作业指导书-耐药基因型检测
鲍曼不动杆菌及其耐药基因的检测
鲍曼不动杆菌及其耐药基因的检测目的探索一种检测鲍曼不动杆菌及其耐药基因的新方法。
方法首先对近几年医院内鲍曼不动杆菌的耐药情况进行分析，选择临床上治疗鲍曼不动杆菌的首选药，再采用聚合酶链反应对鲍曼不动杆菌及其突变株进行检测。
结果鲍曼不动杆菌对亚胺培南的耐药率最低，为9.37%，OXA-51基因扩增结果与细菌培养相符，OXA-23基因扩增与鲍曼不动杆菌耐亚胺培南的结果相符。
结论采用PCR法对OXA-51基因扩增可以检测是否存在鲍曼不动杆菌，采用PCR法对OXA-23基因扩增可以检测鲍曼不动杆菌是否存在亚胺培南耐药性。
从而快速检测鲍曼不动杆菌及其耐药基因，指导临床用药。
标签：细菌；耐药性；聚合酶链反应；鲍曼不动杆菌随着抗生素的长期使用，耐药菌不断出现，特别是多重耐药菌的出现已引起社会的广泛重视。
2011年初卫生部专门发文要求各级医院重视多重耐药菌的监测。
而鲍曼不动杆菌（acinetobacter baumannii，Ab）是主要引起医院感染的多重耐药菌之一。
鲍曼不动杆菌为条件致病菌，可引起多种临床感染，其分离率在非发酵菌中仅次于绿脓假单胞菌，常导致严重的医院感染如菌血症、脑膜炎或肺炎。
由于抗生素的过度使用，使得鲍曼不动杆菌产生多重耐药[1-11]，甚至出现了泛耐药株，且耐药性呈逐年上升趋势，已引起人们的关注。
鲍曼不动杆菌对青霉素类、头孢菌素、环丙沙星、复方新诺明等耐药率均超过80%，对亚胺培南、头孢哌酮/舒巴坦敏感性较高。
目前主要采用培养方法[12]进行检测，而其他检测方法的临床应用还未见。
本研究首先对近几年医院内鲍曼不动杆菌的耐药情况进行分析，选择临床上治疗鲍曼不动杆菌的首选药，然后采用聚合酶链反应对鲍曼不动杆菌及其突变株进行检测，同时采用培养法进行联合检测。
以指导临床用药、防治院内感染的蔓延。
1 资料与方法1.1 菌株来源从2009年6月～2011年12月本院患者送检的标本（痰液、咽拭子、脓液、尿液、胸水、血液）中共分离到鲍曼不动杆菌32株（经德灵公司AUTO Scan4全自动细菌鉴定系统鉴定确认）。
乙肝病毒耐药基因测序
SAP MIX的作用
外切酶Exon I 降解定量PCR产物中残 留的单链PCR引物。SAP酶除去定量PCR产物 中残存的脱氧核苷三磷酸的磷酸基团，从 而达到纯化定量PCR产物的目的。
经过SAP MIX 酶解纯化后的定量产物方 可以进行后面的测序PCR反应。
测序PCR循环条件
96℃ 1min → (96℃ 10sec , 50℃ 5sec , 60℃ 4min) ×25 cycles →4℃恒温。
拉米夫定（LAM） 阿德福韦（ADV） 恩替卡韦（ETV)
替比夫定（LDT)
rtV173L rtL180M rtM204V/I/S rtV207I/L/G rtS213T
rtA181V/T/S rtV214A rtQ215S rtN236T rtP237H rtN/H238T/D
rtT184A/I/S rtS202G/I rtM204V/I/S rtM250L/V
↑ 204位点（YIDD）
耐药突变位点命名
• 命名体系将HBV聚合酶蛋白划分成4个区域：终蛋白区、 间蛋白区、rt区和RNA酶区，每个区的氨基酸分别计算位 码。rt区起始于高度保守的EDWGPC DEHG位点，包含 344个氨基酸，拉米夫定治疗相关的变异主要发生在该区， 包括rtL180M和rtM204V/I等。新命名体系包括4个部分， 即所属区域、治疗前氨基酸、变异位码和变异氨基酸，如 rtL180M表示变异发生在rt区的180位点，亮氨酸（L）被 蛋氨酸（M）所取代。应当指出的是，发生变异不一定耐 药，只有当变异株成为优势株时才发生耐药。
• HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者，1、2、3 年时的耐药发生率分别为0%、1.6%、 3.1% • HBeAg阴性者1、2、3年的耐药发生率分 别为0%、3.0%、5.9%~11%
菌种耐药基因的检测流程
