基因诊断_PPT幻灯片
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可借助核酸分子杂交或PCR进行检测。
2021/3/7
29
PCR-RFLP
设计适当的扩增引物，使扩增片段包 括某一个或数个限制性内切酶识别序列，在 PCR 扩 增 后 用 该 限 制 酶 切 割 PCR 产 物 ， 根 据电泳后酶切片段长度变化，即可作出诊断。
2021/3/7
30
EcoR Ⅰ限制性内切酶位点的变化 GAATTC
2021/3/7
7
（一）核酸分子杂交 Nucleic acid hybridization
指两条单链核酸在一定条件（温度、盐离 子和有机溶剂浓度）下，按碱基互补的原则 重新配对形成双链的过程。
2021/3/7
8
核酸分子杂交流程
待测核酸制备
滤膜上核酸固化
杂交 去除未杂交的探针
检测杂交信号
2021/3/7
2021/3/7
26
PCR-SSCP分析原理
2021/3/7
27
PCR-SSCP分析 －
+
正常人
纯合突变 杂合突变
2021/3/7
28
（四）限制性片段长度多态性分析
（restriction fragment length polymorphism, RFLP）
由于DNA 变异产生新的酶切位点或原有 的酶切位点消失，在用限制性核酸内切酶消 化时产生不同长度或不同数量的片段。
2021/3/7
20
1. RT-PCR
2021/3/7
21
2.荧光定量PCR
荧光标记引物
2021/3/7
22
3.多重PCR
多重PCR示意图 A：普通PCR；B：多重PCR
2021/3/7
23
4. PCR-ASO
G
ASO1 ASO2
A
G C
N
A C
H
A T
G
M
T
2021/3/7
24
N：正常基因；H：杂合子基因；M：突变基因
本章内容提要
第一节 基因诊断的技术和方法 第二节 遗传病的基因诊断 第三节 传染病的基因诊断 第四节 肿瘤的基因诊断 第五节 基因诊断在法医学上的应用
2021/3/7
1
第一节 基因诊断的技术和方法
2021/3/7
2
基因诊断之父—简悦威
1976年加州大学华裔科 学家 Kan YW用核酸分 子杂交技术首次对一例 α地中海贫血进行诊断。
CTTAAG
AB C
－
＋
2021/3/7
D
E
－
D
E F C B
A
G＋
FG
C +D E F B A G
31
（五） DNA序列测定（DNA sequencing）
2021/3/7
32
DNA序列测定原理(双脱氧末端终止法)
2021/3/7
33
序列分析用于基因诊断
左侧：正常；右侧：突变
2021/3/7
5. AS-PCR（allele specific PCR）
等位基因特异PCR：根据引物3´端 的互补与否，设计一对与正常或突变模 板配对的特异引物
2021/3/7
25
（三）单链构象多态性分析（single-strand conformation polymorphism， SSCP）
DNA 的突变造成DNA片段中碱基序列 不同，变性为单链后在中性聚丙烯酰胺凝胶 中的构象不同（单链构象多态性），利用迁 移率的差别可使各种序列不同的单链分离开 来。
2021/3/7
17
固相夹心杂交法示意图
2021/3/7
18
（二） 聚合酶链式反应
(polymerase chain reaction, PCR）
变性
延伸
模板 引物
dNTP Mg2+ Taq DNA聚合酶
退火
2021/3/7
19
基因诊断中常用的PCR衍生技术
RT-PCR 荧光定量PCR 多重-PCR PCR-ASO AS-PCR PCR-SSCP PCR-RFLP
2021/3/7
13
等位基因特异性寡核苷酸
(allele specific oligonucleotide, ASO）
寡核苷酸中的碱基错配会大大影响杂交 分子的稳定性，可用人工合成的针对正常和 突变ASO探针进行反向斑点杂交，检测点突 变，大大提高检测结果的可靠性。
2021/3/7
14ຫໍສະໝຸດ Baidu
5.原位分子杂交
核酸探针制备 探针标记
加入标记探针
9
1. Southern 印迹杂交
提取DNA→限制性内切酶消化DNA 以产生特定长度的片段→凝胶电泳分离 →变性处理→DNA转印到膜上并使其牢 固结合→将标记的探针与膜上DNA片段 杂交，分析杂交信号。
2021/3/7
10
2. Northern印迹杂交
RNA经变性琼脂糖凝胶电泳后，转 移到固相支持物上，通过分子杂交检测 特定的mRNA分子的含量与大小。
荧光原位杂交 (fluorescence in situ hybridization, FISH）
挂锁FISH (FISH with padlock)
