微生物 产芽孢或产孢 的微生物
古细菌域
三域六界系统
1978年，美国 C.R.Woese等： 对生物进行16S和 真细菌域 三域学说 18SrRNA的碱基测 真核生物域 序并比较其同源 性，提出了三域六界系统,即古细菌域 (Archaebacteria),仅有古细菌界；真细菌域 (Eubacteria),仅有真细菌界;真核生物域 (Eucaryotes)，包括原生生物界、真菌界、植物界 和动物界

2、化学分类法
化学分类法（chemotaxonomy）：根据微生物 细胞结构或其代谢产物的化学组分分析结果， 对微生物进行分类的方法，可作为微生物分类 的辅助手段 分析方法：血清学检测、气相或液相色谱分析 、质谱分析、凝胶电泳等

3、数值分类法
数值分类法（numerical taxonomy）：根据被 鉴定的微生物与某类群之间的相似性而进行归 类 程序：选择菌株和待测性状→ 性状编码（＋为 1，－为0）→ 菌株间相似性计算→ 聚类分析 （大于85%为同种，大于65%为同属） → 树 状图或矩形图
1753年，瑞典学者Carolus Linnaeus：根据 是具运动性和吞食性还是行固着生活和自养， 提出把生物分为动物界(Animalis)和植物界 (Plantas)
动物界 植物界
原生生物界 三界系统
1860年，德国动物学家Haeckel：建议在动物 界和植物界之外，增加一个由低等生物构成的第 三界---原生生物界(Protista)，包括菌类、低等藻 类、原生动物等
斜体字
正体字（一般省略）
例1.金黄色葡萄球菌 Streptococcus aureus Rosenhach 1884 例2.枯草芽孢杆菌 Bacillu subtilis（Ehrenberg） Cohn 1872
2、三名法
学名=属名+种加词+符号subsp.或var.+亚种或变种加词
斜体字
正体字（一般省略）
斜体字
例1.苏云金芽孢杆菌腊螟亚种 Bacillus thuringiensis subsp. galleria 例2.丁香假单胞烟草致病变种 Pseudomonas syringae pv. tabaci
一、微生物的分类
（一）微生物的分类单元 （二）微生物的命名 （三）微生物的分类方法 （四）微生物的分类系统
第十章 微生物的分类与鉴定 （4学时）
第一节 微生物的纯培养和显微技术（2 学时） 第二节 微生物的分类与鉴定（2学时）
第一节 微生物的纯培养和显微技术
一、微生物的分离 二、微生物的保藏技术 三、微生物的显微技术

一、微生物的分离

（一）稀释平皿分离法 （二）平皿划线分离法 （三）稀释摇管法 （四）单孢挑取法 （五）选择性培养基分离法
动物界 植物界
四界系统
1956年，Copeland：动 物界、植物界、原生生 物界（包括原生动物、 真菌、部分藻类）和原 核生物界(Prokaryota) （包括细菌和蓝细菌）
原生生物界 原核生物界
五界系统 动物界 植物界真菌界 原生生物界 原核生物界 病毒界
1969年，Whittaker：根据 营养方式的不同，认为应 将真菌独立出，而把生物 重新划分为动物界、植物 界、原生生物界、真菌界 (Fungi)和原核生物界 1977年，中国学者陈世骧： 建议在五界系统的基础上， 将病毒(Virus)和类病毒 (Viroids)另立为病毒界， 从而形成了六界系统

（四）微生物的分类系统
惠特克（Whittaker,1969）五界系统：动物界，植 物界，原生生物界，真菌界，原核生物界 沃斯（Woese，1978）三域六界系统：古细菌域 ，仅有古细菌界；真细菌域 ，仅有真细菌界；真 核生物域 ，包括原生生物界、真菌界、植物界和 动物界

动物界 植物界
二界系统

一、微生物的分离

（一）稀释平皿分离法 （二）平皿划线分离法 （三）稀释摇管法 （四）单孢挑取法 （五）选择性培养基分离法
（四）单孢挑取法
单孢挑取法：首先对样品进行充分稀释，用单 孢操作器在解剖显微镜下将一个单独的细胞或 孢子直接挑选而出，接种在培养基上培养，使 之形成单菌落 此法常用于真菌单孢子的分离，需要熟练的技 术

1、普通光学显微镜 2、暗视野显微镜 3、相差显微镜 4、荧光显微镜 5、透射电子显微镜 6、扫描电子显微镜
三、微生物的显微技术
（一）显微镜的种类及原理 （二）微生物的显微技术

（二）微生物的显微技术

1、活体观察 2、染色观察
1、活体观察
活体观察：可采用压滴法、悬滴法及菌丝埋片 法等在明视野、暗视野或相差显微镜下对微生 物活体进行直接观察 应用：可用于专门研究微生物的运动能力、摄 食特性及生长过程中的形态变化，如细胞分裂 、芽孢萌发等动态过程 优点：可以避免一般染色制样时的固定作用对 微生物细胞结构的破坏