细胞生物学,细胞培养

七、实验总结
本次实验为综合性实验，用时较长，过程也比较复杂，在老师的指导下经过四次实验课完成了对人体淋巴细胞株的体外培养，在整个实验过程中实际操作步骤多，经过分解复杂的实验步骤后，我们每次的实验课完成的步骤相对较简单，但是同样需要认真谨慎，小组内每个成员都需要积极参与进去。
因为进行细胞体外培养本身需要严格的条件，在配制培养基、吸取原细胞培养液等操作需要在超净工作台内进行，所以要注意各种仪器及手的消毒，内部的操作都需要在酒精灯前进行。
（二）、培养基的配制
1.细胞培养使用的培养基一般是由合成培养基和小牛血清配制而成。合成培养基是根据细胞生长的需要按一定配方制成的粉状物质。其主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子和其他辅助物质。它的酸碱度和渗透压与活体内细胞外液相似。
2、小牛血清含有一定的营养成分，更重要的是它含有细胞生长所必需的生长因子；酶、微量元素和激素；保护作用；提供伸展和贴附因子等，是合成培养基所无法替代的。此外它还能中和有毒物质（重金属、抗菌素）的毒性。
2.悬浮型细胞培养常见于淋巴细胞、白血病细胞、骨髓瘤细胞和腹水型恶性细胞等的培养。由于这类细胞或细胞集体可悬浮在液体培养基中，而不附着在固体表面上，因此无论原代培养或传代培养的细胞增殖过程都没有贴附性细胞那种明显可辨的3个变化阶段，其培养的可见效果是细胞数目的增多及溶液中细胞浓度和密度的加大。
（四）、死活细胞的鉴别
1.清洗与消毒是组织培养实验的第一步，是组织培养中工作量最大，也是最基本的步骤。
2.体外培养细胞所使用的各种玻璃或塑料器皿对清洁和无菌操作的要求程度很高。细胞培养不好与清洗不彻底有很大关系。
3.灭菌手段的选择也十分重要，对不同的物品需采用不同的灭菌方法。假如选用的方法不对，即使达到了无菌却使被灭菌药品丧失了营养价值、生物学特性或其他使用价值也不行。
3.氨基酸是组成蛋白质的基本单位。不同种类的细胞对氨基酸的要求各异，但有几种氨基酸细胞自身不能合成，必须依靠培养基提供，这几种氨基酸称为必需氨基酸。其中谷氨酰胺是细胞合成核酸和蛋白质必需的氨基酸，在缺少谷氨酰胺时，细胞生长不良而死亡。因此，各种培养液中都有较大量的谷氨酰胺。但是，由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定，应置于-20℃冰箱中保存，在使用前加入培养液内。
2.用弯头吸管将原代培养瓶内的细胞吹打均匀，注意将那些半贴壁生长的细胞吹打脱离以免在移换容器时丢失。
3.把细胞悬液吸入无菌离心管中，塞紧反口橡皮塞以防止空气污染，用1000r/min离心5min。
吸去上清夜，加入适量的培养液，用吸管打匀制成细胞悬液。
3.重复步骤1，计算细胞数，加入适量培养液把最终细胞数调节至1×105～3×105个/mL。
4.把细胞悬浮分装至新备的细胞培养瓶中，置于37℃二氧化碳培养箱中继续培养。
实验课上操作：
1.每小组先用一个培养瓶配制10ml的生长培养基
在超净工作台中操作：取RPMI 1640培养液4.45ml,谷氨酰胺50vl,双抗5vl，小牛血清500vl配制10ml溶液。
2.每人取5ml培养基到自己的细胞培养瓶内
（一）、细胞培养准备工作（清洗、消毒、灭菌）
清洗：1.新玻璃器皿的清洗
先用自来水刷洗，再浸泡5%稀盐酸中和玻璃表面的碱性物质和有害物质。
2.使用过的玻璃器皿的清洗
（1）立即进入清水，避免干涸难洗；
（2）用洗涤剂清洗玻璃器皿，自来水清洗数遍，倒置自然干燥；
（3）浸酸性洗液过夜；
（4）从洗液捞出自来水冲洗10~15次去除酸性洗液，蒸馏水刷洗10次，倒置烘干；
实验室
一.实验目的
（一）、细胞培养准备工作（清洗、消毒、灭菌）
能独立地进行用于细胞培养的各种器皿的清洗与消毒，掌握干热灭菌法、湿热灭菌法和滤过除菌法的操作，了解化学消毒法的使用方法。
（二）、培养基的配制
熟练掌握RPMI 1640培养基的配制方法。
（三）、细胞传代培养
熟练掌握细胞传代培养的操作方法。
观察外培细胞在不同时期的形态变化及生长状况。
（三）、细胞传代培养
1.悬浮型细胞培养常见于淋巴细胞、白血病细胞、骨髓瘤细胞和腹水型恶性细胞等的培养。由于这类细胞或细胞集体可悬浮在液体培养基中，而不附着在固体表面上，因此无论原代培养或传代培养的细胞增殖过程都没有贴附性细胞那种明显可辨的3个变化阶段，其培养的可见效果是细胞数目的增多及溶液中细胞浓度和密度的加大。
（二）实验结果分析
据统计得到的数据，再根据计算公式：每毫升原液细胞数=四大格细胞总数/4*10000*稀释倍数（由实验具体操作得到稀释倍数为2倍）
细胞存活率（%）=（细胞总数-死细胞）/细胞总数
每毫升原液细胞数=四大格细胞总数/4*10000*稀释倍数=AB死活细胞平均数的总数/4*10000*2=（2+2.5+3+2.5+0.5+1+0.5+1.5）/4*10000*2=67500（个）