2021/3/7
15
荧光原位杂交（FISH）
2021/3/7
16
6. 固相夹心杂交法 (sandwich hybridization)
待测靶基因序列上两个相邻但不重叠的 DNA片段（A、B片段），分别作为捕捉探针 （不标记的A片段）和检测探针（标记的B片 段），同时与靶基因杂交。先将捕捉探针吸附 于固相支持物上，与靶基因序列A部分杂交， 再加入标记的检测探针，检测探针与靶基因序 列B部分杂交，检测杂交信号。
34
（六）生物芯片（biochip）
2021/3/7
11
3. 斑点杂交（dot blotting）
将RNA或DNA变性后直接点样 于硝酸纤维素膜或尼龙膜上，用于 基因组中特定基因及其表达产物的 定性及定量的研究。
2021/3/7
12
4.反向斑点杂交
先将探针固定于硝酸纤维素膜或尼 龙膜上，将样品RNA或DNA标记变性后 进行杂交。改变了传统杂交方法中一次 杂交只能检测一种样品的局限，大大提 高了基因诊断的效率。
Yuet 2021/3/7 Wai Kan 1936～
3
• 基因诊断的特点：
✓ 高特异性 ✓ 高灵敏性 ✓ 早期诊断性 ✓ 应用广泛性
2021/3/7
6
二、基因诊断中常用的分子生物学技术
核酸分子杂交（Nucleic acid hybridization） 聚合酶链式反应(PCR) 单链构象多态性（SSCP） 限制性片段长度多态性（RFLP） DNA序列测定（DNA sequencing） 生物芯片（biochips） Western免疫印迹（Western blot） 免疫组织化学诊断
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PCR-RFLP
设计适当的扩增引物，使扩增片段包 括某一个或数个限制性内切酶识别序列，在 PCR 扩 增 后 用 该 限 制 酶 切 割 PCR 产 物 ， 根 据电泳后酶切片段长度变化，即可作出诊断。
2021/3/7
30
EcoR Ⅰ限制性内切酶位点的变化 GAATTC
2021/3/7
7
（一）核酸分子杂交 Nucleic acid hybridization
指两条单链核酸在一定条件（温度、盐离 子和有机溶剂浓度）下，按碱基互补的原则 重新配对形成双链的过程。
2021/3/7
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核酸分子杂交流程
待测核酸制备
滤膜上核酸固化
杂交 去除未杂交的探针
检测杂交信号
2021/3/7
2021/3/7
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PCR-SSCP分析原理
2021/3/7
27
PCR-SSCP分析 －
+
正常人
纯合突变 杂合突变
2021/3/7
28
（四）限制性片段长度多态性分析
（restriction fragment length polymorphism, RFLP）
由于DNA 变异产生新的酶切位点或原有 的酶切位点消失，在用限制性核酸内切酶消 化时产生不同长度或不同数量的片段。
2021/3/7
20
1. RT-PCR
2021/3/7
21
2.荧光定量PCR
荧光标记引物
2021/3/7
22
3.多重PCR
多重PCR示意图 A：普通PCR；B：多重PCR
2021/3/7
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4. PCR-ASO
G
ASO1 ASO2
A
G C
N
A C
H
A T
G
M
T
2021/3/7
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N：正常基因；H：杂合子基因；M：突变基因
本章内容提要
第一节 基因诊断的技术和方法 第二节 遗传病的基因诊断 第三节 传染病的基因诊断 第四节 肿瘤的基因诊断 第五节 基因诊断在法医学上的应用
2021/3/7
1
第一节 基因诊断的技术和方法
2021/3/7
2
基因诊断之父—简悦威
1976年加州大学华裔科 学家 Kan YW用核酸分 子杂交技术首次对一例 α地中海贫血进行诊断。
CTTAAG
AB C
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＋
2021/3/7
D
E
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D
E F C B
A
G＋
FG
C +D E F B A G
