如何认识蛋白质类药物纯度检测
怎么测蛋白纯度？从样本到结果所需的最低蛋白量
怎么测蛋白纯度？从样本到结果所需的最低蛋白量蛋白质是生命体中最基本的分子之一，它们在细胞内发挥着重要的生物学功能。
因此，研究蛋白质的纯度和结构对于理解生命体系的基本原理至关重要。
在生物药物领域，测定蛋白质的纯度是非常关键的，因为它直接影响到药物的质量和效力。
本文将介绍测定蛋白质纯度的方法步骤和从样本到结果所需的最低蛋白量。
1.蛋白质纯度的定义蛋白质纯度是指在样品中蛋白质所占的比例。
蛋白质纯度越高，药物的质量和效力就越好。
因此，测定蛋白质纯度是药物研发和生产过程中非常重要的一步。
2.测定蛋白质纯度的方法测定蛋白质纯度的方法有很多种，包括比色法、凝胶电泳法、高效液相色谱法等。
下面将介绍其中比色法和凝胶电泳法。
2.1比色法比色法是一种简单、快速、灵敏的测定蛋白质纯度的方法。
它利用蛋白质与某些化学试剂反应后产生的颜色变化来测定蛋白质的含量。
常用的试剂有布拉德福德试剂、比色法试剂盒等。
比色法的步骤如下：->B:准备标准曲线：将不同浓度的蛋白质标准品加入试管中，加入比色试剂，混匀后测定吸光度，得到标准曲线。
->B:取待测样品：将待测样品加入试管中，加入比色试剂，混匀后测定吸光度。
->B:计算蛋白质含量：根据标准曲线和待测样品的吸光度计算出蛋白质的含量。
2.2凝胶电泳法凝胶电泳法是一种常用的分离蛋白质的方法，它可以将蛋白质按照大小和电荷分离出来。
凝胶电泳法可以用于测定蛋白质的分子量和纯度。
凝胶电泳法的步骤如下：->B:制备凝胶：将聚丙烯酰胺和交联��混合，制备成凝胶。
->B:加载样品：将待测样品加入凝胶孔中。
->B:电泳：将凝胶放入电泳槽中，加入电解液，通电分离蛋白质。
->B:染色：将凝胶染色，可用银染法或共染法。
->B:分析：通过分析凝胶带的大小和颜色来判断蛋白质的分子量和纯度。
3.从样本到结果所需的最低蛋白量在测定蛋白质纯度时，从样本到结果所需的最低蛋白量是非常重要的。
如何认识蛋白质类药物纯度检测
如何认识蛋白质类药物纯度检测？
1 从蛋白质制剂中检测出少量的污染蛋白质是 很困难的。因为污染蛋白质的量可能低于很多 测定方法的检测下限。制剂中往往含有大量的 辅料。
2 当用一种方法测定蛋白质纯度时，可能有两 种或更多的蛋白质表现出相似的行为。这种类 似的行为可能会导致本来是混合物的样品也被 认为是均一物质的错误结论。
HPLC法应根据不同的纯化工艺选择不同的方法。 一般尽量采用与SDS- PAGE法原理不同的反相柱或其 他离子交换柱进行分析，而不主张用分子筛分析。在 质量标准中要说明采用的是什么性质的分析柱。如有 些产品不适合用反相柱，要说明原因。
1.3 毛细管电泳
毛细管电泳的方法简便、快速，灵敏度和 分辨率高，但价格昂贵，重现性差，尚未作为 常规检定。
与产品相关的杂质包括：
突变物、错误裂解的产品、二硫化物异构体、 二聚体和多聚体；化学修饰的形态：脱去酰氨 基的或氧化的形态、其他降解产物等。
4.1宿主细胞蛋白含量
概念: 宿主细胞蛋白质一般简称宿主蛋白，是指生产过
程中来自宿主或培养基的残留肽等杂质。基因工程 药物中的宿主蛋白含量，可用 ELISA法(enzymelinked immunosorbent assay)测定。
3 只用一种方法作为纯度试验的标准是很不 可靠的，必须选择多种测定纯度的方法。
最好的纯度标准是建立多种分析方法，从 等电点、相对分子质量、疏水性等不同的角度 来证明了蛋白质样品的均一性。
4 纯度最终取决于所用方法的类型和分辨力， 低分辨率方法检测合格的样品改用高分辨力方 法时就有可能证明它是不纯的。
3.3等电点测定 可以表征药物的理化性质和纯度 均一的重组蛋白质只有一个等电点，有时因加工 修饰等影响可出现多个等电点，但应有一定的范 围。所以等电点测定是控制重组产品生产工艺稳 定性的重要指标。
蛋白质类药物分析
70%~130%标示量 80%~120%标示量 85%~115%标示量 85%~115%标示量
（五）蛋白质药物的比活性
样品：原液 定义与计算：比活性：单位重量蛋白的活性
单位（IU/mg） 意义：真实反映有活性的蛋白质所占的比例，
厂家间、表达系统间、批间比较 便于配制成品
第二节 蛋白质和多肽类药物分析
质谱法
外源性DNA残留量：≤10ng/剂量（见Chp附录ⅨB）
宿主蛋白残留量：≤0.1%，0.05%（见Chp附录ⅨC）
残余抗生素：不得检出（见Chp附录ⅨA）
细菌内毒素：≤10EU剂量（见Chp附录ⅫE凝胶限 量试验）
结构确证：等电点（见Chp附录ⅣD）、紫外吸收 光谱扫描（见Chp附录ⅡA）、N末端15个氨基酸 顺序、肽图（见Chp附录ⅧE）、氨基酸组成
1、蛋白质及肽水解方法
虽然多肽的氨基酸组成分析已向更灵敏、更 精确、更快速以及自动化方向发展和改进， 但还没有一种单独适用于所有残基的，并且 能在水解液中定量回收的水解方法出现，很 多因素如温度、时间、水解试剂、添加剂、 水解方法等对水解的完全程度均有影响
（1）酸性水解
HCl是最通用的水解剂（6mol/L HCl、真空、 110℃，20～24h）
蛋白质类药物分析
第一节 概述
一、蛋白质和多肽重要理化性质 二、蛋白质和多肽类药物质量控制标准 三、蛋白质和多肽类药物的活性及测定方法
一、主要理化性质
高分子特性：是其胶体性、变性和免疫学特性基础 两性解离与等电点：影响多肽、蛋白质分离、纯化和
分析 颜色反应：茚三酮反应、双缩脲反应、酚试剂反应 紫外吸收：280nm处最大吸收，可定量蛋白质和多
肽图裂解方法
化学裂解法：非特异性降解，裂解位点少 蛋白酶裂解法：特异性降解，裂解位点较多 特殊处理: 二硫键、空间构象较复杂特殊产品
蛋白质纯度检测方法