3.然后向细胞培养瓶内接种500ul的人淋巴细胞株原液
4.放入二氧化碳培养箱，旋松瓶盖，根据细胞的数量看细胞瓶是否平放或直立放置
（四）、死活细胞的鉴别
1.取20ul细胞悬液放入干净的离心管中，加入等体积的0.4%的台盼蓝染液混合，放置1min。
2.取一干净的血球计数板，盖上盖片，从盖片两边滴入细胞悬液使之充满计数板和盖片之间。注意滴液勿有气泡，也不能太多，否则会使盖片浮起而是细胞计数不准。
高压处理是为了消灭杂菌，保证培养过程中不影响细胞培养。压力蒸汽灭菌是最常用的高温湿热灭菌方法。对生物材料有良好的穿透力，能造成蛋白质变性凝固而使微生物死亡。
（三）配制培养基时调节PH值的目的是什么？
pH气体也是细胞生存的必需条件之一，所需气体丰要是氧和二氧化碳。氧参与三羧酸循环，产生能量供给细胞生长、增殖和合成各种成分。一些细胞在缺氧情况下，借糖酵解也可获取能量，但多数细胞缺氧不能生存。为了使细胞处于一个适合的环境生存，细胞外的环境对细胞的生长很重要。二氧化碳既是细胞代谢产物，也是细胞所需成分，它主要与维持培养基的pH有直接关系。动物细胞大多数需要轻微的碱性条件，pH值约在7．2~7．4℃在细胞生长过程中，随细胞数量的增多和代谢活动的加强，二氧化碳不断被释放，培养液变酸，PH值发生变化。维持正常的pH值，防止pH波动影响细胞生长，使用了NaHCO3-CO2缓冲系统，并采用开放培养，使细胞代谢产生的CO2及时溢出培养瓶，再通过稳定调节温箱中CO2浓度（5％），与培养基中的NaHCO3处于平衡状态。
细胞的存活率是反映细胞群体生活状态的重要指标。多种方法可以鉴别细胞的死活，最常用到的方法是染色排除法。原理：许多酸性物质不容易穿过活细胞的质膜进入胞内，却能渗入死亡的细胞内，使其着色，以此来区别死活细胞。
三、实验仪器、材料和试剂
（一）仪器
超净工作台、干燥箱、高压锅、过滤器、高压灭菌锅、多重蒸馏水器、磁力搅拌器、天平、微量加样器、倒置显微镜、光学显微镜、蒸馏水器、超低温冰箱、二氧化碳培养箱、显微镜、血球计数板
（二）为什么配制培养基之前要反复处理配制用水并要事先高压处理？
体外培养的细胞对水质特别敏感，对水的纯度要求较高。培养用水中如果含有一些杂质，即使含量极微，有时也会影响细胞的存活和生长，甚至导致细胞死亡。用金属蒸馏器制备的蒸馏水，可能会含有某些金属离子，一般不作为培养用水。配制培养用液应使用经石英玻璃蒸馏器三次蒸馏的三蒸水或超纯水净化装置制备的超纯水。反复处理配置用水为了得到高纯度水，去除水中不确定因素（各种离子浓度）。
1
1
平均数
0.5
1
0.5
1.5
4.根据计算公式每毫升原液细胞浓度及细胞存活率。
五．对实验现象、实验结果的分析及其结论
（一）实验现象:
1.在配制硫酸—重铬酸钾洗液时，不断搅拌的过程中，溶液逐渐由橘红色变成黑色。
2.在配制RPMI 1640培养液时，不断通入二氧化碳过程中，液体由桃红色变为金黄色。
3.在取出培养了一周的培养液时可观察到培养瓶中有白色絮状物，即培养得到的细胞，此时细胞处于衰退期。可将培养瓶放到倒置显微镜下观察，但因倒置显微镜状况不好，没能观察到具体现象。
微量加样器的使用也是一个考验，选择适量范围的微量加样器是必要的，安装枪头、调整需要的刻度、加样枪头的位置、吸取溶液的操作等都是需要注意的，应正确使用。
在进行细胞死活细胞进行计数时也是一个比较复杂的实验过程，在显微镜下找到计数板上的方格是个小小的挑战，适度的光线（需要较暗的光线条件）、合适的距离都是不可以缺少的，当然耐心和方法也是不可缺少的。
3、低倍镜下观察，活细胞不着色，台盼蓝着色的细胞呈深蓝色，是不健康或已死亡的细胞，不能计数。找出计数板上的方格，计算四角大格内总的细胞数，压着大格线者只计左侧或上方，不计右侧或下方。
4.记录结果
第一大格
第二大格
第三大格
第四大格
活细胞数A33来自42B
1
2
2
3
平均数
2
2.5
3
2.5
死细胞数
A
1
0
0
2
B
0
2
观察各个分解的实验现象及留意每个小实验中的注意事项也是实验过程中的要求。
本科学生综合性实验报告
学号094120008
姓名范静宇
学院生命科学学院
专业、班级生物科学09级生科A班
实验课程名称细胞生物学实验
教师及职称周滔（实验师）
开课学期2011至2012学年第一学期
填报时间2011年11月24日
云南师范大学教务处编印
实验序号
实验五
实验名称
人类淋巴细胞株培养
实验时间
2011年10月31日，11月7日，11月14日，11月21日
（四）、死活细胞的鉴别
掌握死活细胞的鉴别原理及方法。
二、实验原理、实验流程或装置示意图
实验原理：
体外培养，就是将活体结构成分或活的个体从体内或其寄生体内取出，放在类似于体内生存环境的体外环境中，让其生长和发育的方法。