菌种耐药基因的检测流程英文回答：Antimicrobial Resistance Gene Detection Workflow.Antimicrobial resistance (AMR) is a major public health concern, as it can lead to infections that are difficult or impossible to treat with conventional antibiotics. The emergence and spread of AMR genes pose a serious threat to human health. Therefore, it is crucial to detect and monitor the presence of AMR genes in bacterial populations to inform infection control and antimicrobial stewardship practices.The workflow for AMR gene detection typically involves the following steps:1. Sample collection and preparation: The first step involves collecting relevant samples, such as clinical specimens (e.g., blood, urine, sputum) or environmentalsamples (e.g., water, soil). The samples are then processed to extract DNA, which contains the genetic information of the bacteria.2. DNA extraction: DNA extraction is the process of isolating DNA from the collected samples. Various methods can be used for DNA extraction, including mechanical, chemical, and enzymatic methods. The extracted DNA is then purified to remove impurities and contaminants.3. PCR amplification: Polymerase chain reaction (PCR) is a molecular technique used to amplify specific regions of DNA. In AMR gene detection, PCR is used to amplify the target AMR genes. This process involves using specific primers that bind to the flanking regions of the target gene, allowing for its amplification.4. Sequencing: PCR amplicons can be sequenced to determine the exact sequence of the target AMR gene. Sequencing technologies, such as Sanger sequencing or next-generation sequencing (NGS), are used to read the sequence of nucleotides in the DNA fragment.5. Data analysis: The sequenced data is analyzed to identify the presence of AMR genes and determine their specific types and variants. Bioinformatics tools and databases are used to compare the obtained sequences with known AMR gene sequences and