蛋白质纯度检测方法
蛋白质纯度是指蛋白质样品中所含目标蛋白质的纯度程度，通常用百分比表示。
蛋白质样品中的杂质可能来自于其他蛋白质、小分子化合物或其他污染物。
因此，准确测定蛋白质纯度对于分析和表征蛋白质非常重要。
目前，测定蛋白质纯度的方法非常多样，包括分光光度法、凝胶电泳法、高效液相色谱法、质谱法等。
其中，分光光度法是最常用的方法之一，因为它是一种快速且相对易于操作的方法。
这种方法基于一种称为“比色法”的技术，通过测量吸光度来确定蛋白质样品中目标蛋白质的浓度。
凝胶电泳法是另一种常用的方法，它可以将蛋白质样品分离成单个蛋白质带，从而确定目标蛋白质的纯度。
在该方法中，蛋白质样品被加入到凝胶中，然后通过电泳分离。
分离后，凝胶中的蛋白质带可以被染色或用放射性示踪剂标记，并用摄像机或扫描器进行检测。
高效液相色谱法是另一种准确测定蛋白质纯度的方法。
该方法使用液相色谱柱将蛋白质样品分离成单个蛋白质，然后通过检测样品中的特定蛋白质，确定目标蛋白质的纯度。
质谱法是一种高级技术，它可以准确测定蛋白质样品中的目标蛋白质，甚至可以确定蛋白质结构。
质谱法的原理是将蛋白质样品离子化，然后通过质谱仪进行分析。
总之，测定蛋白质纯度是非常重要的，因为它可以确保实验结果的准确性和可靠性。
不同的方法适用于不同的样品和实验目的。
因此，
选择适当的方法来测定蛋白质纯度非常关键。
如何认识蛋白质类药物纯度检测
06
蛋白质类药物纯度检测技术发 展趋势与挑战
技术发展趋势分析
01
高效分离技术
随着蛋白质类药物的不断发展，对分离技术的要求也越来越高。高效分
离技术将成为未来蛋白质类药物纯度检测的重要发展趋势。
02
多维检测技术
多维检测技术能够同时获得蛋白质类药物的多个信息，如分子量、等电
点、序列等，有助于更全面地评估蛋白质类药物的纯度。
疫苗研发
蛋白质类药物在疫苗研发中发挥着重 要作用，如新冠病毒疫苗中的重组蛋 白疫苗。
蛋白质类药物纯度的重要性
01
02
03
保证药物安全性
高纯度的蛋白质类药物可 以减少杂质和污染物对患 者的危害，提高药物的安 全性。
保证药物有效性
高纯度的蛋白质类药物可 以保证药物的纯度和生物 活性，从而提高药物的有 效性。
病毒安全性
对于以病毒为载体的蛋白质类药 物，需对其携带的病毒进行安全 性检测。
不同蛋白质类药物的纯度检测指标差异
治疗性抗体药物
主要关注杂质如聚集体、宿主细 胞蛋白、残留DNA和RNA等。
重组蛋白药物
需关注杂质如未折叠或错误折叠的 蛋白、聚集蛋白、宿主细胞蛋白、 残留DNA和RNA等。
基因工程蛋白药物
便于质量控制
高纯度的蛋白质类药物便 于质量控制和监管，有利 于药物的研发和生产。
02
蛋白质类药物纯度检测方法
高效液相色谱法（HPLC）
总结词
高效、快速、准确
详细描述
高效液相色谱法是一种常用的蛋白质类药物纯度检测方法，具有高效、快速和准 确的特点。该方法利用不同蛋白质分子在固定相和流动相之间的分配平衡的差异 进行分离，并通过检测器对分离后的蛋白质组分进行定量和定性分析。
蛋白质纯度测定：选择适合的方法有哪些？
蛋白质纯度测定：选择适合的方法有哪些？1.引言。
蛋白质是生物体内重要的生物大分子，其纯度直接影响着生物药物的质量和效力。
因此，准确测定蛋白质的纯度是生物制品蛋白组学领域中至关重要的任务。
在纯度测定中，选择适合的方法非常重要，本文将介绍几种常见的测定方法。
2.SDS-PAGE凝胶电泳。
SDS-PAGE凝胶电泳是一种常用的蛋白质纯度测定方法。
它通过根据蛋白质的分子量，将样品中的蛋白质分离成带状，然后通过染色或蛋白质标记技术进行定性和定量分析。
这种方法简单易行，适用于常规纯度测定和样品预处理。
3.高效液相色谱（HPLC）。
HPLC是一种高分辨率的分离技术，可用于测定蛋白质的纯度。
常用的方法包括反相HPLC和凝胶过滤HPLC。
反相HPLC基于蛋白质的亲水性差异进行分离，而凝胶过滤HPLC则是通过分子筛原理分离不同大小的蛋白质。
HPLC具有高分辨率和高灵敏度的优势，特别适用于复杂样品的纯度测定。
4.尺寸排阻色谱（SEC）。
尺寸排阻色谱是一种基于蛋白质分子大小的分离技术。
在SEC中，大分子的蛋白质会更快地通过填充物，而小分子的蛋白质则会较慢地通过。
通过测定样品中峰的位置和峰面积，可以得出蛋白质的相对含量和纯度。
5.光谱法。
光谱法是一种通过测定蛋白质在特定波长下的吸光度来推断其浓度和纯度的方法。
紫外-可见光谱法（UV-Vis）是其中最常用的一种，它可用于测定蛋白质的蛋白质含量和纯度，但对于复杂样品可能需要进一步配合其他方法进行分析。
6.结论与展望。
蛋白质的纯度测定对于生物制品蛋白组学领域具有重要意义。
选择适合的测定方法对于保证生物药物研发和生产的质量至关重要。
在实际应用中，可以根据样品的复杂性、分析的目的和实验条件等因素综合考虑，选择合适的方法进行蛋白质纯度测定。
图1。
蛋白质药物鉴定与定量的精准分析
蛋白质药物鉴定与定量的精准分析随着科学技术的不断进步，人们对药物研究的要求也越来越高，特别是对蛋白质药物的研究。
蛋白质药物作为一类新型药物，其研究具有较高的复杂性和专业性。
其中，蛋白质药物鉴定与定量就是其研究之一。
为了保证药物的质量和效果能够得到确认，我们需要采用一些精准的分析方法来进行蛋白质药物鉴定与定量。
一、蛋白质药物鉴定蛋白质药物鉴定是指对蛋白质药物结构的认识和分析，以及对其纯度、完整性及稳定性等方面的检测。
目前，常用的蛋白质药物鉴定方法主要包括生化分析、质谱分析、生物活性分析等。
1. 生化分析生化分析主要是通过对蛋白质的化学特性进行分析，包括分子量、等电点、氨基酸序列及蛋白质的结构等。
生化分析的方法较为简单，适用于大多数蛋白质药物。
