实验八、卵母细胞的体外培养

实验八、卵母细胞的体外培养
一、实验目的
了解卵母细胞体外培养操作要领，掌握卵母细胞体外培养的方法。

二、实验材料
1、卵巢、冷冻精液、M199培养液、血清、促性腺激素、雌激素、石蜡油、A23187、1%BSA、Tyrode’s改良液。

2、器械：培养皿、15ml试管、胶塞、注射针头、培养箱、吸管、离心管。

三、实验内容
（一）卵母细胞的获得
从屠宰场废弃卵巢中抽取卵母细胞已为大多研究者所接受。

真空泵法是一种有效的猪卵母细胞采集方法。

手动抽吸法在卵母细胞的成熟率方面优于真空泵法。

应用乙醚、乌拉糖、846麻醉药（耳静脉注射只）等麻醉后，再按外科手术要求打开腹腔。

将母兔背朝下方固定于兔手术台上。

在兔腹部最后两对乳头的腹中线部剪毛，用沾满肥皂液的纱布清洗局部，再用剃须刀片刮毛，先后用碘酒和酒精棉球由内向外进行消毒。

然后盖上创巾并固定。

用手术刀在腹部正中线处皮肤切开2～3cm长的术口，再在腹壁肌白线上切一小口，用中指垫着以手术剪来扩大剪口。

打开腹腔后，沿着子宫轻轻引出输卵管及卵巢。

与卵巢下脂肪组织处，用长夹夹住以固定卵巢。

仔细观察卵巢的变化。

记录排卵点（卵巢排过卵后的小红点）。

先在卵巢上找到卵泡，用手指固定卵巢，用10ml注射器配上9号针头，吸一些冲卵液（也可用生理盐水代替）,把针头插入卵泡中吸去取卵母细胞。

从卵巢中获得的卵母细胞为什么通常是未成熟：因为卵细胞形成过程中的减数第二次分裂是在精卵结合过程中完成的，所以只有完成受精后卵细胞才是成熟的，当然也已经完成受精了。

人工获取的卵细胞一般都是只完成了减数第一次分裂。

卵母细胞受精过程
卵母细胞(oocyte)：在卵子发生过程中进行减数分裂的卵原细胞。

分为初级卵母细胞、次级卵母细胞和成熟的卵母细胞，它们分别是卵原细胞分化和DNA复制分裂后产生、第一次减数分裂和第二次减数分裂的产物。

（二）卵母细胞的体外培养
1、培养液的准备
用于卵母细胞体外成熟的基础培养液应用最广泛的是M199。

使用时需添加一定浓度的血清、促性腺激素和雌激素等。

2、培养方法
卵母细胞体外培养一般采用微滴法、封闭法和开放法三种。

（1）微滴法先将成熟培养液在组织培养皿中做成50—100μl的微滴并覆盖石蜡油，然后将5—10枚卵母细胞放入其中培养。

如培养单个卵母细胞，则制备10μl的微滴。

此法适用于多组对比试验，或来源于不同母畜的卵母细胞的分别培养等。

（2）封闭法先将卵母细胞放入盛有2—3μl成熟培养液的15μl试管中，用胶塞密封试管口并在胶塞上插入一注射针头，然后从针头充入含有5% CO2的空气，充气完毕后将针头拔出。

（3）开放法先将1—2μl成熟培养液放入培养皿中，然后将含有卵母细胞的表面皿置于恒温的含有5%CO2空气的培养箱中培养。

牛、猪、羊和马等家畜的卵母细胞体外成熟培养的温度一般为38—39℃，人和齿类动物为37℃。

所有哺乳动物卵母细胞体外成熟培养的气相一般要求在含5%CO2的空气和最大湿度的环境。

牛和羊卵母细胞体外成熟培养的时间一般为22—24h，而马为30—36h，。

猪为40—44h。

（三）观察步骤
将盛有卵子保存液的表面皿置10倍镜下检查，找到卵子后用吸管（先将吸管挤出少量气体后，对准卵子吸入）吸取卵子，放入凹载玻片的凹窝内，用钢笔在载玻片背面将卵子划一圆圈，置100倍显微镜下，观察卵子的形态，或在变倍显微镜下直接观察。