identify any matches or similarities.The workflow for AMR gene detection is crucial for understanding the prevalence and spread of AMR genes. It provides valuable information that can guide infection control measures, antibiotic selection, and the development of new antimicrobial agents.中文回答：菌种耐药基因的检测流程。
抗菌素耐药基因的检测及耐药机制研究
抗菌素耐药基因的检测及耐药机制研究抗菌素是治疗感染疾病的主要手段，但是随着抗生素的大量使用，抗菌素耐药性也逐渐出现。
为了防止细菌耐药性的发展，科学家们正在努力研究抗菌素耐药基因及其耐药机制。
一、抗菌素基因的检测抗菌素耐药基因是指影响细菌抵抗某种抗生素作用的基因，通过检测这些基因可以判断细菌的耐药性。
目前，常用的检测方法包括荧光PCR、基因测序和微阵列技术等。
其中，荧光PCR是一种快速、准确的检测方法，通过合成荧光探针与PCR扩增产物结合，可以在荧光探针检测设备上实现检测结果的自动读取和分析。
基因测序则可以对目标基因进行全面准确的检测，但是时间和费用较高。
微阵列技术则可以同时检测多种基因及其变异情况，但是需要一定的前期准备及数据分析能力。
二、抗菌素耐药机制的研究1.靶标的改变抗生素的作用通常是通过靶标蛋白的结合来发挥作用。
当细菌的靶标发生改变，导致抗生素无法与其结合，从而失去抗生素的作用。
例如，β-内酰胺类药物作用的靶标为细菌的细胞壁酶，当β-内酰胺酶基因发生变异，就会导致β-内酰胺类药物对此类细菌失效。
2.外排泵的增加外排泵是一种能够将细菌内部的抗生素外泄的蛋白质，外排泵的活力水平与耐药性密切相关。
当细菌的外排泵增加时，外泄的抗生素也随之增加，这就导致抗生素的浓度低于细菌所能够耐受的水平。
3.代谢酶的增加细菌通过代谢酶代谢抗生素可以降低其药物浓度。
一些耐药菌株通过增加代谢酶的数量来增强其代谢抗生素的能力。
三、抗菌素耐药机制的防治抗菌素耐药性的出现影响了感染性疾病的治疗效果，为了解决这一问题，防治抗菌素耐药性成为当前的重要课题之一。
1.合理使用抗生素在治疗感染疾病时，应该根据细菌的特性和抗生素的敏感性进行选择，避免过度或滥用抗生素。
合理使用抗生素能够避免抗生素耐药性的产生。
2.加强环境卫生环境污染对细菌的繁殖和传播起到重要作用。
加强医疗机构和社区的环境卫生，可以减少细菌传播的机会，降低细菌耐药性的产生。
医院感染与病原菌耐药基因的检测与监控
医院感染与病原菌耐药基因的检测与监控近年来，医院感染问题不容忽视，给患者和医疗机构带来了严重的负担。
医院感染的发生与病原菌耐药基因的存在密切相关。
因此，对医院感染及病原菌耐药基因的检测和监控变得尤为重要。
医院感染是指在医疗机构内接受治疗的患者因接触感染源而被感染的疾病。
在医院感染中，病原菌是主要的感染源。
而且，抗生素的滥用和不当使用往往导致病菌的耐药性增加，使治疗难度进一步提高。
为了减少医院感染的发生和控制感染源，医院需要进行病原菌耐药基因的检测与监控，从而及时采取相应的预防措施。
一般而言，病原菌耐药基因的检测主要通过以下几种方法：首先，传统的菌种培养与鉴定方法：该方法通过将患者样本进行培养与纯化，然后通过培养基的选择与菌株的形态特征进行鉴定。
这种方法可以得到准确的菌株信息，但是其过程时间长，并且无法迅速获取耐药基因信息。
其次，基因检测技术：现代生物技术的发展为病原菌耐药基因的检测提供了更加便捷和高效的方法。
例如，聚合酶链式反应（PCR）技术可以通过扩增特定基因片段，快速检测出耐药基因的存在。
此外，核酸杂交、基因芯片等技术也被广泛应用于病原菌耐药基因的检测与监控。
此外，现代生物信息学的发展也使得大规模的基因组学研究成为可能。
通过对病原菌基因组的测序与分析，可以全面了解病原菌的耐药基因情况，为医院感染的预防与控制提供有力的参考。
医院感染与病原菌耐药基因的监控同样重要。
通过监控病原菌耐药基因的变化趋势，医疗机构可以及时调整抗生素的使用策略，并采取相应的感染控制措施，从而有效降低医院感染的发生率。
