第十四章 真菌检验技术.pptx
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3.采集的标本量要足
血液和脑脊液标本5ml，胸腔液20ml，皮屑标本两块，活体组织两 份（一份送病理科检查, 一份做镜检和培养）。
4.严格无菌操作
严格无菌操作，消毒处理，尤其是在采集血液和脑脊液标本时，要 避免污染杂菌。
5.采集的标本立即送检
对采集的标本应立即送检，特别是深部真菌标本最长不得超过2h。
脑心浸液琼脂（BHI）、沙比培养基，并在培养基中加人氯霉素、庆大霉素、四环素 等，以抑制霉菌生长，双相真菌可在该培养基上呈酵母相。
二、培养方法
培养方法有平皿培养、大试管培养和玻片培养等。 平皿培养的优点：
表面较大，可使标本散布，便于观察菌落形态，但水分易蒸发，只 能培养生长繁殖较快的真菌，如假丝酵母菌、隐球菌。
病性真菌有时使培养基开裂，污染霉菌很少引起培养 基开裂。
第三节 真菌的其他鉴定方法
一、生化反应
1.糖（醇）类发酵试验
常用的糖有单糖（葡萄糖、果糖、半乳糖〉、双糖（麦芽糖、蔗糖、 乳糖、海藻糖〉、三糖（蜜三糖）、多糖（淀粉）、醇类有甘油、 甘露醇、山梨醇、肌醇等。
2.同化碳源试验
将1ml含菌生理盐水与已融化的固体同化碳源培养基（45度）混合， 然后在培养基上分别加人各种糖少许，置25或37度孵育后观察结 果。若24小时后无变化可重复加糖少许。如能同化，在加入糖的周 围有生长圈，否则无生长。固体平板培养基适用于生长快的真菌， 而液体培养基则适合于生长慢的真菌，同化慢的糖类（如半乳糖）， 若同化，则培养基浑浊。
3.同化氮源试验或利用硝酸钾试验
方法与同百度文库碳源试验相同，但需用无氮源的培养基，不要加糖类， 而加入硝酸钾。牛乳分解试验、脲酶试验等同细菌操作
二、免疫学检查
1. 皮肤试验 2. 血清学试验
三、其他鉴定诊断实验
1.厚膜孢子形成试验
白假丝酵母菌接种在玉米吐温80琼脂。25℃，72h内观察丰富的假 菌丝。
大试管培养的优点：
水分不易蒸发，主要用于皮肤癣菌的培养和真菌菌种的保存。
玻片培养（微量培养、小培养）
将培养皿的真菌培养基切成一个1cm*1cm的小方块，置无菌玻片 中央，将真菌点种于培养基的一侧，再盖上无菌盖玻片后培养，培 养后将其盖玻片放人另一载玻片上观察菌丝和孢子，可鉴定菌种。
多数真菌培养的温度为28度，深部真菌为37度。 二相性真菌培养：
（三）真菌鉴定程序
二、直接镜检
镜检阳性，可初步判定真菌感染，但多不能确 定种类
镜检阴性，不轻易否定真菌感染的可能，进一 步检查
1.标本制备
标本置玻片 上
标本处理液
加标本处理 液
KOH
生理盐水
加盖玻片镜 检
促进角质蛋白溶解 皮屑10%、毛发20%， 标本长时间保存可加
入10%甘油
观察真菌出芽现象
28度培养真菌呈菌丝相（霉菌型） 37度培养为组织相（酵母型）。
现察菌落生长情况是鉴别真菌的主要方法之一。
三、生长现象
观察菌落形态时注意以下几点：
①菌落性质，是酵母菌还是霉菌； ②菌落大小，一般病原性真菌菌落小，而条件致病性
真菌菌落大； ③菌落颜色， 一般病原性真菌颜色淡，污染真菌颜
色深； ④致病性真菌菌落下沉，污染性真菌菌落不下沉；致
第十四章 真菌检验技 术
真菌学实验注意事项
1.真菌的检验操作应在生物安全柜内进行。 2.每天工作前后要对工作区域进行消毒。 3.不可试着闻平板上培养物产生的气味。 4.不可对组织胞浆菌、球孢子菌进行玻片培养，
以防其孢子在空气中弥散。
第一节 真菌形态检验技术
标本采集
直接镜检
真菌形态检 验技术
染色镜检 分离培养
菌的培养。隐球菌对这两种药物敏感.应避免使用，以防假阴性结果的发生， 许多病原性真菌如白假丝酵母菌在血琼脂上生长良好。 玉米吐温80琼脂，用于观察白念珠菌厚壁孢子及假菌丝；红色毛癣菌在此 培养基产色素较好。 马铃薯葡萄糖琼脂（PDA），是培养真菌较好的培养基，同时也是鉴定真 菌较好的培养基之一。鉴定皮肤癣菌一般不用此培养基。 尿素培养基，生化反应鉴别培养基，用于鉴定须癣毛癣菌和隐球菌，可使 橘红色培养基变成紫红色。 二相性真菌常使用营养更丰富：