1、观察正常卵子形态
动物的卵子多呈圆球形，内含有一个球形核，核内有1—2个核仁，细胞质含量丰富，其中贮存有卵物质，和一般生物细胞一样也含有线粒体和内网器，细胞膜很薄，通常称为卵黄膜。

动物的卵子，卵黄含量较少且分布均匀，故属少黄均质卵黄，排出卵子的大小，直径变动在80-200µm之间，如马为120—180µm，牛为120—160µm，绵羊为140—185µm，猪为120—170µm，实验动物海豚鼠为87—107µm，兔为110—146µm。

因动物种类不同，卵细胞质内所含卵黄素颗粒和脂滴的量不同，因此卵的外观也有差异。

如山羊、绵羊、兔的卵子卵黄颗粒细，分布均匀，脂滴含量少，因而细胞较明亮，而马、牛和猪的卵子所含脂滴量多，其折光性强，因而细胞质呈黑块状，但也有人认为牛的脂滴含量不多，卵细胞质不如马和猪的深。

动物新排出的卵子，在卵黄膜外，还具有透明带和放射冠两种结构。

透明带由卵泡上皮分泌而来，包在卵黄膜外，卵在进行第一次成熟分裂之后，排出第一极体，卵细胞质收缩，于是在卵黄膜和透明带之间出现了一个很小的裂隙，称卵周隙或围卵腔，如卵继续进行第二次成熟分裂，则排出第二极体，两者均存在于卵周隙中。

细胞质进一步收缩，卵黄周隙就进一步扩大。

透明带是一种透明、均质的半透性膜。

属粘多糖蛋白，含有透明质酸，它有弹性，用针很难刺入。

卵子受精后，在卵裂、桑椹胎和囊胚早期，透明带明显，它可作为输送营养的通路，并对卵子和幼嫩的早期胚胎有保护的功能。

故胚胎移植时要求透明带必须是完整无损的。

不同动物的卵子透明带的的厚度也不同，牛为12—15μm，兔卵在透明带外。

鼠类及猫、狗等动物，可见有发达的放射冠，而马、牛、羊、猪等动物在排卵后不久，放射冠即消失，也有报导牛在排卵后9—14小时之内放射冠即脱落。

猪在诱发排卵时，受精之后透明带仍继续存在。

2、受精卵的鉴别
不同的动物，从卵巢中排出的卵子成熟程度不同，马、驴和狗，在第一次成熟分裂没有完成时排出。

牛、绵羊、山羊和猪则在第二次成熟分裂的中期排出。

第一极体大多消失早，排卵后即已不见，如果受精卵最后完成成熟，放出第二极体。

在胚胎移殖技术中鉴别卵子是否受精是决定着移植成功的第一关键，有两个标准可供参考，一是第二极体的出现（但有人报道冷刺激可使非受精卵排出第二极体）；二是卵周隙的扩大，从实践中来看，两个标准不甚明显，特别是第二极体不易见到，并难于与第一极体相区别。

另外，如果卵未受精，则卵子细胞质碎裂为许多（2—20）大小不同的碎块，每一块中含有核的碎块。

有时这种碎裂的卵子与受精卵的正常卵裂十分相似，这时要和同一批卵相比较，否则难于正确判断。

3、畸型的未受精卵和受精卵
由于卵细胞成熟过程不正常或异常环境因素的影响，而发生畸型卵如小卵、巨卵、椭圆卵、扁形卵、透明带破裂，带有大极体或细胞质内有大空泡等。

这些卵均不适宜作移植用。

四、作业
描绘卵母细胞的形态、结构，描述卵
母细胞的获得的过程。