现在已经有一些医院开展了医院感染及病原菌耐药基因的监测工作，并取得了一定的成果。
这些经验表明，医院感染与病原菌耐药基因的检测与监控能够有效预防和控制医院感染的发生，提高医疗质量，并保障患者的生命安全。
总之，医院感染与病原菌耐药基因的检测与监控是现代医疗质量管理的重要组成部分。
通过合理的检测方法和监控措施，可以减少医院感染的发生，保障患者的利益。
检验科细菌耐药性监测标准操作程序SOP文件
检验科细菌耐药性监测SOP文件一、耐甲氧西林葡萄球菌（Methicillin-Resistant Staphylococci,MRS）MRS是引起临床感染的常见病原菌，同时也是引起医院感染的重要病原菌之一，其耐药特点是耐受甲氧西林的同时，还对临床广泛应用的多种抗生素呈现多重耐药，因而该菌所致感染已成为临床治疗的一大难题。
（一）MRS测定方法1、纸片扩散法接种物：直接悬液法从非选择琼脂平皿上挑取少许单个菌落至无菌生理盐水调至浓度0.5 McFarland,具体操作同常规纸片法药敏试验。
苯唑西林纸片，1R g/片，检测MRS平板应置于35℃ （而不是37℃）孵育24h （而不是16〜18h）。
结果判断：金黄色葡萄球菌：S：三13mm；I：11〜12mm；R:W10mm。
凝固酶阴性葡萄球菌：S：三18mm；R W17mm。
对于苯唑西林纸片周围的抑菌圈内有任何小菌落或稀薄“菌膜”生长都应列为MRS。
2、琼脂筛选法：如果纸片试验结果中介时，可做琼脂筛选法，培养基为MH琼脂+6R g/ml苯唑西林+4%NaCl,调整菌液浓度0.5McFarland,于35℃孵育24h,凡有任何生长即使一个菌落均报MRS。
（二）MRS监测意义对于MRS,应报告对所有头抱菌素类和其他B -内酰胺酶类耐药，喹喏酮类药物，除氟哌酸外，环丙氟哌酸，氟嗪酸有较好抗菌活性（耐药率10〜23%之间），利福平敏感率在90%以上，未见耐万古霉素菌株，但已有万古霉素中介金黄色葡萄球菌。
二、高水平耐药的肠球菌（HLAR）及耐万古霉素的肠球菌（VRE）（一）药敏测定方法1、常规测定方法：采用K-B纸片扩散法，头抱菌素不用做（均为耐药），氨苄，庆大霉素，替考拉宁，万古霉素一定要做。
2、高水平氨基糖甙类耐药性测定：⑴高含量纸片扩散法：通常测定庆大霉素和链霉素的高度耐药性，具体操作如常规纸片法药敏试验。
药敏纸片：庆大霉素：120R g/片；链霉素300p g/片结果判断：R：W6mm；I：7~9mm；S：三10mm⑵含单一高浓度抗生素琼脂平皿法：稀释法：庆大霉素：R：三500R g/ml；链霉素：R：2000p g/ml3、万古霉素耐药性测定：纸片扩散法，具体操作如常规纸片法药敏试验，万古霉素纸片为：30p g/片，检测平皿置35℃24h （而不是16〜18h）,并注意抑菌圈内有无小菌落或薄膜生长。
微生物耐药基因的筛选与验证技术流程
微生物耐药基因的筛选与验证技术流程下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。
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医学检验·检查项目：多药耐药(MDR)基因检测_课件模板
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临床意义： 1.判断肿瘤病人对当前化疗用药是否
产生耐药; 2.在化疗前可指导临床用药， 以便选择或制定化疗发案。
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正常值： 正常范围：阴性。
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相关检查：
相关疾病：
肾细胞癌、膀胱癌、多发性内分泌肿瘤综 合征Ⅰ型、先天性肿瘤、前列腺癌、睾丸 肿瘤、甲状腺癌、胰腺癌、男性尿道癌、 女性尿道癌、肾盂肿瘤和输尿管肿瘤、肾 癌、口腔癌、子宫内膜癌、肿瘤性息肉、 大肠类癌、大肠癌、结肠癌、类癌、残胃 癌。
谢谢！
医学检医学检验·各论：多药耐药（MDR）基因检测 >>>
别名： 多药耐药基因检测。
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简介：