2. 质谱分析质谱分析主要是通过对药物分子的质量进行分析，包括质量分析和质量谱分析。
由于药物分子的质量不会受到其结构、物理化学性质的影响，因此质谱分析具有高度的准确性和精度。
3. 生物活性分析生物活性分析是通过对药物的生物学活性进行检测，如药物形成的酶抑制剂活性、生长抑制活性、细胞凋亡活性等。
通过对药物的生物学活性进行检测，可以更好地了解药物与生物体之间的相互作用，为后续的研究提供了有力的实验基础。
二、蛋白质药物定量蛋白质药物定量是指在药物鉴定的基础上，对药物的含量进行分析。
目前，蛋白质药物定量主要采用的方法有抗体法、比色法、荧光法等。
1. 抗体法抗体法相对于传统的免疫荧光、酵素联合免疫吸附检测等方法更加精准，而且对于常见的蛋白质药物均可适用。
抗体法基于免疫反应的特定性，将对应的免疫体系建立起来。
通过建立标准曲线，可对药物的含量进行定量分析。
2. 比色法比色法是指通过药物与某种试剂反应，生成特定的颜色，然后根据颜色的深浅程度来进行药物含量的定量分析。
比色法的优点在于，药物与试剂反应后，反应物的颜色容易辨认，且药物性质并不对其产生影响。
3. 荧光法荧光法主要是通过药物与某些荧光剂之间的相互作用，使得药物与荧光剂之间形成荧光复合物，进而对药物含量进行定量分析。
蛋白质纯度测定方法
蛋白质纯度测定方法一、引言蛋白质是生命体中最基本的分子之一，它在细胞的生命活动中扮演着极其重要的角色。
因此，对蛋白质进行纯度测定是非常必要的。
本文将介绍几种常用的蛋白质纯度测定方法。
二、背景知识在进行蛋白质纯度测定之前，需要了解几个基本概念：1. 蛋白质的纯度：指在样品中含有的目标蛋白质所占比例。
2. 蛋白质的含量：指样品中所有蛋白质所占比例。
3. 蛋白质的分离：指将混合物中不同种类的蛋白质分离出来。
三、方法介绍1. SDS-PAGE法SDS-PAGE法是一种常见的蛋白质分离方法，可以用于测定目标蛋白质在混合物中所占比例。
具体步骤如下：（1）制备样品：将待测样品加入SDS-PAGE电泳缓冲液中，并加入还原剂和热处理。
（2）电泳：将样品加入凝胶孔中，进行电泳分离。
（3）染色：将凝胶染色，观察目标蛋白质的带位置和强度。
2. 尿素-PAGE法尿素- PAGE法是一种用于测定蛋白质含量的方法。
具体步骤如下：（1）制备样品：将待测样品加入尿素-PAGE电泳缓冲液中，并加入还原剂和热处理。
（2）电泳：将样品加入凝胶孔中，进行电泳分离。
（3）染色：将凝胶染色，计算所有蛋白质的含量。
3. 透析法透析法是一种常见的蛋白质纯化方法。
具体步骤如下：（1）制备样品：将待纯化的混合物加入透析袋中。
（2）透析：用适当的缓冲液对混合物进行透析，使目标蛋白质从袋子中渗出。
（3）收集目标蛋白质：收集渗出液，即为目标蛋白质。
4. 亲和层析法亲和层析法是一种高效的蛋白质纯化方法。
具体步骤如下：（1）制备样品：将待纯化的混合物加入含有亲和基团的树脂中。
（2）洗涤：用适当的缓冲液对树脂进行洗涤，使非目标蛋白质从树脂上洗掉。
（3）吸附：目标蛋白质与亲和基团结合在一起，被吸附在树脂上。
（4）洗涤：用适当的缓冲液对树脂进行洗涤，去除杂质。
（5）洗脱：用适当的缓冲液将目标蛋白质从树脂上洗下。
四、总结本文介绍了几种常用的蛋白质纯度测定方法，包括SDS-PAGE法、尿素-PAGE法、透析法和亲和层析法。
SDS-PAGE检测蛋白质纯度
SDS-PAGE检测蛋白质纯度1．电泳的基本原理许多生物分子都带有电荷，其电荷的多少取决于分子性质及其所在介质的pH及其组成。
由于混合物中各组分所带电荷性质、电荷数量以及分子量的不同，在同一电场的作用下，各组分泳动的方向和速度也各异，因此，在一定时间内，由于各组分移动距离的不同，而达到分离鉴定各组分的目的。
2．影响电泳的主要因素2.1 电泳介质的pH当介质的pH等于某种两性物质的等电点时，该物质处于等电状态，即不向正极或负极移动。
当介质pH小于其等电点时，则呈正离子状态，移向负极；反之，介质pH大于其等电点时，则呈负离子状态，移向正极。
因此，任何一种两性物质的混合物电泳均受介质pH的影响，即决定两性物质的带电状态及其量，为了保持介质pH的稳定性，常用一定pH的缓冲液，如分离血清蛋白质常用pH8．6的巴比妥或三羟甲基氨基甲烷（Tris）缓冲液。
2.2 缓冲液的离子强度离子强度对电泳的影响是：离子强度低，电泳速度快，分离区带不易清晰；离子强度高，电泳速度慢，但区带分离清晰。
如离子强度过低，缓冲液的缓冲量小，不易维持pH的恒定；离子强度过高，则降低蛋白质的带电量(压缩双电层)使电脉速度减慢。
所以常用离子强度为0.02-0.2之间。
2.3 电场强度电场强度和电泳速度成正比关系。
电场强度以每厘米的电势差计算，也称电势梯度。
如纸电泳的滤纸长15cm，两端电压（电势差）为150V，则电场强度为150/15=10V/cm，电场强度愈高，则带电粒子的移动愈快。
电压增加，相应电流也增大，电流过大时易产生热效应可使蛋白质变性而不能分离。
2.4 电渗作用在电场中，液体对固体的相对移动，称为电渗。
如滤纸中含有表面带负电荷的羧基，溶液则向负极移动。
由于电渗现象与电泳同时存在，所以电泳的粒子移动距离也受电渗影响，如纸上电泳蛋白质移动的方向与电渗现象相反，则实际上蛋白质泳动的距离，等于电泳移动距离减去电渗距离。
如电泳方向和电渗方向一致，其蛋白质移动距离，等于二者相加。
蛋白质纯度鉴定的方法
蛋白质纯度鉴定的方法1. 引言在生物学和生物化学领域，蛋白质的纯度鉴定是一个重要的实验步骤。
蛋白质纯度的高低直接影响到后续实验的结果和解释。
因此，科研人员需要掌握多种方法来评估蛋白质的纯度。
本文将介绍几种常用的蛋白质纯度鉴定方法，并讨论它们的优缺点。
