现代组织化学技术-组织化学 ppt课件
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
(1) 保持组织和细胞的完整性 (2) 被检物质具有不溶性和（或）可视性 (3) 反应具有特异性 (4) 反应具有灵敏性 (5) 可重复性
7
二、标本的制备
1. 取材（draw material）
(1) 组织标本取材：
准备充分、麻醉或处死方法合适、操作迅速、刀应锐利、适当 清洗、离体即固定（或冷冻切片，或保存于-80℃冰箱）、 大小适中（约2.5cm×2.5cm×0.2cm，宁可面积大，不能厚）
是常用的混合固定剂，特点是穿透力强、收缩作用小、固 定均匀，缺点是该固定液偏酸性，对抗原活性有影响 Carnoy固定液：冰乙酸、氯仿和无水乙醇组成，适于固定染 色体、DNA、RNA、糖原和尼氏体等，组织化学技术常 用 Zamboni固定液：多聚甲醛、饱和苦味酸和Karasson-Schwilt 磷酸盐缓冲液组成，类似于Bouin固定液，对超微结构的 12
二、标本的制备
2. 固定
(4) 固定的方法
浸渍法、灌注法、滴片法、原位法、蒸汽法和微波法等，浸 渍法和灌注法用的最多
浸润法：适用于临床取材的标本和小动物组织固定，做好
标记，直接将组织块修整为合适大小，投入到样品体积的40 倍左右的固定剂中，固定剂的种类和固定时间的长短根据情 况而定
13
二、标本的制备
冲洗液 固定液
动物
14
二、标本的制备
2. 固定
(5) 影响固定的因素：
① 组织块不宜过大： 组织块过大会影响固定剂的渗透 ② 固定液的量要合适：固定液的量要超过组织块大小的20倍-30倍，
(2) 细胞标本取材：
① 涂片法：培养的悬浮细胞，人体液中的细胞等，细胞密度 低时可先沉淀或者离心；
• 爬片法：贴壁生长的培养细胞； • 印片法：活组织标本、尸检标本及子宫颈外口等脱落细胞
8
二、标本的制备
2. 固定（fixation）
(1) 固定的目的：
保持组织细胞原有的形态结构；使组织硬化；对组织化 学及细胞化学技术来说---保存酶活性和蛋白质的抗原性 非常重要
多聚甲醛（应用最为广泛）、2.5%戊二醛等
A. 戊二醛含两个醛基，对膜结构固定更好，但是形成更多的交联，对抗原活性有
影响
10
二、标本的制备
2. 固定
(3) 常用固定剂的种类及特点
① 单一固定剂：
B. 凝固沉淀固定剂 丙酮、甲醇/乙醇、苦味酸、乙酸、三氯乙酸和氯化汞等：使
组织细胞中的蛋白质、糖等物质凝固，优点是渗透力强，对抗原活性和酶活性 保存较好；缺点是固定快，易使组织细胞收缩，小分子物质不容易保存，膜结 构会破坏，因此对细胞结构保存不好。固定方法在4℃，30~60 min 为宜。
3
一、绪论
2. 组织化学与细胞化学技术的特点
普通组织学技术：组织原位，染色，显微镜观察
HE染色
HE染色
4
一、绪论
2. 组织化学与细胞化学技术的特点
组织化学与细胞化学技术
PAS法显示粘多糖
铅法（ATP酶）
组织原位，特异性的化学反应，显微镜观察
——对组织或者细胞内特定物质进行定性， 定位， 定量分析
5
一、绪论
3. 组织化学与细胞化学技术的主要类型
化学方法，类化学方法，物理学方法，显微烧灰方 法，免疫学方法，分子生物学方法等
常用分类： (1) 一般组织化学与细胞化学 (2) 免疫组织化学与细胞化学 (3) 原位杂交组织化学 * 每种均有光镜和电镜之分和定性与定量之分
6
一、绪论
4. 组织化学与细胞化学技术的基本要求
组织形态结构保存好，穿透性强，组织收缩少。但是，醛基与抗原蛋白氨基交
联形成羧甲基，使抗原决定簇的空间构象出现障碍，可能部分或完全遮盖抗原
决定簇，在免疫组织化学染色时产生假阴性结果。固定时缩短固定时间ห้องสมุดไป่ตู้824
小时），降低固定温度（4℃）、固定后充分水洗、在免疫组织化学染色之前通
过抗原修复等可提高抗原反应性。常用的有：10%福尔马林（即4%甲醛）、4%
(2) 固定的优、缺点：
优点：使组织细胞的形态结构得到保持 缺点：拟检物质反应性减弱，酶的活性易受损
9