多药耐药(MDR)基因编码P-糖蛋白(P170)，该蛋白位于细胞膜上，有药物泵作 用，将进入细胞的药物泵出细胞外而使细 胞产生耐药。MDR阳性表示各种癌症的多 药耐药。
C-myc基因（C-myc）、p53基因检测、Kras基因检测（K-ras,p21）、p16基因检 测（MTS）、结核杆菌基因检测（PCR）、 肿瘤基因P53抗体（P53-AB）。
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相关症状： 贫血、恶心与呕吐、消瘦、毛发异常、发 热、鳞状细胞癌。
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HIV1基因型耐药检测及质量保证
HIV-1基因型耐药检测及质量保证指南(2013年版)Guideline for HIV-1genotyping drug resistance testing and qualityassurance中国疾病预防控制中心2013年3月20日前言随着我国艾滋病抗病毒治疗工作的日益深化，HIV-1基因型耐药检测显示出越来越重要的作用，开展耐药检测的实验室也日益增多。
截至2012年底，共有30余家实验室从事HIV-1基因型耐药检测，未来还将有更多的实验室参与其中。
HIV-1基因型耐药检测是对操作人员、实验室环境和设备有很高要求的分子生物学技术，为了对开展该项检测工作的实验室进行系统的技术和质量控制指导，保证检测结果的准确性和可靠性，特制定《HIV-1基因型耐药检测及质量保证指南》（以下简称《指南》）。
本指南自2011年12月开始编写，参与编写的人员为我国实验室检测、抗病毒治疗领域的专家和有富有实践经验的检测人员，同时聘请WHO和美国疾病预防控制中心的专家作为技术顾问，并参考了大量国内外相关学术文献及技术指导手册。
经过编写组多次修订、补充和审定，于2013年3月完成《指南》终稿。
《指南》分为八章，包括：HIV-1基因型耐药检测的人员要求、实验室环境与设置、样品管理、检测技术、质量控制和生物安全。
本《指南》起草单位：中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心。
本《指南》参加编写单位：中国医科大学，中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所，上海市疾病预防控制中心，复旦大学公共卫生中心，云南省疾病预防控制中心，云南省传染病医院艾滋病关爱中心，北京出入境检验检疫局。
本《指南》编写主持人：蒋岩本《指南》编写组人员：姚均、邢辉、尚红、李敬云、钟平、徐建青、马艳玲、杨绍敏、韩晓旭、张旻、潘品良、蒋岩、汪宁、康来仪、朱红、邢文革、肖瑶、邱茂锋、吴亚松。
本《指南》技术顾问：美国疾病预防控制中心杨春富、GAP北京办公室Chin-Yih Ou，齐明山。
细菌耐药表型的检测方法
（5）大肠沿着菌株划线的生长表明碳青霉烯水解酶的产生。
6.改良的Hodge试验：检测碳青霉烯酶活性的 表型试验，在检测KPC方面有>90％的敏感 性/特异性，检测其他碳青霉烯酶时敏感性/ 特异性不定（如：低水平的金属酶）。
7. 改良Hodge试验的质量控制(2009年 CLSI:M100-S19.APPB.124)： 随患者菌株 每天检测。
＊＊NA：不可用（本试验不适用于筛查）
4.什么时候做改良Hodge试验？
• 如果头孢噻肟、头孢他啶和 /或头孢曲松全部“R”。
• 注：头孢比肟对于碳青霉烯酶产生株的结果是不稳定的。
•
MIC（μg/ml) 抑菌圈(mm)
• 厄他培南 2
19-21
• 亚胺培南＊ 2-4
NA ＊＊
• 美洛培南 2-4
16-21
（3）35℃孵育18-24h，如克林霉素出现扁平或凹 陷的抑菌环为阳性。
D-Test试验耐药表型判断
耐药机制
红霉素 克林霉素 基因型
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泵出(MS)
R
S
MSRA
核糖体基因诱导变异 （ermC为主）
(iMls) R
D-Test(+)
核糖体基因结构变异 (cMLS) R
※三维水相试验方法的改进(M-H平板打孔[2mm]扩散法).