2. SDS-PAGESDS-PAGE（Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis）是一种常用的蛋白质分离和鉴定方法。
它利用SDS脱变性电泳，通过蛋白质分子量的差异来达到纯度鉴定的目的。
2.1 原理SDS-PAGE使用聚丙烯酰胺凝胶作为分离介质，将蛋白质根据其分子量大小进行分离。
同时，SDS（Sodium Dodecyl Sulfate）可以使蛋白质带负电荷，并且使蛋白质的二级结构失去稳定性。
经过电泳后，蛋白质分子会在凝胶中移动，较小分子量的蛋白质迁移距离较远，较大分子量的蛋白质迁移距离较短。
2.2 实验步骤1.制备凝胶：用聚丙烯酰胺和交联剂制备凝胶。
2.样品处理：将待鉴定的蛋白样品加入SDS缓冲液，并加热至95°C。
3.蛋白质加载：将样品加入凝胶孔中。
4.蛋白质电泳：将凝胶放入电泳槽，接通电源进行电泳分离。
5.凝胶染色：将凝胶染色以可视化分离的蛋白质。
2.3 优点和局限性优点： - 简单、快速、经济。
- 可以同时分离多个蛋白质样品。
- 可以定量分析蛋白质的含量。
局限性： - 只能根据分子量差异进行纯度鉴定，不能确定是否存在多个亚单位。
- 在高分子量蛋白质的分离上有一定的局限性。
- 对某些特殊蛋白质可能无法获得准确结果。
3. 负柱层析法负柱层析法（Negative chromatography）是一种根据蛋白质的净荷进行纯度鉴定的方法。
通过将样品与带有正电荷的树脂或多肽交联，蛋白质的净荷与树脂上的正离子相互吸引，从而实现纯度鉴定。
3.1 原理负柱层析法利用蛋白质的净荷特性，通过与树脂上的正离子相互吸引来分离纯化蛋白质。
蛋白质类药物含量测定的方法
蛋白质类药物含量测定的方法
蛋白质类药物含量测定有多种方法，以下是其中几种常用的方法：
1. 紫外分光光度法：蛋白质分子中含有酪氨酸和色氨酸，它们在紫外光
280nm处有最大吸收峰。
在一定浓度范围内，蛋白质溶液的吸光度值与其
浓度成正比，可以用于定量测定。
此方法操作简单、快捷，且样品可回收。
然而，此方法不适用于酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，且易受其他在280nm有吸收的物质（如核酸）干扰。
2. Bradford法：该法基于染料与蛋白质结合后改变最大吸收光，从465nm 变为595nm。
蛋白质-染料复合物具有高消光系数，提高了蛋白质测定的灵敏度（最低检出量为1μg）。
染料与蛋白质结合迅速，颜色在1小时内稳定。
一些阳离子、(NH4)2SO4、乙醇等物质不干扰测定，但大量去污剂如TritonX-100、SDS等会严重干扰测定。
3. 双缩脲法：具有两个或两个以上肽键的化合物都有双缩脲反应，蛋白质在碱性溶液中能与Cu2+络合呈紫红色，颜色深浅与蛋白质浓度成正比，故可用比色法进行测定，根据标准曲线进行计算可以确定蛋白质浓度。
除上述方法外，还有酚试剂法、考马斯亮蓝法、免疫分析法等测定蛋白质含量的方法。
在实际操作中，应根据具体药物选择合适的测定方法。
蛋白质纯度鉴定
蛋白质纯度鉴定蛋白质是生命体中必不可少的大分子有机化合物，其结构和功能各不相同，因此在研究生物学、制药学等领域中，对蛋白质的纯度鉴定十分关键。
蛋白质的纯度指的是蛋白质分子在样品中占有的总比例，它不仅关系到后续的实验和理论研究，也影响到药品的安全性和有效性。
下面，我们将针对蛋白质纯度鉴定的方法和技术展开讨论。
一、理化方法1. 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）SDS-PAGE是一种广泛应用于蛋白质纯度鉴定的方法，该方法将样品中的蛋白质分子加入一定量的阴离子表面活性剂（SDS）并使之电泳，通过分子量大小的差别将蛋白质分离出来，并用Coomassie蓝染色或银染色进行可视化。
该方法有较高的分辨率和可重复性，但需要较高的设备和试剂成本，并且只能检测到存在亚精度的杂质。
2. 高效液相色谱（HPLC）HPLC是一种高效、高精度、高灵敏度的液相色谱检测技术，能够对蛋白质样品中的杂质进行分离和检测，从而判定蛋白质的纯度。
根据不同的分离模式，HPLC可以分为离子交换、逆相、凝胶过滤、亲和层析等几种，应用范围广泛。
该方法需要专业的仪器设备和专业操作技术，但是其结果具有准确性高和可重复性强的特点。
二、免疫学方法1. ELISA法ELISA（酶联免疫吸附试验）常被应用于纯度较高的蛋白质样品的鉴定，该方法通过特异性抗体的识别并与抗原结合，从而判断蛋白质在样品中的含量。
当然，根据样品中抗原含量的不同，可以将该方法分为直接ELISA、间接ELISA、Sandwich ELISA等类型。
该法操作简便，对较小分子量蛋白质也有很好的检测效果，但是需要一定的抗体或者蛋白质结构信息。
2. Western Blotting法Western Blotting是一种通过蛋白质电泳分离，将成像膜上的蛋白质与蛋白质特异性抗体结合并进行检测的方法。
该方法常被用于验证蛋白质纯度和鉴定蛋白质的蛋白质伴侣分子等应用。
在实验操作过程中，需要较高的专业熟练程度和精准操作技巧，且耗时较长，但是其结果准确性高，能够监测低含量的蛋白质。
蛋白纯度测定
百泰派克生物科技
蛋白纯度测定
蛋白质纯度是蛋白分析中非常重要的一项理化性质参数，对于后续的实验分析具有举足轻重的作用，如果利用含有杂质的蛋白质进行后续的检测分析，会产生较大的误差，造成分析数据不准确。
因此，在进行蛋白分析前有必要对蛋白质的纯度进行评价，排除可能影响后续实验的因素。
一些蛋白类产品，特别是蛋白类药物，如疫苗、重组蛋白、抗体蛋白等，尤其要进行纯度检测，以保证其安全性和治疗效果。