二、标本的制备
2. 固定
(3) 常用固定剂的种类及特点
① 单一固定剂：
A. 交联固定剂
甲醛、多聚甲醛、戊二醛等：与蛋白多肽链氨基酸侧链的功能基团，如氨
基、羟基、酰氨基等结合，使蛋白分子相互交联，保存抗原于原位。其特点是
------介于细胞生物学、组织学、化学、生物化 学、免疫学及分子生物学之间的边缘科学
------对组织与细胞的化学成分或者酶活性进行 定性、定位和定量的研究。常统称为“组织化 学”
------在保持组织或细胞基本不改变其生活状态时 的微细结构的条件下，利用某些特异性的反应， 采用显微镜技术观察某些化学成分或酶活性在组 织或细胞内的定性、定位和定量及其变化规律
现代组织化学技术
组织化学与细胞化学
1
学习要求
1．掌握组织化学技术的基本概念 2．熟悉组织化学和免疫组织化学标本的制备方 法及过程 3．掌握酶组织化学的基本原理 4．熟悉高碘酸Schiff（PAS）反应、过氧化物酶、 酸性磷酸酶铅法的基本原理
2
一、绪论
1. 什么是组织化学与细胞化学技术？
Histochemistry and cytochemistry
① 其他固定剂
B. 铬酸、重铬酸钾、四氧化锇等 四氧化锇：非电解质强氧化剂，与氨基酸、肽和蛋白质反应形成交联，保存微
细结构作用好，对组织收缩和膨胀的影响小，电镜技术常用的固定剂
11
二、标本的制备
2. 固定
(3) 常用固定剂的种类及特点
② 混合固定剂：
Bouin固定液、Carnoy固定液、Zamboni固定液等 Bouin固定液：甲醛、冰乙酸和饱和苦味酸按一定比例混合，
2. 固定
(4) 固定的方法： 灌流法：适用于动物实验中对缺氧敏感
的器官，如神经系统、胃肠等取材。
包括推注，滴注 滴注步骤(大鼠)： 开胸- 暴露心脏- 自心尖剪开左心室-插入灌流 针至主动脉弓- 固定灌流针-快速注入冲洗液， 剪开右心耳- 先快后慢注入固定液- 慢注毕， 将动物装入含少量固定液的塑料袋置4ºC冰箱 内静置2h后取材（或立即取材），放入固定 液中进行后固定 大动物多采用输液方式，将固定液从一侧颈总 动脉或股动脉输入，从另一侧切开静脉放血 固定液的输入量因个体不同而异，500～2,000 毫升不等
7
二、标本的制备
1. 取材（draw material）
(1) 组织标本取材：
准备充分、麻醉或处死方法合适、操作迅速、刀应锐利、适当 清洗、离体即固定（或冷冻切片，或保存于-80℃冰箱）、 大小适中（约2.5cm×2.5cm×0.2cm，宁可面积大，不能厚）
是常用的混合固定剂，特点是穿透力强、收缩作用小、固 定均匀，缺点是该固定液偏酸性，对抗原活性有影响 Carnoy固定液：冰乙酸、氯仿和无水乙醇组成，适于固定染 色体、DNA、RNA、糖原和尼氏体等，组织化学技术常 用 Zamboni固定液：多聚甲醛、饱和苦味酸和Karasson-Schwilt 磷酸盐缓冲液组成，类似于Bouin固定液，对超微结构的 12
二、标本的制备
2. 固定
(4) 固定的方法
浸渍法、灌注法、滴片法、原位法、蒸汽法和微波法等，浸 渍法和灌注法用的最多
浸润法：适用于临床取材的标本和小动物组织固定，做好
标记，直接将组织块修整为合适大小，投入到样品体积的40 倍左右的固定剂中，固定剂的种类和固定时间的长短根据情 况而定
13
二、标本的制备
冲洗液 固定液
动物
14
二、标本的制备
2. 固定
(5) 影响固定的因素：
① 组织块不宜过大： 组织块过大会影响固定剂的渗透 ② 固定液的量要合适：固定液的量要超过组织块大小的20倍-30倍，
(2) 细胞标本取材：
① 涂片法：培养的悬浮细胞，人体液中的细胞等，细胞密度 低时可先沉淀或者离心；
• 爬片法：贴壁生长的培养细胞； • 印片法：活组织标本、尸检标本及子宫颈外口等脱落细胞
8
二、标本的制备
2. 固定（fixation）
(1) 固定的目的：
保持组织细胞原有的形态结构；使组织硬化；对组织化 学及细胞化学技术来说---保存酶活性和蛋白质的抗原性 非常重要
多聚甲醛（应用最为广泛）、2.5%戊二醛等