AmpC酶新的检测方法
4.质粒型AmpC酶三联纸片方法的检测 （1）将标准菌株ATCC 25922按常规药敏纸片K-B法
操作均匀涂布于M-H平板上。 （2）在M-H平板中心贴一片头孢西汀(30ug/片) 纸片，
在纸片边缘贴有待测菌的纸片（纸片上含20ul， PH8.0，1M Tris-0.1MEDTA）。 （3）另一侧边缘贴有产AmpC酶菌的纸片（同上）。 （4）35℃孵育18-24h，如待检菌出现扁平或凹陷的 抑菌环为阳性。
基因工程实验操作作业指导书
基因工程实验操作作业指导书前言：在进行基因工程实验操作之前，请确保已经具备相应的实验知识和技能，并遵守实验室的安全规定。
本实验操作指导书将详细介绍基因工程实验的步骤和注意事项，以确保实验顺利进行。
一、实验前准备1.确认实验的目的和所需材料：确定需要进行的基因工程实验目标，并准备所需的各种试剂、细胞培养物和实验器材。
2.实验室安全措施：穿戴实验室要求的个人防护装备，遵守实验室的规章制度。
确保实验室电源和排风系统正常运行。
二、实验步骤1.基因克隆a) DNA提取：从源生物体中提取DNA样本，利用适当的提取方法将DNA纯化并获得高质量的DNA。
b) PCR扩增：设计引物，进行PCR扩增反应，使目标基因扩增到所需的浓度。
c) 酶切：使用限制性内切酶对目标基因和载体进行酶切，创建黏性末端适配体。
d) 连接：将目标基因与载体连接，形成重组DNA。
e) 转化：将重组DNA转化到适宜的宿主细胞中，使其能够被宿主细胞内的酶复制和表达。
2.细胞培养a) 培养基准备：根据实验需求制备适宜的培养基。
b) 细胞传代：将宿主细胞进行传代，以保持活性和生长状态。
c) 质粒提取：从转化后的细菌中提取质粒DNA，作为后续实验的样本。
d) 菌液预处理：将细菌培养物进行适当的处理，如离心、洗涤等。
3.基因表达a) 表达培养条件控制：设置适宜的温度、培养时间和培养基成分，以获得高效的基因表达。
b) 转录与翻译：利用适当的启动子和加入适量的诱导剂，实现基因转录和翻译。
c) 蛋白质纯化：根据需要，对表达的蛋白质进行纯化，确保其纯度和活性。
4.实验结果分析a) 凝胶电泳：使用凝胶电泳分析方法，判断基因工程实验的成功与否。
b) 荧光检测：通过荧光标记的方法检测基因表达程度。
c) 其他分析方法：根据实验目的及需求，选择适当的分析方法进行结果分析。
三、实验操作注意事项1.实验室安全：佩戴手套、实验外套、护目镜等个人防护装备，避免实验材料和试剂对人体造成伤害。
中国部分地区耐利福平耐药基因的检测
中损伤肝外胆管。
②CaIot 三角区的解剖分离是LC 的关键步骤，在解剖CaIot 三角区时，应从胆囊颈部开始，紧贴着胆囊分离，在钳夹、切断前必须确认解剖结构，认真处理好“三管一壶腹”，切忌大块组织的钳夹、切断，以免造成肝外胆管的损伤。
③在因炎症或粘连导致CaIot 三角解剖不清时，则采取逆行切除法，若其技术上仍有困难，可以先切开胆囊取尽结石，顺胆囊腔追寻至胆囊管后上钛夹后，行胆囊大部分切除术。
④防止胆囊牵拉过度，正确放置胆囊管钛夹，避免因牵拉引起肝外胆管成角，而致夹闭部分或全部肝外胆管，安放近胆总管侧胆囊管的钛夹时，应注意肝外胆管与胆囊管汇合部上方是空虚的，如此可最大限度的避免损伤肝外胆管。
⑤术中出血时必须保持镇定，切勿盲目钳夹或电凝，尤其是在CaIot 三角区，盲目钳夹或电凝极易损伤肝外胆管。
出血时可先用无损伤钳钳夹暂时止血后，冲洗清楚，看清出血的部位后再钳夹或电凝。
同时，电凝器要避免触及钛夹，一是会造成钛夹所夹闭的组织坏死，致钛夹过早脱落；二是会造成热力的扩散，灼伤肝外胆管。
CarroII 等［5］分析了46例LC 术后肝外胆管损伤的病例，由于机械热力效应引起的3例，占6.52%，多在术后数天才出现症状。
③正确的认识LC 中转手术，当CaIot 三角致密粘连时，盲目的解剖很易造成右肝管或肝总管的损伤，应及时的中转开腹手术，而不应认为是LC 手术的失败。
①胆囊切除术后，应仔细的检查创面有无胆漏并常规检查切除胆囊的胆囊管开口，对可疑者可行胆道造影来确诊。
术后严密观察以及时发现肝外胆管的损伤，并根据肝外胆管损伤的情况进行相应的补救处理措施，以免引起更严重的后果。