目前，检测蛋白质纯度的方法有很多，如凝胶电泳法、毛细管电泳法、免疫化学法、沉降法、锌反向染色法、液相色谱法和质谱法等。
SDS-PAGE在蛋白纯度鉴定中应
用最为广泛，其检测速度快，易于分析且成本较低，是最经典的纯度测定方法。
百泰派克生物科技提供蛋白质纯度分析服务，用以检测污染物、蛋白质变体、异构体、S-S链错配、不完整蛋白产物（truncated protein）、降解蛋白、蛋白质修饰、蛋白质聚集体和蛋白质前体等，欢迎免费咨询。
蛋白质纯度鉴定
蛋白质纯度鉴定一、介绍蛋白质是生命体内的重要组成部分，其纯度鉴定是研究和应用蛋白质的基础工作。
本文将详细探讨蛋白质纯度鉴定的原理、方法以及应用。
二、蛋白质纯度鉴定的原理蛋白质纯度鉴定的原理是基于蛋白质的物化性质和分离纯化的方法。
蛋白质的物化性质包括分子量、电荷、溶解度等。
2.1 分子量鉴定蛋白质的分子量可通过SDS-PAGE、凝胶过滤层析等方法进行鉴定。
其中，SDS-PAGE是最常用的方法之一，通过对蛋白质样品进行电泳分离，根据蛋白质在凝胶中的迁移速率，可以推断出其分子量大小。
2.2 电荷鉴定蛋白质的电荷性质可以通过等电聚焦电泳进行鉴定。
等电聚焦电泳利用蛋白质在不同pH值下的电荷状态差异，通过电泳将蛋白质分离出来，可以推断出其等电点和电荷情况。
三、蛋白质纯度鉴定的方法3.1 离子交换层析法离子交换层析法是蛋白质纯度鉴定的一种常用方法。
该方法利用蛋白质与离子交换树脂之间的离子交互作用，将蛋白质从混合样品中分离出来。
通过调整溶液的离子浓度和pH值，可以控制蛋白质的结合和洗脱。
3.2 亲和层析法亲和层析法是一种基于蛋白质与亲和基质之间的特异性结合的方法。
该方法通过将具有亲和性的配体固定在层析基质上，将目标蛋白质从混合物中选择性地吸附和洗脱。
亲和层析法不仅可以用于蛋白质的分离和纯化，也可以用于蛋白质与其他分子（如小分子药物、互补的DNA或RNA）的相互作用研究。
3.3 凝胶过滤层析法凝胶过滤层析法是一种基于分子大小的分离方法。
该方法通过将混合物样品通过特定孔径的凝胶过滤膜，根据蛋白质的分子大小将其从混合物中分离。
较大分子的蛋白质无法通过孔径较小的凝胶，进而得到纯化的目标蛋白质。
3.4 透析法透析法是一种常用的蛋白质纯化和浓缩的方法。
该方法基于溶液中溶质的浓度差异，通过使用透析袋将目标蛋白质与其他分子（如盐、小分子混合物）进行分离。
透析法适用于蛋白质纯化前的提纯工作，也可以作为一种蛋白质溶液去盐和换缓冲液的方法。
评估蛋白质的纯度和质量的五个方法
评估蛋白质的纯度和质量的五个方法“蛋白质的纯度和质量对下游实验应用非常重要，糟糕的样品通常会导致许多的问题，造成实验的不准确和低精确性，有时甚至还会导致实验完全失败。
本文主要回顾在使用不好的蛋白质样本会遇到的问题，以及如何分析目的蛋白的纯度和完整性。
有许多可用的技术，可以相互配合使用，以提供最准确全面的蛋白质样品状态图。
”一、导致蛋白质样品质量差的问题1.不当的控制有时会导致蛋白质发生错误折叠、聚集或从溶液析出，这通常是一个不可逆的过程(如盐析)。
聚集和降解也会影响蛋白质的天然状态，使其无法正确地与其他蛋白质或分子结合。
有时候，肉眼也可以清楚地看到样本的聚集情况。
2.当酶失活或错误折叠时，会导致酶分析实验失败或复现性很差。
如果使用酶分析作为目的蛋白的指示，这是特别重要的。
3.蛋白质的水解除了有丢失精心构建的功能标签的风险外，也会导致上述问题。
虽然有一些试剂可以减少蛋白质样品的水解和降解，但当蛋白质储存在水溶液中时，总是存在水解的风险。
显然，投入一些时间仔细控制影响蛋白质质量的因素是很重要的，如对储存条件做一些控制，包括pH值、缓冲液、盐浓度、蛋白质浓度和储存温度等。
即使在最优的制备和储存条件下，蛋白质的质量也会随着时间而变化，所以应该定期检查蛋白质样品，以确保它们符合实验要求。
在开始使用耗时或昂贵的技术之前，花点时间检查下蛋白质的质量是值得的，从长远来看，有助于节省时间和金钱。
二、测定蛋白质纯度和质量的可靠方法一般定量：UV-Vis、Bradford法和活性测定通常，我们需要测量蛋白质样品的浓度。
紫外可见分光光度法和Bradford法是高通量的，几乎在每个生物化学实验室都使用，相对酶活性测定更粗糙些。
UV-Vis和Bradford法的检测结果取决于样本中的总蛋白质，不仅仅是目的蛋白。
而活性测定具有目标特异性，测量纯化样品中活性蛋白含量，但并不是所有的蛋白质都可以用活性分析来定量。
Abbkine为您精心推荐蛋白质定量组合方案：蛋白质定量优选方案：BCA法和Bradford法产品名称货号Protein Quantification Kit (BCA Assay) KTD3001Protein Quantification Kit (Bradford Assay) KTD3002 粒径分析：电泳和上面描述的定量方法一样，电泳也是被生物化学家广泛使用，它可以提供目标蛋白的大小以及是否存在其他蛋白质杂质的一般情况。
HPLC测定蛋白纯度
HPLC测定蛋白纯度蛋白纯度是指蛋白质样品中目标蛋白质的相对比例。
通常用百分比表示，纯度越高，说明目标蛋白质在样品中的比例越高。
蛋白纯度的测量是生物化学、分子生物学以及生物技术等领域的一个重要内容，通过测定蛋白纯度，可以评估所提取蛋白质样品的质量，为后续的实验操作提供参考。
高纯度的蛋白质样品有利于确保实验的可靠性，尤其是在研究蛋白质的功能、结构及其相互作用时。
在生物制药行业中，蛋白质纯度是一个关键参数，通过测定蛋白纯度可以优化生产工艺，从而提高产品的质量。
HPLC高效液相色谱是一种用于分离、定量和鉴定复杂混合物中各组分的色谱方法。
HPLC自20世纪60年代发展起，逐渐成为蛋白纯度测定的主流方法。