A. 戊二醛含两个醛基，对膜结构固定更好，但是形成更多的交联，对抗原活性有
影响
10
二、标本的制备
2. 固定
(3) 常用固定剂的种类及特点
① 单一固定剂：
B. 凝固沉淀固定剂 丙酮、甲醇/乙醇、苦味酸、乙酸、三氯乙酸和氯化汞等：使
组织细胞中的蛋白质、糖等物质凝固，优点是渗透力强，对抗原活性和酶活性 保存较好；缺点是固定快，易使组织细胞收缩，小分子物质不容易保存，膜结 构会破坏，因此对细胞结构保存不好。固定方法在4℃，30~60 min 为宜。
3
一、绪论
2. 组织化学与细胞化学技术的特点
普通组织学技术：组织原位，染色，显微镜观察
HE染色
HE染色
4
一、绪论
2. 组织化学与细胞化学技术的特点
组织化学与细胞化学技术
PAS法显示粘多糖
铅法（ATP酶）
组织原位，特异性的化学反应，显微镜观察
——对组织或者细胞内特定物质进行定性， 定位， 定量分析
5
一、绪论
3. 组织化学与细胞化学技术的主要类型
化学方法，类化学方法，物理学方法，显微烧灰方 法，免疫学方法，分子生物学方法等
常用分类： (1) 一般组织化学与细胞化学 (2) 免疫组织化学与细胞化学 (3) 原位杂交组织化学 * 每种均有光镜和电镜之分和定性与定量之分
6
一、绪论
4. 组织化学与细胞化学技术的基本要求
组织形态结构保存好，穿透性强，组织收缩少。但是，醛基与抗原蛋白氨基交
联形成羧甲基，使抗原决定簇的空间构象出现障碍，可能部分或完全遮盖抗原
决定簇，在免疫组织化学染色时产生假阴性结果。固定时缩短固定时间ห้องสมุดไป่ตู้824
小时），降低固定温度（4℃）、固定后充分水洗、在免疫组织化学染色之前通
过抗原修复等可提高抗原反应性。常用的有：10%福尔马林（即4%甲醛）、4%
(2) 固定的优、缺点：
优点：使组织细胞的形态结构得到保持 缺点：拟检物质反应性减弱，酶的活性易受损
9
二、标本的制备
2. 固定
(3) 常用固定剂的种类及特点
① 单一固定剂：
A. 交联固定剂
甲醛、多聚甲醛、戊二醛等：与蛋白多肽链氨基酸侧链的功能基团，如氨
基、羟基、酰氨基等结合，使蛋白分子相互交联，保存抗原于原位。其特点是
------介于细胞生物学、组织学、化学、生物化 学、免疫学及分子生物学之间的边缘科学
------对组织与细胞的化学成分或者酶活性进行 定性、定位和定量的研究。常统称为“组织化 学”
------在保持组织或细胞基本不改变其生活状态时 的微细结构的条件下，利用某些特异性的反应， 采用显微镜技术观察某些化学成分或酶活性在组 织或细胞内的定性、定位和定量及其变化规律
现代组织化学技术
组织化学与细胞化学
1
学习要求
1．掌握组织化学技术的基本概念 2．熟悉组织化学和免疫组织化学标本的制备方 法及过程 3．掌握酶组织化学的基本原理 4．熟悉高碘酸Schiff（PAS）反应、过氧化物酶、 酸性磷酸酶铅法的基本原理
2
一、绪论
1. 什么是组织化学与细胞化学技术？
Histochemistry and cytochemistry
① 其他固定剂
B. 铬酸、重铬酸钾、四氧化锇等 四氧化锇：非电解质强氧化剂，与氨基酸、肽和蛋白质反应形成交联，保存微
细结构作用好，对组织收缩和膨胀的影响小，电镜技术常用的固定剂
11
二、标本的制备
2. 固定
(3) 常用固定剂的种类及特点
② 混合固定剂：
Bouin固定液、Carnoy固定液、Zamboni固定液等 Bouin固定液：甲醛、冰乙酸和饱和苦味酸按一定比例混合，
2. 固定
(4) 固定的方法： 灌流法：适用于动物实验中对缺氧敏感
的器官，如神经系统、胃肠等取材。
包括推注，滴注 滴注步骤(大鼠)： 开胸- 暴露心脏- 自心尖剪开左心室-插入灌流 针至主动脉弓- 固定灌流针-快速注入冲洗液， 剪开右心耳- 先快后慢注入固定液- 慢注毕， 将动物装入含少量固定液的塑料袋置4ºC冰箱 内静置2h后取材（或立即取材），放入固定 液中进行后固定 大动物多采用输液方式，将固定液从一侧颈总 动脉或股动脉输入，从另一侧切开静脉放血 固定液的输入量因个体不同而异，500～2,000 毫升不等