参考文献1DezieI DJ ，MiIIikan KW ，Economou SG ，et pIications of Iaparoscopic choIecystectomy ：a nitionaI suvery of 4292hospitaIs and an anaIysis of 77604case.Am J Surg ，1993，165：92Vecchio R ，Macfadgen paroscopic choIecystectomy ：review of 40unit-ed states pubIished series.Surg Endose ，1998，12：5473刘永雄，纪文斌，冯玉泉，等.电视腹腔镜胆囊切除术（国内资料汇集）.中华外科杂志，1993，31：3904刘国礼.中国腹腔镜外科进展.世界华人消化杂志，1999，7（3）：2635CarroII BJ ，Birth M ，PiIIips mon biIe duct injuries during Laparo-scopic choIecystectomy that resuIt in Iitigation.Surg Endose ，1998，12：310（收稿日期：2003-04-07）中国部分地区耐利福平耐药基因的检测陈红兵1王仲元1张小刚1何秀云1董亚俊2张晓娟21中国人民解放军第三!九医院结核科（北京100091）；2辽宁省沈阳市胸科医院检验科（110044）【摘要】目的研究中国部分地区耐利福平（RFP ）结核分支杆菌临床分离株rpoB 基因突变情况并评价其耐药分子机制。
结核分支杆菌链霉素耐药基因的检测
结核分支杆菌链霉素耐药基因的检测吴雪琼 庄玉辉 何秀云 李国利 张晓刚 摘要 目的 了解结核分支杆菌链霉素(Sm)耐药基因突变情况,建立快速检测耐药突变株的方法。
方法 通过聚合酶链反应2单链构象多态性(PCR2SSCP)分析了22株结核分支杆菌临床分离株的rp s L基因,并应用PCR2限制性片段长度多态性(PCR2R FL P)进一步分析其突变的部位和性质。
结果 以H37R v标准株为对照,5株敏感株的rp s L基因未见SSCP泳动异常、有M bo 酶切位点;13株耐Sm株中,11株(86%)有rp s L基因泳动异常、无M bo 酶切位点;4株耐其它抗结核药物株中,也有1株SSCP泳动异常、并无M bo 酶切位点。
结论 大多数结核分支杆菌Sm耐药分离株有rp s L突变,而突变位点大多位于第43位密码子。
应用PCR2SSCP和PCR2R FL P可能成为快速检测结核分支杆菌耐药突变株的新方法。
关键词 分支杆菌,结核 聚合酶链反应 多态现象,单链构象 多态性,限制性片段长度 药物耐受性D etection of M.tuberculosis strepto myc i n-resistan t gene W u X ueqiong,Z huang Y uhu i,H e X iuy un, et al.T he T ubercu losis R esearch L aboratory,the309th H osp ital,P l A,B eij ing100091 Abstract Objective To observe the m utati ons of rp s L gene in M.tuberculo sis strep tom ycin2re sis2 tant iso lates,and to develop a ne w m ethod fo r detecting drug resistance.M ethod D etecting the rp s L as a contro l.In22M.tuberculo sis clinical iso lates,the rp s L PCR2RFL P.Results Strain H37Rv w as used as a contro l.In22M.tuberculo sis clinical iso lates,the rp s L PCR fragm ents from5drug2suscep2 tible iso lates had no differences in the SSCP p rofiles w ith strain H37Rv,and w ere restricted by M bo . 