HPLC测定蛋白纯度原理基于不同蛋白质在色谱柱上的保留行为差异，如疏水作用（RP-HPLC）、离子交换作用（IEX-HPLC）或分子大小排阻（SEC-HPLC）。
这一技术利用色谱柱上的分离效果，以及一个灵敏度高的检测器，可以快速、准确地测定蛋白纯度。
百泰派克生物科技HPLC测定蛋白纯度的流程1.选择合适的HPLC柱：根据蛋白质的特性（分子量、极性、疏水性等），选择合适的色谱柱。
2.准备样品：将纯化后的蛋白样品按实验要求进行处理，如调整浓度、pH、离子强度等，避免蛋白降解、聚合等现象。
3.设定HPLC条件：根据蛋白质特性和所选色谱柱类型，设定合适的流动相、流速、梯度程序、检测波长等参数。
4.样品注入：将处理好的蛋白样品注入HPLC系统，进行色谱分析。
5.分析结果：观察色谱图谱峰的数量、形状和相对面积，评估蛋白纯度。
6.定量计算：根据色谱峰面积或高度和蛋白质的检测波长，计算蛋白质的纯度。
我们的优势。
1.高精度和高灵敏度：我们采用先进的高效液相色谱（HPLC）技术，可以在很低的浓度范围内准确检测蛋白质样品，保证了结果的精确度和可靠性。
2.应用范围广：HPLC方法适用于各种类型的蛋白质样品，包括天然蛋白、重组蛋白、修饰蛋白等，无论是单一蛋白还是蛋白混合物，我们都能提供准确的纯度分析。
如何认识蛋白质类药物纯度检测
蛋白质类药物纯度
02
的重要性
纯度的定义与意义
定义
蛋白质类药物的纯度是指药物中目标蛋白质分子的含量与总 蛋白质含量的比值。高纯度意味着药物中含有更高比例的目 标蛋白质分子，而低纯度则可能表示存在其他杂质或非目标 蛋白质分子。
意义
纯度对于蛋白质类药物的稳定性和一致性至关重要。高纯度 的蛋白质药物具有更低的免疫原性和更好的疗效，因为它们 更有可能在体内与目标细胞或受体结合并发挥作用。
纯度对药物安全性的影响
免疫反应
低纯度的蛋白质药物可能含有杂质 或其他非目标蛋白质，这些异物可能 引发免疫反应，导致患者产生抗体， 降低药物疗效，甚至引发过敏反应。
毒性风险
杂质的存在还可能增加药物的毒性风 险。一些杂质可能对人体产生不良影 响，尤其是在长期用药或大剂量用药 的情况下。
纯度对药物有效性的影响
如何认识蛋白质类药物 纯度检测
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目 录
• 蛋白质类药物概述 • 蛋白质类药物纯度的重要性 • 蛋白质类药物纯度检测方法 • 蛋白质类药物纯度检测的挑战与解决方案 • 案例分析与实战演练
蛋白质类药物概述
01
蛋白质类药物的定义与分类
定义
蛋白质类药物是以蛋白质为主要 活性成分的药物，其可以治疗、 预防或诊断疾病。
利用高效液相色谱（HPLC）、 毛细管电泳（CE）等先进分离技 术，提高蛋白质类药物与其杂质
的有效分离。
质谱技术应用
质谱技术能够提供高分辨率和高 质量精度的信息，有助于更精确地 检测和定量蛋白质类药物中的杂质 。
创新检测方法
如基于免疫原理的方法、光谱法等 ，这些方法在特异性、灵敏度和易 用性方面可能具有优势。
难。
蛋白质纯度测定
沉降速度法，能够简单并且快速非破坏性的来测定蛋白质的纯度，同时对分子质量和分子大小的比值非常灵敏。该方法的优点在于，测定范围非常的广；但局限在于，对相对分子质量相差小的样品做测定时，灵敏度低于电泳技术。
4、ห้องสมุดไป่ตู้谱法
质谱法可以直接测定一个样品中共价质量的分布，此方法能够方便简便、灵敏的测定杂质。质谱法不仅可以检测杂质的存在，还可以描述杂质的质量特征，因此质谱法常被用于鉴定杂质的来源。通过串联质谱法（MS/MS），可以鉴定共价改性修饰特征和位点。由于杂质可能与主要目标物有相似的质荷比，将质谱法与其他方法(如凝胶分离色谱)联用，可以增加样品纯度测定的准确性，达到最佳的效果。
任何方法都不能直接定量蛋白质样品的纯度。通常情况下，蛋白质纯度测定涉及评价待定杂质的含量或仅仅验证蛋白质样品中是否存在杂质。无论最终目的是为了解释分析数据、验证过程质量，还是为了确保生物制剂产品的安全性，样品纯度的测定都是至关重要的环节。
在评价样品纯度之前，首先要鉴定待测杂质的类型，如核酸、碳水化合物、脂质、无关蛋白质、同工酶类、失活蛋白质，进而确定在待测溶液中，能够区分假定杂质和目标蛋白质的理化性质(化学分析或物理特征)。纯化过程中可能已将某一杂质的浓度降低到检测限以下，但色谱峰中还有残留。毫无疑问，表观纯度取决于所选择的测定方法及其灵敏度。大多数的分离方法都能有效的去除非蛋白类杂质，下面简单介绍蛋白质样品中蛋白类杂质的检测方法。
蛋白质纯度测定
摘要：本文围绕蛋白质纯度的重要性，阐述了蛋白类杂质的检测方法，包括电泳法，色谱法，沉降速率测定法，质谱法，光散射法。任何方法都不能直接定量蛋白质样品的纯度。无论最终目的是为了解释分析数据、验证过程质量，还是为了确保生物制剂产品的安全性，样品纯度的测定都是至关重要的环节。
高效测量蛋白纯度的利器：sec测定技术的原理与优劣势
高效测量蛋白纯度的利器：sec测定技术的原理与优劣势在生物药物研究领域，准确测定蛋白质的纯度对于确保产品的质量和安全性至关重要。
蛋白质纯度不仅与其生物活性和结构稳定性密切相关，还与其在疗效和安全性方面起着重要作用。
因此，研究人员需要高效准确的分析方法来评估蛋白质样品的纯度。
SEC测定技术作为一种常用的方法，在蛋白质纯度分析中具有重要的地位。
图1。
一、原理：SEC测定技术基于蛋白质在固定相填充柱中的分子大小和构象的差异。
固定相填充柱通常由多孔性材料构成，其中较大的分子无法进入孔隙，因此会相对较快地通过柱床，而较小的分子则会更多地进入孔隙中，导致其通过柱床的时间较长。
在SEC测定中，样品溶液中的蛋白质分子会在柱中形成动态平衡。
