庄英萍发酵过程参数相关分析原理及应用

4－强化丙酸激酶表达
5－强化甲基丙二酰CoA变位酶表达
6－调控丙酰CoA羧化酶表达
7－强化ppGpp合成酶表达
1
EryG
1
EryK
3
红霉素C
6
红霉素A
4
EryK
红霉素B
EryG 红霉素D
强化并调控羟基化酶和甲基化酶表达 提高红霉ห้องสมุดไป่ตู้A产量
A CB
ZL1004, ZL1007：
去除了副产物（红霉素B、C） 产量提高25％
代谢活性变化：环境条件的线性或动力学因素、细胞内某 调节因子引起的代谢流迁移、基因水平的信息流。
基因工程毕赤酵母50小时趋势曲线图
补糖与氮源的利用关系
补料与磷含量的变化情况
细胞水平
代谢调节
dc/dt =KLa( c*－c)－ OUR
rpm↓ KLa ↓ KLa ( c*-c) < OUR
dc/dt < 0 c ↓
下层 DO
Underside
具有多点DO测定的372 m3发酵罐
Zou X, et al. Bioresource Technol 2009 100:1406
Zou X, et al. Bioresource Technol 2009, 100:3358
使代谢流曲 线具有相同 的趋势（宏 观动力学特 征一致）
物理过程：物质或能量传递、混和、平衡 或不平衡
*传热（加热或冷却） ∽ 温度 发酵过程中打开冷却水的阀门引起罐温的下降
化学过程：发生某些化学反应的结果
*酸碱加入 ∽ ｐＨ， 加入某种酸碱物质引起的pH的变化
理化相关
* 搅拌转速、通气流量、罐压力 ∽ 溶解氧 DO
转速↑，气泡↑，气液接触表面积↑，KLa↑，OTR〉OUR，DO↑
LLD-三肽 环化酶 O2
异青霉素N 异构酶
青霉素N 扩环酶 O2
脱乙酰氧头孢菌素C(DAOC) DAC合成酶 O2
生物相关
生物相关是指通过生物细胞的生命活动所引起的参数之间耦 合相关，主要体现在二种方式：
其一，通过生物细胞生长代谢后引起的培养液物性的变化， 进而引起的参数相关。
菌体生长引起的生物相关特性
* 快速生长期时，培养液粘度上升，KLa下 降，引起DO水平的变化。
* 培养液粘度的变化也会引起溶解二氧化 碳CO2与排气二氧化碳浓度ECO2的差异。
OUR当葡萄糖为限制性基质时
DO
rpm
min DO 加糖
rpm
Cc
CGLU
加入糖 CGLU ↑ OUR ↑(菌体生理活性)
min
OUR >KLa( c*-c) dc /dt <0 c ↓
好氧生物反应器供氧情况变化引起的变化
当降低搅拌转速时，供氧速率（OTR）下降必然引起溶解
氧浓度（DO）的下降，这是一个属于生物反应器系统中的
放大成果推广
三期工程建设情况
372 m3×10 全自动控制与灭菌 发电联用与清洁生产
先进的检测仪表与控制系统
国际一流水平的自动化发酵车间
车间全自动控制系统
生产车间质谱仪
研究技术的总体优势
由细胞内微观到宏观研究 操作条件到流场特性研究 精密仪器和传感器技术 国际一流水平的全自动计算机控制技术
红霉素发酵优化放大成效
➢ 成功实现高耗氧372 m3发 酵罐的放大
➢ 2008至2010年，实现新增 产值22亿元
➢ 未增加发酵罐时，生产能 力翻倍
➢ 产品质量超过美国雅培公 司，雅培公司被迫停产
➢ 国际市场占有率从5%提升 到30%
头孢菌素C发酵优化研究及应用推广
发酵优化与放大研究
头孢菌素C发酵优化研究背景
50 L → 372 m3 6500→9000 U/ml
372 m3高耗氧搅拌发酵罐（国际上未见报道）
流场验证
计 算 流 体 力 学 （ ） 模 拟 ： 温 度 、 浓 度 、 剪 切 、 等 流 场
生理特性验证
…
CFD
流场特性验证结果 ── 多点DO测定
上层 DO
中间 DO
Upside
Midlle side
Chen Y, et al. App Environ Microbiol 2008, 74:1820
红霉素基因工程菌大规模发酵实验获得成功
优化
(多尺度关联分析）
B、C组分（杂质）去除的基因工程改造 生产水平严重下降(8000→4000 U/ml)
系统生物学问题
放大
（流场与生理）
杂质含量降低、发酵单位提升 B、C组分：3-7%→1.5%
成分浓度 糖 氮 前体 诱导物 产物
中间代谢物 金属离子 脱氢酶活力 各种酶活力 细胞内成分 蛋白质 DNA RNA
间接参数