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（五） DNA序列测定（DNA sequencing）
2021/3/7
32
DNA序列测定原理(双脱氧末端终止法)
2021/3/7
33
序列分析用于基因诊断
左侧：正常；右侧：突变
2021/3/7
5. AS-PCR（allele specific PCR）
等位基因特异PCR：根据引物3´端 的互补与否，设计一对与正常或突变模 板配对的特异引物
2021/3/7
25
（三）单链构象多态性分析（single-strand conformation polymorphism， SSCP）
DNA 的突变造成DNA片段中碱基序列 不同，变性为单链后在中性聚丙烯酰胺凝胶 中的构象不同（单链构象多态性），利用迁 移率的差别可使各种序列不同的单链分离开 来。
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固相夹心杂交法示意图
2021/3/7
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（二） 聚合酶链式反应
(polymerase chain reaction, PCR）
变性
延伸
模板 引物
dNTP Mg2+ Taq DNA聚合酶
退火
2021/3/7
19
基因诊断中常用的PCR衍生技术
RT-PCR 荧光定量PCR 多重-PCR PCR-ASO AS-PCR PCR-SSCP PCR-RFLP
2021/3/7
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等位基因特异性寡核苷酸
(allele specific oligonucleotide, ASO）
寡核苷酸中的碱基错配会大大影响杂交 分子的稳定性，可用人工合成的针对正常和 突变ASO探针进行反向斑点杂交，检测点突 变，大大提高检测结果的可靠性。
2021/3/7
14ຫໍສະໝຸດ Baidu
5.原位分子杂交
核酸探针制备 探针标记
加入标记探针
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1. Southern 印迹杂交
提取DNA→限制性内切酶消化DNA 以产生特定长度的片段→凝胶电泳分离 →变性处理→DNA转印到膜上并使其牢 固结合→将标记的探针与膜上DNA片段 杂交，分析杂交信号。
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2. Northern印迹杂交
RNA经变性琼脂糖凝胶电泳后，转 移到固相支持物上，通过分子杂交检测 特定的mRNA分子的含量与大小。
荧光原位杂交 (fluorescence in situ hybridization, FISH）
挂锁FISH (FISH with padlock)
2021/3/7
15
荧光原位杂交（FISH）
2021/3/7
16
6. 固相夹心杂交法 (sandwich hybridization)
待测靶基因序列上两个相邻但不重叠的 DNA片段（A、B片段），分别作为捕捉探针 （不标记的A片段）和检测探针（标记的B片 段），同时与靶基因杂交。先将捕捉探针吸附 于固相支持物上，与靶基因序列A部分杂交， 再加入标记的检测探针，检测探针与靶基因序 列B部分杂交，检测杂交信号。
34
（六）生物芯片（biochip）
2021/3/7
11
3. 斑点杂交（dot blotting）
将RNA或DNA变性后直接点样 于硝酸纤维素膜或尼龙膜上，用于 基因组中特定基因及其表达产物的 定性及定量的研究。
2021/3/7
12
4.反向斑点杂交
先将探针固定于硝酸纤维素膜或尼 龙膜上，将样品RNA或DNA标记变性后 进行杂交。改变了传统杂交方法中一次 杂交只能检测一种样品的局限，大大提 高了基因诊断的效率。
Yuet 2021/3/7 Wai Kan 1936～
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• 基因诊断的特点：
✓ 高特异性 ✓ 高灵敏性 ✓ 早期诊断性 ✓ 应用广泛性
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二、基因诊断中常用的分子生物学技术
核酸分子杂交（Nucleic acid hybridization） 聚合酶链式反应(PCR) 单链构象多态性（SSCP） 限制性片段长度多态性（RFLP） DNA序列测定（DNA sequencing） 生物芯片（biochips） Western免疫印迹（Western blot） 免疫组织化学诊断