核酸分子杂交技术PPT课件
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（2）常用的封闭物有两类：即非特异性DNA和高分 子化合物。如鲑精DNA或小牛胸腺DNA，Denharts溶 液或脱脂奶粉
1、能进行双链DNA、单链DNA或RNA探针的标记
2、操作简单方便，避免因DNaseI处理浓度掌握不 当所带来的一系列问题
3、标记活性高，标记活性可达108cpm/µgDNA以 上
4、可直接在低熔点琼脂糖溶液中进行标记
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PCR标记法：将标记的核苷酸作为PCR反
应的底物，以待标记的DNA为模板，经 PCR反应，标记的核苷酸掺入到新合成的DNA分 子中
同，不同的是上述采用洗脱的方式纯化探针，而此
法则是利用离心的方式来纯化探针
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二、影响杂交的因素
1、核酸分子的浓度和长度： 浓度越大，复性速度越快 分子越大，复性速度越慢 单链探针，浓度增加，杂交效率增加 双链探针，浓度控制在0.1~0.5μg,浓度过高影响杂 交效率
2、温度： （1）DNA/DNA杂交，适宜温度较Tm值低20~25℃ （2）RNA/DNA或RNA/RNA杂交，加甲酰胺降低 Tm值 （3）用寡核苷酸探针杂交，适宜温度较Tm值低5℃
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体外标记法： 化学标记法：标记物分子上的活性基团与 探针分子上的某些基团反应， 标记物直接结合到探针分子上 酶促标记法：标记物预先标记核苷酸，然 后利用酶促法将标记的核苷酸 掺入到探针上
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酶促标记法 切口平移法（nick translation)
①利用DNase I在DNA双链上造成单链切口
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（三）探针的纯化
1、乙醇沉淀法：无水乙醇可以沉淀DNA片段，可 去除dNTP和蛋白质
2、凝胶过滤柱层析法：利用凝胶的分子筛作用，将 大分子DNA和小分子dNTP、磷酸根离子及寡核苷 酸（<80bp)等物质分离，常用凝胶基质是Sephadex G-50
3、微柱离心法：其原理与上述凝胶过滤柱层析法相
• 基因组DNA探针 • cDNA探针 • RNA探针 • 寡核苷酸探针
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2、标记物
放射性同位素标记法 如32P、3H、 35S
非放射性同位素标记法 如金属、半抗原、 荧光素
3、标记的方式 体内标记法 体外标记法
化学标记法
酶促标记法
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➢ 最常用的核酸探针 ➢ 长度在几百碱基对以上的双链DNA或单链DNA探针 ➢ 多为某一基因的全部或部分序列，或某一非编码序列 ➢ DNA片段须是特异的（仅与靶DNA或RNA结合） ➢ 来源广泛（微生物或动物、人类的细胞）
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逆转录酶的 DNA聚合酶
逆转录酶的 RNase H
分解mRNA
DNA 聚合 酶
第二条CDNA链
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1、RNA探针是单链分子，与靶序列的杂交反应效率高。 2、早期采用的RNA探针是细胞mRNA探针和病毒RNA探
针，这些RNA是在细胞基因转录或病毒复制过程中 得到标记的，标记效率不高，且受到多种因素的制 约。 3、体外逆转录可高效合成RNA，加入标记物可成为探 针 4、应用：例如，在筛选逆转录病毒人类免疫缺陷病 毒（HIV）的基因组DNA克隆时，因无DNA探针可利 用，就利用HIV的全套标记mRNA作为探针，成功地 筛选到多株HIV基因组DNA克隆。
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（二）探针的标记 1、理想标记物应具备的特性： • 高度灵敏性 • 不影响碱基配对的特异性 • 不影响探针分子的主要理化性质 • 对酶促反应活性无影响或影响不大 • 检测方法具有高度灵敏性和高度特异性
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2、标记物 （ 1） 理想标记物应具备的特性：
• 高度灵敏性 • 不影响碱基配对的特异性 • 不影响探针分子的主要理化性质 • 对酶促反应活性无影响或影响不大 • 检测方法具有高度灵敏性和高度特异性
分子生物学检测技术
核酸分子杂交技术 PCR技术
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核酸分子杂交技术
一、 核酸分子杂交的定义及基本原理 • 定义：
具有互补序列两条单链核酸分子在一定条件下 按碱基互补配对原则退火形成双链的过程。 •杂交有固一液相杂交和液相杂交。
