PCR简介
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定量PCR技术： 通过对PCR扩增反应 中每一个循环产物 荧光信号的实时检 测从而实现对起始 模板定量及定性的 分析
*普通PCR技术： *对PCR扩增反应
的终产物进行定 量及定性分析
*优点：
目的条带清楚
三个关键词：
实时，定量，荧光
*
3 荧光定量PCR结果分析
实验结果包含：
1、操作步骤
2、扩增曲线
标本分类 组织 样本量 一般100mg（黄豆大小），最少也 结缔组织，纤维化组织适当增加 细胞 1×106个细胞，贴壁细胞舒展，未 变圆；悬浮细胞形态完整，透亮 血液 收集方法 新鲜组织立即放人液氮或Trizol -80℃储存 带培养基常温运输，或者提供 细胞沉淀 须50mg（绿豆大小），脂肪组织， 中,冰冻的组织块可直接可移至
荧光定量PCR重要名词之融解 曲线
2.4 琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖为链状多糖——分离、鉴定、纯化DNA DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场
作用下向正极泳动。DNA分子的迁移速度与相对 分子质量的对数成正比。
对PCR终产物进行分析确定条带的大小，条带是 否单一
电泳仪器及电泳图片
定量与普通PCR的差别
目的基因有的标本扩增的出 目的片段在有些模板中表达 来，有的标本扩增不出来 量低或无表达
同一批标本内参差异很大
*1、逆转录时RNA模板的质量为1ug，我们测定的
是总RNA的含量，mRNA的质量可能会有所差别；
*2、每组样品中，只要和内参比较，那么加入的
cDNA的量是不重要的，但是要保证每次一致。
5 PCR标本要求
2．按照管壁上的nmol数加入10倍体积的无菌水稀释成100nmol/mL； 3．各取上游引物（***-S）7.5 uL，下游引物7.5 uL加入到85 uL无菌 水中稀释成7.5 nmol/mL；
荧光定量PCR原理
荧光定量PCR重要名词之扩增 曲线，循环阈值
循环阈值
循环阈值与RNA的浓度成反比，循环阈值越低表明RNA的含量 越高。我们一般通过内参基因的Ct值来判断RNA的浓度，Ct 值越低RNA浓度越高。
*RNA浓度＝OD260×稀释倍数×0.04ug/ul
RNA电泳图
完整的未降解的RNA制品的电泳图谱应可 清晰看到18s rRNA、28s rRNA、5s rRNA的 三条带，且28s rRNA的亮度应为18s rRNA 的两倍。
2.2 mRNA逆转录，cDNA合成
2.3 PCR基本原理及步骤
Leabharlann Baidu
普通PCR电泳图如何看
目的基因star PCR扩增产物的 片段长度大小为 187bp,电泳的条 带也在187bp左 右，表明扩增产 物是我们的目的 条带，并且没有 非特异性条带， 无引物二聚体。
目的条带清晰无杂带
内参基因和目的基因的扩增产物跑在一张电泳图上
actin MCH1
拖带
引物的特异性不好，有太多的拖带，需要重新设计引物
microRNA 小分子3 RNA
NcRNA 非编码RNA
*DNA分布功能
DNA分子的功能是贮存决定物种的所有蛋白质和RNA结 构的全部遗传信息；策划生物有次序地合成细胞和组 织组分的时间和空间；确定生物生命周期自始至终的 活性和确定生物的个性。除染色体DNA外，有极少量结 构不同的DNA存在于真核细胞的线粒体和叶绿体中。 DNA病毒的遗传物质也是DNA。
杂带
引物二聚体
引物的特异性不好，有引物二聚体，需要重新设计引物
4 常见问题与解析
无扩增产物的可能原因
出现问题
RNA浓度<100ng/uL, OD260/OD280<1.8
可能原因
RNA降解
RNA浓度和纯度正常，内参 标本种属错误 扩增不出来 内参没有问题，目的基因扩 可能是引物设计不当或引物 增不出来 降解，重新设计或重新配制 引物
3、数据分析：原始数据+数据分析
4、引物信息
循环阈值在33以内，并且重复好（Ct值相差
一个循环以内），结果可用
循环阈值相差太大，结果不可靠