水合氯醛-苯酚-乳酸 封固液
透明力较强，限于不 透明标本的检查
2.显微镜检查
可观察真菌菌丝和孢子 低倍镜下弱光观察，再用高倍检查其特征
三、染色镜检
染色镜检
革兰染色 乳酸酚棉蓝
染色 墨汁染色
荧光染色
糖原染色
均为革兰阳 性
吖啶橙染色 常用方法， 病理检查用
第二节 真菌培养技术
最适PH4.0〜6.0 沙保弱培养基（SDA琼脂，葡萄糖蛋白胨琼脂），一般细菌不易生长。 也可加入氯霉素或放线菌酮，可防止细菌和污染真菌生长，多用于皮肤癣
8.阴道及宫颈分泌物
用拭子采集两份，一份制片检查，一份作分离培养。
（二）采集标本注意事项
1.采集的标本要适宜
不同真菌感染应采取不同的临床标本。怀疑为浅部真菌感染，应刮 取病变边缘的痂、皮屑，发癣应取折断了的病发。怀疑为深部真菌 感染应取血液、脑脊液、痰、脓汁等。
2.在用药前采集标本
须在用药前采集，对已用药者需停药一段时间后再采集标本。
3.口腔粘膜
用无菌棉拭，于口腔或咽部的白色点状或小片处取材
4.脓汁及渗出物
未破损者用注射器抽取，破损者取痂皮下较深处脓液。
5.痰
晨痰，先漱口再深咳，用无菌器皿收集。
6.血液和体液
血液5~10ml抗凝于培养瓶，CSF5ml送检，胸水少于20ml，离心沉淀。
7.粪便和尿液
粪便置无菌小盒，尿液取清洁留尿或导尿标本于无菌试管。
生化反应
免疫学试验
一、标本的采集和处理
1.毛发
取根部折断，脏而松动或有病损部位的毛发，将病毛置无菌平皿内送检。
2.皮屑
先用70%酒精消毒后，手术刀轻轻刮取，皮肤选择病损的活动边缘，手癣 取虎口处，足癣取第4、5趾间，花斑癣取表浅皮屑。婴儿皮肤或粘膜处菲 薄的皮肤可用浸有生理盐水的棉拭子轻轻擦取。
镜下：假菌丝中隔部有成簇圆形分生孢子，菌丝顶端有厚膜 孢子。
2.芽管形成试验
0.2ml血清加少量真菌，37 ℃，每隔1h用接种环取样检查，共三次， 白假丝酵母菌孢子长出短小芽管。
3.动物接种 4.病理组织检查 5.核酸检测 6.真菌毒素检测
血液和脑脊液标本5ml，胸腔液20ml，皮屑标本两块，活体组织两 份（一份送病理科检查, 一份做镜检和培养）。
4.严格无菌操作
严格无菌操作，消毒处理，尤其是在采集血液和脑脊液标本时，要 避免污染杂菌。
5.采集的标本立即送检
对采集的标本应立即送检，特别是深部真菌标本最长不得超过2h。
脑心浸液琼脂（BHI）、沙比培养基，并在培养基中加人氯霉素、庆大霉素、四环素 等，以抑制霉菌生长，双相真菌可在该培养基上呈酵母相。
二、培养方法
培养方法有平皿培养、大试管培养和玻片培养等。 平皿培养的优点：
表面较大，可使标本散布，便于观察菌落形态，但水分易蒸发，只 能培养生长繁殖较快的真菌，如假丝酵母菌、隐球菌。
病性真菌有时使培养基开裂，污染霉菌很少引起培养 基开裂。
第三节 真菌的其他鉴定方法
一、生化反应
1.糖（醇）类发酵试验
常用的糖有单糖（葡萄糖、果糖、半乳糖〉、双糖（麦芽糖、蔗糖、 乳糖、海藻糖〉、三糖（蜜三糖）、多糖（淀粉）、醇类有甘油、 甘露醇、山梨醇、肌醇等。
2.同化碳源试验
将1ml含菌生理盐水与已融化的固体同化碳源培养基（45度）混合， 然后在培养基上分别加人各种糖少许，置25或37度孵育后观察结 果。若24小时后无变化可重复加糖少许。如能同化，在加入糖的周 围有生长圈，否则无生长。固体平板培养基适用于生长快的真菌， 而液体培养基则适合于生长慢的真菌，同化慢的糖类（如半乳糖）， 若同化，则培养基浑浊。
3.同化氮源试验或利用硝酸钾试验
方法与同百度文库碳源试验相同，但需用无氮源的培养基，不要加糖类， 而加入硝酸钾。牛乳分解试验、脲酶试验等同细菌操作
二、免疫学检查
1. 皮肤试验 2. 血清学试验
三、其他鉴定诊断实验
1.厚膜孢子形成试验
白假丝酵母菌接种在玉米吐温80琼脂。25℃，72h内观察丰富的假 菌丝。
大试管培养的优点：
水分不易蒸发，主要用于皮肤癣菌的培养和真菌菌种的保存。