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变性
复性
DNA-DNA 杂交双链分子
（一）探针的种类 1、根据组成分类
其原理是随机引物能与各种单链DNA模板结合， 作为合成新链的引物，在DNA聚合酶的催化下， 按53方向合成一新的DNA链，其核苷酸序列与 模板DNA完全互补。另一单链DNA模板同样合成 一条新的完全互补的DNA链。合成时，带放射性 核素标记的核苷酸掺入到新合成的DNA分子中
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随机引物法所具有的优点：
（2）如待测核酸序列与探针同源性高时，则用水溶 液在68℃杂交
5、核酸分子的复杂性：
（1）核酸的复杂性是指存在于Baidu Nhomakorabea应体系中不同顺序 的总长度
（2）Cot½与反应体系中核酸复杂性成正比
（3）两个DNA样品浓度绝对一致时，变性后的相对 杂交率取决于DNA的相对复杂性
6、非特异性杂交反应：
（1）杂交前封闭非特异性杂交位点，减少其对探针 的非特异性吸附
② 利用大肠杆菌DNA聚合酶I的53核酸外 切酶活性在切口处将旧链从5末端逐步切除
③ 在DNA聚合酶I的53聚合酶催化下，以 互补的DNA单链为模板依次将dNTP连接到切 口的3末端-OH上，合成新的DNA链，同时将 标记的核苷酸掺入到新的DNA链中
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随机引物法
3、离子强度：
（1）低盐浓度时杂交率较低，随着盐浓度增加，杂 交率增加
（2）高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定，当进 行序列不完全同源的核酸分子杂交时，必须维持杂交 反应液中较高的盐浓度和洗膜溶液的盐浓度
4、甲酰胺：
（1）甲酰胺能降低核酸杂交的Tm值，能降低杂交 液的温度，低温时探针与待测核酸杂交更稳定，当待 测核酸与探针同源性不高时，加50%甲酰胺溶液在 35~42 ℃杂交
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（3）标记物种类 • 核素标记物：32p、35s、3H • 非核素标记物 半抗原：生物素、地高率 配体：生物素是亲和素的配体 荧光素：异硫氰酸荧光素、罗丹明等 化学发光探针：标记物与某种底物反应发光， 如生物素酰化的碱性磷酸酶 可使发光底物发光
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（3）标记方法
体内标记法：将核素标记的化合物作为合成代 谢的底物，在细胞合成代谢时使 核素掺入到新合 成的核酸分子中，如3H-胸苷可掺入到DNA中， 3H-尿苷可掺入到RNA中
1、能进行双链DNA、单链DNA或RNA探针的标记
2、操作简单方便，避免因DNaseI处理浓度掌握不 当所带来的一系列问题
3、标记活性高，标记活性可达108cpm/µgDNA以 上
4、可直接在低熔点琼脂糖溶液中进行标记
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PCR标记法：将标记的核苷酸作为PCR反
应的底物，以待标记的DNA为模板，经 PCR反应，标记的核苷酸掺入到新合成的DNA分 子中
同，不同的是上述采用洗脱的方式纯化探针，而此
法则是利用离心的方式来纯化探针
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二、影响杂交的因素
1、核酸分子的浓度和长度： 浓度越大，复性速度越快 分子越大，复性速度越慢 单链探针，浓度增加，杂交效率增加 双链探针，浓度控制在0.1~0.5μg,浓度过高影响杂 交效率
2、温度： （1）DNA/DNA杂交，适宜温度较Tm值低20~25℃ （2）RNA/DNA或RNA/RNA杂交，加甲酰胺降低 Tm值 （3）用寡核苷酸探针杂交，适宜温度较Tm值低5℃
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体外标记法： 化学标记法：标记物分子上的活性基团与 探针分子上的某些基团反应， 标记物直接结合到探针分子上 酶促标记法：标记物预先标记核苷酸，然 后利用酶促法将标记的核苷酸 掺入到探针上
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酶促标记法 切口平移法（nick translation)
①利用DNase I在DNA双链上造成单链切口
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（三）探针的纯化
1、乙醇沉淀法：无水乙醇可以沉淀DNA片段，可 去除dNTP和蛋白质
2、凝胶过滤柱层析法：利用凝胶的分子筛作用，将 大分子DNA和小分子dNTP、磷酸根离子及寡核苷 酸（<80bp)等物质分离，常用凝胶基质是Sephadex G-50
3、微柱离心法：其原理与上述凝胶过滤柱层析法相
• 基因组DNA探针 • cDNA探针 • RNA探针 • 寡核苷酸探针
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2、标记物
放射性同位素标记法 如32P、3H、 35S