相对定量表达PCR计算方法
假设目的基因与看家基因扩增效率相同，数学推导得出
目的基因的量=2-ΔΔCt
ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct管家基因)实验组-(Ct目的基因-Ct管家基因)
PCR简介
内容提要：
*一.PCR检测对象 *二.实验步骤 *1.RAN提取步骤及浓度纯度测定 *2.RNA逆转录cDNA合成 *3.PCR原理，步骤及几个重要名词 *4.琼脂糖凝胶电泳 *三.PCR结果分析 *四.常见问题与解析 *五. PCR标本要求
1 PCR检测对象
*
遗传信息的传递：
复 制 tRNA & rRNA
PCR反应的基本成分：模 板DNA、特异性引物、热 稳定DNA聚合酶、脱氧核 苷三磷酸（dNTP）、Mg2+ 等。 基本反应步骤：变性-退火--延伸，最后通过染 料，如EB染色DNA后在紫 外灯下显色检出
10
引物稀释方法
1．引物附在离心管内壁上，稀释前请将引物离心数秒使DNA聚集至 管底，小心开启管盖，以免引起粉末飞扬造成DNA损失；
2mL,最少1mL新鲜血液
EDTA抗凝血可以放于4度2-5天， 最好是尽快用红细胞裂解液分 离，充分去除红细胞，保留有 核细胞，然后加入trizol放入
-80度保存
mRNA的功能
*2.1 RNA提取步骤
RNA提取液 （谷歌）匀浆 标本
氯仿·异丙醇 抽提RNA离心
酒精沉淀， RNA溶解
RNA浓度测定
*OD230，260，280分别是盐浓度、核酸、蛋白
质等有机物和背景（溶液混浊度）的吸光度值
OD260/OD280 1.8～2.0之间 <1.8 >2.2 RNA纯度 RNA质量比较好 蛋白质等有机物污染 RNA被水解成了单核苷酸
对照
2-ΔΔCt表示的是实验组目的基因的表达相对于对照组的
变化倍数
预实验结果怎么看
这个标本的内 参起的有些晚， 但也可以做。 IL-23这对引物 可以扩增，IL17和TGFB1没有 扩增出来需要 重新设计引物， IL-23扩增的有 些晚，最好重 新设计引物。
内参基因的 CT值太高， 目的基因没 有扩增出来， 说明RNA的 浓度太低， 需要重新换 标本提RNA。
*普通PCR技术： *对PCR扩增反应
的终产物进行定 量及定性分析
*优点：
目的条带清楚
三个关键词：
实时，定量，荧光
*
3 荧光定量PCR结果分析
实验结果包含：
1、操作步骤
2、扩增曲线
标本分类 组织 样本量 一般100mg（黄豆大小），最少也 结缔组织，纤维化组织适当增加 细胞 1×106个细胞，贴壁细胞舒展，未 变圆；悬浮细胞形态完整，透亮 血液 收集方法 新鲜组织立即放人液氮或Trizol -80℃储存 带培养基常温运输，或者提供 细胞沉淀 须50mg（绿豆大小），脂肪组织， 中,冰冻的组织块可直接可移至
荧光定量PCR重要名词之融解 曲线
2.4 琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖为链状多糖——分离、鉴定、纯化DNA DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场
作用下向正极泳动。DNA分子的迁移速度与相对 分子质量的对数成正比。
对PCR终产物进行分析确定条带的大小，条带是 否单一
电泳仪器及电泳图片
定量与普通PCR的差别
目的基因有的标本扩增的出 目的片段在有些模板中表达 来，有的标本扩增不出来 量低或无表达
同一批标本内参差异很大
*1、逆转录时RNA模板的质量为1ug，我们测定的
是总RNA的含量，mRNA的质量可能会有所差别；
*2、每组样品中，只要和内参比较，那么加入的
cDNA的量是不重要的，但是要保证每次一致。
5 PCR标本要求
2．按照管壁上的nmol数加入10倍体积的无菌水稀释成100nmol/mL； 3．各取上游引物（***-S）7.5 uL，下游引物7.5 uL加入到85 uL无菌 水中稀释成7.5 nmol/mL；
荧光定量PCR原理
荧光定量PCR重要名词之扩增 曲线，循环阈值
循环阈值