玻片培养（微量培养、小培养）
将培养皿的真菌培养基切成一个1cm*1cm的小方块，置无菌玻片 中央，将真菌点种于培养基的一侧，再盖上无菌盖玻片后培养，培 养后将其盖玻片放人另一载玻片上观察菌丝和孢子，可鉴定菌种。
多数真菌培养的温度为28度，深部真菌为37度。 二相性真菌培养：
（三）真菌鉴定程序
二、直接镜检
镜检阳性，可初步判定真菌感染，但多不能确 定种类
镜检阴性，不轻易否定真菌感染的可能，进一 步检查
1.标本制备
标本置玻片 上
标本处理液
加标本处理 液
KOH
生理盐水
加盖玻片镜 检
促进角质蛋白溶解 皮屑10%、毛发20%， 标本长时间保存可加
入10%甘油
观察真菌出芽现象
28度培养真菌呈菌丝相（霉菌型） 37度培养为组织相（酵母型）。
现察菌落生长情况是鉴别真菌的主要方法之一。
三、生长现象
观察菌落形态时注意以下几点：
①菌落性质，是酵母菌还是霉菌； ②菌落大小，一般病原性真菌菌落小，而条件致病性
真菌菌落大； ③菌落颜色， 一般病原性真菌颜色淡，污染真菌颜
色深； ④致病性真菌菌落下沉，污染性真菌菌落不下沉；致
第十四章 真菌检验技 术
真菌学实验注意事项
1.真菌的检验操作应在生物安全柜内进行。 2.每天工作前后要对工作区域进行消毒。 3.不可试着闻平板上培养物产生的气味。 4.不可对组织胞浆菌、球孢子菌进行玻片培养，
以防其孢子在空气中弥散。
第一节 真菌形态检验技术
标本采集
直接镜检
真菌形态检 验技术
染色镜检 分离培养
菌的培养。隐球菌对这两种药物敏感.应避免使用，以防假阴性结果的发生， 许多病原性真菌如白假丝酵母菌在血琼脂上生长良好。 玉米吐温80琼脂，用于观察白念珠菌厚壁孢子及假菌丝；红色毛癣菌在此 培养基产色素较好。 马铃薯葡萄糖琼脂（PDA），是培养真菌较好的培养基，同时也是鉴定真 菌较好的培养基之一。鉴定皮肤癣菌一般不用此培养基。 尿素培养基，生化反应鉴别培养基，用于鉴定须癣毛癣菌和隐球菌，可使 橘红色培养基变成紫红色。 二相性真菌常使用营养更丰富：
水合氯醛-苯酚-乳酸 封固液
透明力较强，限于不 透明标本的检查
2.显微镜检查
可观察真菌菌丝和孢子 低倍镜下弱光观察，再用高倍检查其特征
三、染色镜检
染色镜检
革兰染色 乳酸酚棉蓝
染色 墨汁染色
荧光染色
糖原染色
均为革兰阳 性
吖啶橙染色 常用方法， 病理检查用
第二节 真菌培养技术
最适PH4.0〜6.0 沙保弱培养基（SDA琼脂，葡萄糖蛋白胨琼脂），一般细菌不易生长。 也可加入氯霉素或放线菌酮，可防止细菌和污染真菌生长，多用于皮肤癣
8.阴道及宫颈分泌物
用拭子采集两份，一份制片检查，一份作分离培养。
（二）采集标本注意事项
1.采集的标本要适宜
不同真菌感染应采取不同的临床标本。怀疑为浅部真菌感染，应刮 取病变边缘的痂、皮屑，发癣应取折断了的病发。怀疑为深部真菌 感染应取血液、脑脊液、痰、脓汁等。
2.在用药前采集标本
须在用药前采集，对已用药者需停药一段时间后再采集标本。
3.口腔粘膜
用无菌棉拭，于口腔或咽部的白色点状或小片处取材
4.脓汁及渗出物
未破损者用注射器抽取，破损者取痂皮下较深处脓液。
5.痰
晨痰，先漱口再深咳，用无菌器皿收集。
6.血液和体液
血液5~10ml抗凝于培养瓶，CSF5ml送检，胸水少于20ml，离心沉淀。
7.粪便和尿液
粪便置无菌小盒，尿液取清洁留尿或导尿标本于无菌试管。
生化反应
免疫学试验
一、标本的采集和处理
1.毛发
取根部折断，脏而松动或有病损部位的毛发，将病毛置无菌平皿内送检。
2.皮屑
先用70%酒精消毒后，手术刀轻轻刮取，皮肤选择病损的活动边缘，手癣 取虎口处，足癣取第4、5趾间，花斑癣取表浅皮屑。婴儿皮肤或粘膜处菲 薄的皮肤可用浸有生理盐水的棉拭子轻轻擦取。
镜下：假菌丝中隔部有成簇圆形分生孢子，菌丝顶端有厚膜 孢子。
2.芽管形成试验
0.2ml血清加少量真菌，37 ℃，每隔1h用接种环取样检查，共三次， 白假丝酵母菌孢子长出短小芽管。
3.动物接种 4.病理组织检查 5.核酸检测 6.真菌毒素检测