摄氧率（OUR） 二氧化碳生成率（CER） 呼吸商（RQ） 细胞浓度（X） 细胞生长速率（Rx） 比生长速率（μ） 细胞得率（YX/S） 糖利用率 氧利用率 比基质消耗率（u） 前体利用率 产物量（P） 比生产率（υ）
间接参数:由一些直接参数计算得到的各种反映过程特性的
参数。反映菌体代谢活性、反应器工程特性、反应 器操作特性等。
物理参数
直接参数
化学参数
温度
积累消耗量
压力
基质
功率输入
酸
通气流量
碱
泡沫水平
消泡剂
加料速率
细胞量
基质
气泡含量
前体
气泡表面积
诱导物
表面张力
培养液重量
培养液体积
生物热
培养液表观
粘度
pH 氧化还原电位 溶解氧浓度 溶解 CO2 浓度 排气 O2 分压 排气 CO2 分压 其他排气成分
生产水平：4000 → 9000 U/ml
60
2
50
CER
1.6
OUR
40
RQ
1.2
30
0.8 20
10
0.4
0
0
0 24 48 72 96 120 144 168 192 216
Time (hour)
OUR、CER（mol/m3.h) RQ
（120m3）
高吨位红霉素工业发酵罐放大
372 m3试验发酵罐
RQ=(CER) / (OUR)来表示。
呼吸商(RQ)变化的生物学意义
表征不同的代谢途径 厌氧代谢、耗氧代谢 不同的耗氧代谢途径间的差异
表征不同的基质利用情况 基质还原性强与弱的差异
相关性分析：发酵过程中加油的作用
EO2 ECO2
DO
消泡
释放CO2
(h)
RQ OUR
CER DO
作为碳源利用
(h)
解决了国际上未见报道的372m3大吨位、高耗氧发酵罐的流场特性研究问 题，实现了从50L到372m3的过程优化与放大，杂质组分B、C由3.7%下降到 2.7%（优于雅培公司）；发酵单位、产品质量和发酵技术水平，达国际先进水 平；国际市场占有率30%以上。
Zou X, et al. Bioresource Technology. 2009, 100 : 1406 (IF 4.253) Zou X, et al. Bioresource Technology , 2011,102 : 3360
体积氧传递系数（KLa） 功率、功率准数 雷诺数
细胞量 生物热
碳平衡 能量平衡
几个重要的间接参数计算公式
新型发酵罐的参数检测配置
主要内容
➢ 发酵过程的参数分类 ➢ 参数相关分析--理化相关、生物相关 ➢ 参数相关分析应用举例
参数相关基本特性
各种直接参数、间接参数以及手工测定的实 验室参数随着发酵过程的进行而变化，并且参数间 发生某种耦合相关，这种参数相关反映了发酵过程 多尺度（水平）的问题特征。
过程传递和混和问题
dC dt
KLa(C*
C)
OUR
如果DO下降到临界氧浓度以下时，就引起菌体呼吸强 度的减弱，这实质上是氧成为限制性基质时的动力学行为
OUR QOmCX KO C
当DO继续下降，就可能产生厌氧代谢，代谢途径发生迁 移，甚至发生胞内酶体系的改变 ─── 发生反应体系的结构 性变化。
➢ 生物反应器中基因、细胞和反应器不同尺度 网络之间存在着以时间为坐标多输入多输出 的互动关系。
➢ 表现在同一尺度下多过程的耦合，不同尺度 下也往往会有不同过程耦合发生。
➢ 多尺度的研究方法要求从一个尺度观察另一 尺度现象，即所谓跨尺度观察与控制，即可 能提供在生物技术研究中所没有发现的现象。
发酵过程的特性
理化相关
* 通气流量 ∽ 排气二氧化碳（ECO2 ) * 通气流量 ∽ 溶解二氧化碳（PＣＯ２） ∽ｐＨ
理化相关 *加油泡沫 ∽ ＣＥＲ， 气泡破裂释放ＣＯ2
理化相关的普遍特性
* 理化相关对不同细胞对象具有普遍性， 不因细胞生理活性的变化呈现不同的特 性。 要注意过程数据采集的非同步性引起 的误相关，特别要注意间接参数的变化 产生的对过程研究的误导。
➢ 生化反应过程中化学成分的分析往往是重要的检测 内容，但对其电信号的转换困难。
发酵过程的参数分类及检测
直接参数 通过传感器把非电量变化直接转化为电量变化，
实时地送计算机数据采集。物理参数、化学参数、 生物量参数就地测量(in line)、在线测量（on line）
手工参数:取样后实验室手工测量参数，离线输入。
代谢曲线对照
发酵过程参数检测技术要求越来越高
微生物学
生物化学
分子生物学
参数检测
发酵工艺学 化学工程 现代控制理论
(自动或手工检测) 综合性研究：
在线计算机
定性和定量的描述
各种工程开发