当样品通过SEC柱时，较大的蛋白质分子会更快地通过柱床，而较小的杂质分子会相对滞留在孔隙中，从而实现纯度的分离。
最终，通过检测样品在柱床上的吸光度或荧光信号变化，可以确定蛋白质的纯度水平。
二、优劣势：1.优势：1.1高效性：SEC测定技术可以快速、有效地分离蛋白质和杂质，提供高纯度的样品。
相比其他分离技术，SEC具有较高的分辨率和分离效率。
1.2无需特殊条件：相对于其他分离技术，如离子交换色谱、亲和层析等，SEC测定技术不需要特殊的溶液条件或配体，使其更易于操作和应用。
1.3保持生物活性：SEC测定技术在分离过程中不需要高温或高浓度的溶液，因此可以更好地保持蛋白质的生物活性和结构完整性。
2.劣势：2.1不能分辨同分子量异构体：SEC测定技术无法分辨具有相同分子量但不同构象的蛋白质，例如同分子量的单体和聚合体。
在这种情况下，需要结合其他分析方法进行进一步的鉴定和分析。
2.2可能出现柱效应：柱床填充材料和柱尺寸的不同可能导致结果的变化，因此在使用SEC测定技术时需要选择合适的柱床和标准品，并严格控制实验条件。
三、应用案例：SEC测定技术在生物药物研究和生产中得到广泛应用。
以下是一些常见的应用案例：1.确定蛋白质的纯度：SEC测定技术可以快速分离蛋白质和其他杂质，如亚单位、聚合物、寡聚体等，从而确定蛋白质样品的纯度水平。
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3.9 糖蛋白中糖的分析
对糖蛋白化学结构分析的意义:
附着于蛋白质的寡糖可以上调、下调或抑制糖蛋白的 生物活性，还可以影响蛋白质的代谢命运、稳定性或 溶解性.
通过基因工程方法将一种糖蛋白在不同细胞中表达， 可以导致生产不同类型的糖蛋白。即使在相同的细胞 类型中，也可能会出现糖形成时由于一些寡糖的精细 结构不同和普通寡糖产生的相对频率不同而产生截然 不同的糖蛋白。
3.4肽图分析 概念: 意义:一级结构 ,工艺稳定性 肽图的裂解方法 : （1）化学裂解法 （2）蛋白酶裂解法 （3）特殊处理: 二硫键、空间构象较复杂的特
殊产品
肽图常用的分析方法有： （1）SDS-PAGE电泳： （2）反相HPLC(RP-HPLC)： （3）毛细管电泳： （4）液质分析：
Intens. x108 1 0 x107 2 0
重组制品原液蛋白量少，纯度高，可用 Lowry法或Bradford法测定蛋白含量。
细胞因子蛋白含量正逐步采用HPLC法， HPLC法测定蛋白含量能够排除溶剂系统的干 扰，特别适用于进行批与批之间的质量控制。
3、蛋白质药物理化性质的鉴定
3.1 特异性鉴别试验 主要确定蛋白质的抗原性 免疫学方法：根据抗原抗体特异反应建立的方法。 重组产品通常用免疫印迹和点免疫进行鉴定，特别
2.1凯氏定氮法
不需要昂贵的仪器设备，操作比较繁琐， 灵敏度较低(毫克水平)，其结果受非蛋白氮的 影响，可用钨酸沉淀法或三氯醋酸沉淀法加以 排除。
2.2 Folin-酚试剂法(Lowry法)
灵敏范围：5～100μg／ml，该方法适合蛋白质 的微量测定。
优点：方法简便，灵敏度较高，较紫外吸收法灵 敏10～20倍，较双缩脲法灵敏100倍左右。所用仪 器简单，不同蛋白质间的变异少，是蛋白质量化的 可靠方法。所需时间：约40min。目前国内外多数 重组制品原液蛋白含量用该法进行测定。
回收，但结果受光吸收物质影响。
适合于含有共轭双键较多的芳香族氨基酸的 蛋白质含量测定。
该测定方法简单、灵敏、快速，在蛋白质和酶的生化制备中 广泛应用，特别是在柱层析分离中，利用280nm进行紫外检测 来判断蛋白质吸附或洗脱情况是最常用的方法。如重组尿激酶原 (Pro-UK)的质量检测标准中的蛋白含量测定项目就采用此法完 成。
与产品相关的杂质包括：
突变物、错误裂解的产品、二硫化物异构体、 二聚体和多聚体；化学修饰的形态：脱去酰氨 基的或氧化的形态、其他降解产物等。
4.1宿主细胞蛋白含量
概念: 宿主细胞蛋白质一般简称宿主蛋白，是指生产过
程中来自宿主或培养基的残留肽等杂质。基因工程 药物中的宿主蛋白含量，可用 ELISA法(enzymelinked immunosorbent assay)测定。
缺点：
受多种物质干扰，反应速度慢，某些试剂不稳定， 蛋自质不可逆变性，芳香族氨基酸比例会影响蛋白 检测结果。
2.3 BCA法
从Lowry法派生的蛋白含量测定方法。
优点：操作比较简单，采用单一试剂4,4’-二羧酸2,2’-二喹啉(bicichoninic Acid，BCA)，终产物稳定， 比Lowry法的干扰物少；所需时间：2h或过夜。
当电泳出现两条或两条以上区带时则应该用免疫印 迹进行鉴定。 半干胶转移免疫印迹法是最常用的方法。
印迹的效率取决于蛋白质从胶上转移到膜上的效率以 及蛋白质与膜结合的效率。在印迹实验开始时，蛋白 质位于凝胶内部并带有十二烷基硫酸钠(SDS)。SDS 的负电性使得SDS蛋白复合物移向正极。在移动过程 中，SDS不断地从蛋白质上脱离。当蛋白质到达疏水 膜，一些疏水结合位点不带有SDS时，可以与膜发生 疏水互相作用。蛋白质结合到膜上，SDS不断地从蛋 白质脱离并移向正极而蛋白质则留在了膜上。
糖蛋白的糖基化分析 : 糖基化位点,分子量,糖的组成,连接方式, 分析方法: 酶解,质谱,LC/MS,GC/MS
4、残余杂质检测
残余杂质可分为外来污染物和与产品相关的杂 质两大类。
外来污染物包括：微生物污染、热原、细胞的 成分(例如细胞的蛋白质，DNA其他的组分)、 培养基中的成分、来自生产过程各步骤中的物 质、来自产品纯化步骤中的物质(亲和柱中的 抗体，其他试剂)；
3.7 N末端和C末端氨基酸测序 作为重组蛋白质和肽的重要鉴别指标，一般要 求至少测定N端15个氨基酸。在中试头三批产品 应当测定；C端定1～3个，但在我国现有法规中 C端不一定要测定。