循环阈值与RNA的浓度成反比，循环阈值越低表明RNA的含量 越高。我们一般通过内参基因的Ct值来判断RNA的浓度，Ct 值越低RNA浓度越高。
*RNA浓度＝OD260×稀释倍数×0.04ug/ul
RNA电泳图
完整的未降解的RNA制品的电泳图谱应可 清晰看到18s rRNA、28s rRNA、5s rRNA的 三条带，且28s rRNA的亮度应为18s rRNA 的两倍。
2.2 mRNA逆转录，cDNA合成
2.3 PCR基本原理及步骤
Leabharlann Baidu
普通PCR电泳图如何看
目的基因star PCR扩增产物的 片段长度大小为 187bp,电泳的条 带也在187bp左 右，表明扩增产 物是我们的目的 条带，并且没有 非特异性条带， 无引物二聚体。
目的条带清晰无杂带
内参基因和目的基因的扩增产物跑在一张电泳图上
actin MCH1
拖带
引物的特异性不好，有太多的拖带，需要重新设计引物
microRNA 小分子3 RNA
NcRNA 非编码RNA
*DNA分布功能
DNA分子的功能是贮存决定物种的所有蛋白质和RNA结 构的全部遗传信息；策划生物有次序地合成细胞和组 织组分的时间和空间；确定生物生命周期自始至终的 活性和确定生物的个性。除染色体DNA外，有极少量结 构不同的DNA存在于真核细胞的线粒体和叶绿体中。 DNA病毒的遗传物质也是DNA。
杂带
引物二聚体
引物的特异性不好，有引物二聚体，需要重新设计引物
4 常见问题与解析
无扩增产物的可能原因
出现问题
RNA浓度<100ng/uL, OD260/OD280<1.8
可能原因
RNA降解
RNA浓度和纯度正常，内参 标本种属错误 扩增不出来 内参没有问题，目的基因扩 可能是引物设计不当或引物 增不出来 降解，重新设计或重新配制 引物
3、数据分析：原始数据+数据分析
4、引物信息
循环阈值在33以内，并且重复好（Ct值相差
一个循环以内），结果可用
循环阈值相差太大，结果不可靠
相对定量表达PCR计算方法
假设目的基因与看家基因扩增效率相同，数学推导得出
目的基因的量=2-ΔΔCt
ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct管家基因)实验组-(Ct目的基因-Ct管家基因)
PCR简介
内容提要：
*一.PCR检测对象 *二.实验步骤 *1.RAN提取步骤及浓度纯度测定 *2.RNA逆转录cDNA合成 *3.PCR原理，步骤及几个重要名词 *4.琼脂糖凝胶电泳 *三.PCR结果分析 *四.常见问题与解析 *五. PCR标本要求
1 PCR检测对象
*
遗传信息的传递：
复 制 tRNA & rRNA
PCR反应的基本成分：模 板DNA、特异性引物、热 稳定DNA聚合酶、脱氧核 苷三磷酸（dNTP）、Mg2+ 等。 基本反应步骤：变性-退火--延伸，最后通过染 料，如EB染色DNA后在紫 外灯下显色检出
10
引物稀释方法
1．引物附在离心管内壁上，稀释前请将引物离心数秒使DNA聚集至 管底，小心开启管盖，以免引起粉末飞扬造成DNA损失；
2mL,最少1mL新鲜血液
EDTA抗凝血可以放于4度2-5天， 最好是尽快用红细胞裂解液分 离，充分去除红细胞，保留有 核细胞，然后加入trizol放入
-80度保存
mRNA的功能
*2.1 RNA提取步骤
RNA提取液 （谷歌）匀浆 标本
氯仿·异丙醇 抽提RNA离心
酒精沉淀， RNA溶解
RNA浓度测定
*OD230，260，280分别是盐浓度、核酸、蛋白
质等有机物和背景（溶液混浊度）的吸光度值
OD260/OD280 1.8～2.0之间 <1.8 >2.2 RNA纯度 RNA质量比较好 蛋白质等有机物污染 RNA被水解成了单核苷酸
对照
2-ΔΔCt表示的是实验组目的基因的表达相对于对照组的
变化倍数
预实验结果怎么看
这个标本的内 参起的有些晚， 但也可以做。 IL-23这对引物 可以扩增，IL17和TGFB1没有 扩增出来需要 重新设计引物， IL-23扩增的有 些晚，最好重 新设计引物。
内参基因的 CT值太高， 目的基因没 有扩增出来， 说明RNA的 浓度太低， 需要重新换 标本提RNA。