作业指导书-耐药基因型检测

耐药基因型检测操作规程作业指导书

1目的

本操作规程是关于使用in-house方法进行耐药性检测过程标准操作和结果分析保存的规程。

2适用范围

适用于HIV-1耐药基因型测定。

3职责

在使用in-house方法进行耐药性检测过程中，研究人员必须依照本标准操作规程进行操作。

4作业程序

4.1核酸提取：推荐使用QIAGEN公司QIAamp Viral RNA Mini Kit 提取RNA。

4.2引物

4.2.1 扩增引物

第一轮PCR：

外侧上游引物MAW 26：5’-TTGGAAATGTGGAAAGGAAGGAC-3’; HXB2 2028-2050 外侧下游引物RT21：5’-CTGTA TTTCTGCTA TTAAGTCTTTTGA TGGG-3’; HXB2 3509-3539

第二轮PCR：

内侧上游引物PRO-1 ：5’-CAGAGCCAACAGCCCCACCA-3’; HXB2 2147-2166

内侧下游引物RT20 ：5’-CTGCCAGTTCTAGCTCTGCTTC-3’; HXB2 3441-3462

4.2.2 测序引物

正向测序引物：

PROS3 ：5’-GCCAACAGCCCCACCA-3’

RTAS ：5’-CTCAGA TTGGTTGCAC-3’

RTB ：5’-CCTAGTATAAACAATGAGACAC-3’; HXB2 2946-2967

反向测序引物：

PROC1S ：5’-GCTGGGTGTGGTA TTCC-3’

RT20S3 ：5’-GTTCTAGCTCTGCTTC-3’

参照国际标准株HXB2株（全基因1-9719bp）POL基因序列(2253-5096bp)，其中蛋白酶(2253-2549bp)，逆转录酶基因(2250-4229bp)，整合酶基因(4230-5096bp)。我们所使用的方法扩增产物长度为1.3kb，包括蛋白酶基因全长（1-99 codon）和逆转录酶基因前300个氨基酸(1-300 codon)。

4.3准备RT-PCR（逆转录及第一轮PCR）反应体系：在PCR准备间安全柜

内进行，注意配置过程应在冰上进行。推荐使用Takara One Step RNA PCR Kit(AMV)，总体系25μl，见下表：

4.3.1将除酶以外的试剂取出置于室温，待其溶化后震荡混匀5秒钟，短暂离心后置于

冰上备用。

4.3.2酶及逆转录酶抑制剂取出置于冰上，使用后立即放回-20℃保存。

4.3.3准备PCR管，管身标记清楚编号，置于冰上备用。

4.2.4使用1.5ml离心管配制RT-PCR反应体系（单位μl），按每管20μl将配制好的反

应体系分装至PCR管中，注意将液体加至管底。

4.4RT-PCR（逆转录及第一轮PCR）

4.4.1将分装好的PCR管拿到加样间，分别将样本RNA、阳性对照样本RNA及阴性对

照样本RNA各5μl加入相应PCR管中。注意不要发生交叉污染。

4.42 将混合物混匀并短暂离心后放入PCR仪中，设定程序：

50℃ 30分钟；94℃ 5分钟；

94℃ 30秒，55℃ 30秒，72℃ 2分30秒，30 cycles；

72℃ 10分钟，4℃保温。

运行程序。

4.5 第二轮PCR

4.5.1 在PCR准备区配制反应体系，注意配置过程应在冰上进行。推荐使用Takara

Perfectshot TM Ex Taq Mix，总体系50μl，见下表：

4.5.2 反应体系的配制同RT-PCR。体系配制完成后，按照每管45μl将配制好的反应体

系分装到PCR管中。

4.5.3将分装好的PCR管拿到加样间，将第一轮反应产物各5μl加入相应的PCR管中，

将混合物混匀并短暂离心后放入PCR仪，设定反应程序：

94℃ 5分钟；

94℃ 30秒，63℃ 30秒，72℃ 2分钟30秒，30 cycles；

72℃ 10分钟,4℃保温。

运行程序。

4.6 PCR扩增产物电泳鉴定

4.6.1于三角烧瓶中称取1g琼脂糖，加入100ml 1×TAE溶液,配成1%的胶溶液，置于

微波炉中，中火加热3分钟，冷却到60℃左右时加入5ul 1%的EB溶液混匀。4.6.2洗净的电泳板和梳子擦干，倒入溶胶液，使胶的厚度达到0.5cm左右。室温下放

置至少40分钟以上,使胶彻底凝固。

4.6.3待胶凝好后缓慢拔出梳子，放入电泳槽，倒入1×TAE，使液面高出胶平面1mm

左右。

4.6.4取第二轮PCR产物5ul缓慢加入电泳孔中。（若反应体系中不含Loading Buffer则

于玻璃纸上滴点10×上样缓冲液，每滴约1ul，取第二轮PCR产物5ul 与10×上样缓冲液液滴混匀后缓慢加入电泳孔中。）同时在电泳孔中加入 5 ul分子量为2000的Marker，判断PCR扩增产物的正确位置。

4.6.5电泳仪电压设量为100v，恒压电泳，40分钟左右观察结果。

4.6.6将电泳后的胶从胶板上取下，置于紫外透射反射仪上观察电泳胶中期望的PCR产

物条带并拍照。

4.6.7挑取PCR阳性样本用于扩增产物的纯化回收，同时应该暂时保存第一轮PCR产物

（-20C）以备必要时进行再次扩增。

4.7 PCR扩增产物纯化

此步骤用于将PCR产物纯化并回收，用于回收的样品应经电泳检测无明显拖尾，并且有足够的浓度，回收的样品DNA也应符合无明显拖尾、杂带的标准才可用于测序。4.7.1方法如上配置2%的琼脂糖凝胶,使胶的厚度达到1cm左右.室温下放置至少40分

钟以上, 待胶彻底凝固后将剩余45ul PCR产物全部加入电泳孔中。（于剩余45ul PCR产物的PCR管中加入10×上样缓冲液5ul, 混匀后将第二轮PCR产物全部加入电泳孔中。）

4.7.2 PCR产物2%琼脂糖凝胶电泳, 恒压100v 1小时（具体电泳时间以将目的条带和其它

混杂条带分开为准）。

4.7.3 用干净的手术刀将含有PCR产物的琼脂糖凝胶切下置于1.5mlPCR管中，胶块重量控

制在0.1克左右。注意在切胶时应在胶下铺一层PE手套，以防止刀片损坏紫外灯。

4.7.4 称量胶块的重量，然后依据QIAquick Gel Extraction试剂盒操作说明进行纯化。

4.8 测序

4..9 序列结果贴网分析(Stanford HIV Drug Resistance Database使用规程)