3.8 蛋白质的二硫键分析 二硫键和巯基与蛋白质的生物活性密切相关。测
定巯基的方法有PMCB法、DTNB法和NEMI法等。对 二硫键的分析虽然在常检定项目中没有规定，但在质 量研究中应尽可能分析清楚。 有些产品二硫键较多，用现有的技术完全分析清楚很 困难，可以结合其他项目的检测，如比活性等进行有 效的质量控制。
如何认识蛋白质类药物纯度检测？
1 从蛋白质制剂中检测出少量的污染蛋白质是 很困难的。因为污染蛋白质的量可能低于很多 测定方法的检测下限。制剂中往往含有大量的 辅料。
2 当用一种方法测定蛋白质纯度时，可能有两 种或更多的蛋白质表现出相似的行为。这种类 似的行为可能会导致本来是混合物的样品也被 认为是均一物质的错误结论。
优点：快速，非破坏性，直接测定不需要标准品，不消耗样 品，低浓度的盐类不干扰测定。
缺点①如果一种蛋白不含苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸，它将无 法检测；②若样品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外光的物质，会出 现较大干扰。
2.6 ELISA法
为特异蛋白含量测定方法，具有特异性强， 灵敏度高，同时测定样品多等特点，可用于生 产过程中目标蛋白含量的测定。
3.3等电点测定 可以表征药物的理化性质和纯度 均一的重组蛋白质只有一个等电点，有时因加工 修饰等影响可出现多个等电点，但应有一定的范 围。所以等电点测定是控制重组产品生产工艺稳 定性的重要指标。
常用的测定方法: 等电聚焦电泳法(IEF)： 毛细管电泳法(CE)：该法用紫外检测，适用于某些不 易染色的蛋白质多肽，如EGF、hCGRP等制品的测 定。 标准中等电点的规定: 等电点标准应规定为在±0.5pH范围之内，应有明 显的主显带。
5 没有一个真正的检验纯度的方法，只有检 测样品不纯或非均一的方法。
1.1非还原SDS-PAGE电泳法 银染法染色，加样量不低于5μg。 考马斯亮蓝R-250染色，加样量不低于10μg。 结果应无明显杂蛋白出现，经扫描仪扫描，蛋白量 应不低于总蛋白量的95％或98％。
1.2 HPLC法(分子筛层析、反相HPLC、离子交换层析等)
加入样品及PECP对照标准培养，37℃放置2小时．
３加抗体：
经洗涤后，加入抗PECP/HRP结合物(antiPECP/HRP conjugate)[HRP为辣根过氧化物酶 (horseradish peroxidase)的简称]使其与固相抗体 结合。
五、蛋白质药物质量控制的要点
1、蛋白质纯度检查 2、蛋白质含量测定 3、蛋白质药物理化性质的鉴定 4、残余杂质检测
1、蛋白质纯度检查
世界卫生组织规定必须用HPLC和非还原SDSPAGE两种方法测定，其纯度都应达到95%以上才 能合格。
某些重组药物的纯度要求更高，要达到99％以 上。
纯度的检测通常是在原液(drug subs-58和Cys-105形成的二硫键， Cys-125是以游离巯基形式存在。
错误配对，生物活性原来的1／400，会引起抗原性增 强。
分析：pH8.5下用3H-碘乙酸处理IL-2，使游离巯基与 3H-碘乙酸作用形成衍生物。然后再还原打开二硫键， 并用14C-碘乙酸处理，结果3H-标记仅在肽-11上 (Cys-125)，而肽-11基本上无14C放射性。相反14C 的放射性全在肽-12和肽-14上(Cys-58与Cys-105的 二硫键位置上)。
2.7 HPLC法 具有定量精确，灵敏度高，重复性好，自动化
程度高等特点。 需要同种蛋白做标准品。
2.8 SDS-PAGE-CBB G250(Coomassie brilliant blue G-250,CBBG ) 染色-比色法
结合Lowry法等总蛋白含量的测定，可用于 复杂的蛋白混合物中目标蛋白的定量测定。
m4A00U 200 x1007
1
0 x107
0 0
SHENG--0.D: TIC ±All MS SHENG--0.D: BPC 50-1800 ±All MS SHENG--0.D: UV Chromatogram, 215 nm
SHENG--0.D: EIC 1045.5 ±All MS SHENG--0.D: EIC 1023.5 ±All MS
2、蛋白质含量测定
在质量标准中设定此项目主要用于原液比活性计 算和成品(drug product)规格的控制。
蛋白含量采用Folin-酚试剂法(Lowry法)、染色 法(Bradford法)、双缩脲法、紫外吸收法、HPLC法 和凯氏定氮等方法。
其中Lowry法和Bradford法是在质量检定中经常 使用的方法。
10
20
30
40
50
60
Time [min]
3.5 吸收光谱 某一重组蛋白质来说，其最大吸收波长是固定的； 在生产过程中每批产品的紫外吸收光谱应当是一致的。 有的重组产品一级结构不含芳香族氨基酸，在280nm 附近没有最大吸收峰，可不做紫外吸收光谱测定， 如重组脑利钠肽(rhBNP)。
3.6 氨基酸组成分析 是结构分析的辅助手段,质量控制的重要指标. 在生产的控制中,样品的氨基酸组成结果应与标 准品一致。 这在试生产的头三批或工艺改变时应当测定。
缺点：反应时间长，蛋白质不可逆变性。灵敏范围： 标准分析：10～1200μg／mi；微量分析： 0.5~10μg／ml。
2.4 Bradford法
Bradford法是采用考马斯亮蓝G-250与蛋白 质结合的原理，迅速、敏感的定量测定蛋白质的 方法。需要时间；10min。灵敏范围：25～ 200μg／ml；0.1ml的最小体积可测得的最低蛋 白为2.5μg。