非放射性同位素标记法 如金属、半抗原、 荧光素
3、标记的方式 体内标记法 体外标记法
化学标记法
酶促标记法
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➢ 最常用的核酸探针 ➢ 长度在几百碱基对以上的双链DNA或单链DNA探针 ➢ 多为某一基因的全部或部分序列，或某一非编码序列 ➢ DNA片段须是特异的（仅与靶DNA或RNA结合） ➢ 来源广泛（微生物或动物、人类的细胞）
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逆转录酶的 DNA聚合酶
逆转录酶的 RNase H
分解mRNA
DNA 聚合 酶
第二条CDNA链
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1、RNA探针是单链分子，与靶序列的杂交反应效率高。 2、早期采用的RNA探针是细胞mRNA探针和病毒RNA探
针，这些RNA是在细胞基因转录或病毒复制过程中 得到标记的，标记效率不高，且受到多种因素的制 约。 3、体外逆转录可高效合成RNA，加入标记物可成为探 针 4、应用：例如，在筛选逆转录病毒人类免疫缺陷病 毒（HIV）的基因组DNA克隆时，因无DNA探针可利 用，就利用HIV的全套标记mRNA作为探针，成功地 筛选到多株HIV基因组DNA克隆。
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（二）探针的标记 1、理想标记物应具备的特性： • 高度灵敏性 • 不影响碱基配对的特异性 • 不影响探针分子的主要理化性质 • 对酶促反应活性无影响或影响不大 • 检测方法具有高度灵敏性和高度特异性
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2、标记物 （ 1） 理想标记物应具备的特性：
• 高度灵敏性 • 不影响碱基配对的特异性 • 不影响探针分子的主要理化性质 • 对酶促反应活性无影响或影响不大 • 检测方法具有高度灵敏性和高度特异性
分子生物学检测技术
核酸分子杂交技术 PCR技术
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核酸分子杂交技术
一、 核酸分子杂交的定义及基本原理 • 定义：
具有互补序列两条单链核酸分子在一定条件下 按碱基互补配对原则退火形成双链的过程。 •杂交有固一液相杂交和液相杂交。
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变性
复性
DNA-DNA 杂交双链分子
（一）探针的种类 1、根据组成分类
其原理是随机引物能与各种单链DNA模板结合， 作为合成新链的引物，在DNA聚合酶的催化下， 按53方向合成一新的DNA链，其核苷酸序列与 模板DNA完全互补。另一单链DNA模板同样合成 一条新的完全互补的DNA链。合成时，带放射性 核素标记的核苷酸掺入到新合成的DNA分子中
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随机引物法所具有的优点：
（2）如待测核酸序列与探针同源性高时，则用水溶 液在68℃杂交
5、核酸分子的复杂性：
（1）核酸的复杂性是指存在于Baidu Nhomakorabea应体系中不同顺序 的总长度
（2）Cot½与反应体系中核酸复杂性成正比
（3）两个DNA样品浓度绝对一致时，变性后的相对 杂交率取决于DNA的相对复杂性
6、非特异性杂交反应：
（1）杂交前封闭非特异性杂交位点，减少其对探针 的非特异性吸附
② 利用大肠杆菌DNA聚合酶I的53核酸外 切酶活性在切口处将旧链从5末端逐步切除
③ 在DNA聚合酶I的53聚合酶催化下，以 互补的DNA单链为模板依次将dNTP连接到切 口的3末端-OH上，合成新的DNA链，同时将 标记的核苷酸掺入到新的DNA链中
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随机引物法
3、离子强度：
（1）低盐浓度时杂交率较低，随着盐浓度增加，杂 交率增加
（2）高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定，当进 行序列不完全同源的核酸分子杂交时，必须维持杂交 反应液中较高的盐浓度和洗膜溶液的盐浓度
4、甲酰胺：
（1）甲酰胺能降低核酸杂交的Tm值，能降低杂交 液的温度，低温时探针与待测核酸杂交更稳定，当待 测核酸与探针同源性不高时，加50%甲酰胺溶液在 35~42 ℃杂交
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（3）标记物种类 • 核素标记物：32p、35s、3H • 非核素标记物 半抗原：生物素、地高率 配体：生物素是亲和素的配体 荧光素：异硫氰酸荧光素、罗丹明等 化学发光探针：标记物与某种底物反应发光， 如生物素酰化的碱性磷酸酶 可使发光底物发光
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（3）标记方法
体内标记法：将核素标记的化合物作为合成代 谢的底物，在细胞合成代谢时使 核素掺入到新合 成的核酸分子中，如3H-胸苷可掺入到DNA中， 3H-尿苷可掺入到RNA中