11of the13strep tom ycin2resistant iso lates show ed apparent differences in the SSCP p rofiles and w ere no t digested w ith M bo .1of the4o ther drug2resistant iso lates also had apparent SSCP differences and w as no t digested by M bo .Conclusion s The results suggested that the rp s L gene m utati on w as frequantly observed in M.tuberculo sis strep tom ycin2resistant iso lates,and usually situated at codon 43,PCR2SS2CP and PCR2RFL P m igh t becom e a si m p le,rap id and reliable diagno stic test fo r drug re2 sistance.Key words M ycobacterium tuberculo sis Po ly m erase Chain Reacti on Po ly mo rph is m,single2 stranded confo r m ati onal Po ly mo rph is m,restricti on fragm ent length D rug to lerance 由于多耐药菌株的传播和有限的抗结核药物,结核分支杆菌的耐药问题十分严重,1992年美国发生了几起多耐药结核病的爆发流行[1]。
具有抗生素耐药基因的耐药菌的筛查与监测
具有抗生素耐药基因的耐药菌的筛查与监测筛查和监测具有抗生素耐药基因的耐药菌引言：抗生素是人类在医疗领域中的重要武器，能够有效地对抗细菌感染。
然而，随着时间的推移，细菌不断进化和适应环境，在此过程中发展出了抗药性。
这导致了一种严重的问题——出现了具有抗生素耐药基因的耐药菌。
如何及时筛查和监测这些耐药菌成为了当今医学界亟待解决的挑战。
一、耐药菌及其威胁1. 耐药菌介绍耐药菌是指能够抵御一个或多个抗生素的细菌。
它们通常通过携带特定基因来实现对抗生素的耐受性。
这些基因可以传给其他细菌，从而迅速传播这种耐药性。
2. 耐药菌危害- 限制治疗选择：流行性的耐药细菌会限制医生在治疗感染时可供选择的有效抗生素。
- 高致病性：由于同一菌种的变异，耐药菌往往具有更强的致病性和传染性。
- 增加治疗成本：选择耐药细菌所需的抗生素一般价格更高，因此治疗费用也随之升高。
二、抗生素耐药基因的筛查方法1. 底物特异性测试底物特异性测试是通过测定细菌是否能够代谢特定底物来确定其对抗生素的耐受性。
这种测试方法简单易行，但只能检测到某类抗生素得到的耐药性。
2. 基因序列分析利用现代生物技术手段，可以对细菌基因进行测序分析。
通过比对已知的抗生素耐药基因数据库，可以准确地识别出具有特定耐药基因的细菌。
3. PCR扩增法PCR扩增法是一种快速而敏感的检测方法。
它可以利用特定引物在体外扩增目标基因片段，并通过凝胶电泳等技术判断是否存在目标基因。
三、耐药菌筛查和监测的重要性1. 及早采取针对措施及时筛查和监测耐药菌的存在可以帮助医疗机构更快地采取针对性的措施，减少其传播风险。
例如，应用正确的抗生素和合理的用药方案。
2. 治疗选择的指导性通过筛查和监测耐药菌，可以了解其耐受不同抗生素的能力，从而指导医生在治疗感染时选择适当的药物。
这将有助于提高治愈率和预防细菌进一步发展出新的抗药性。
3. 监测耐药性趋势定期进行耐药菌筛查和监测，可以帮助建立耐药性趋势的数据库。
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耐药基因型检测操作规程作业指导书1目的本操作规程是关于使用in-house方法进行耐药性检测过程标准操作和结果分析保存的规程。
2适用范围适用于HIV-1耐药基因型测定。
3职责在使用in-house方法进行耐药性检测过程中，研究人员必须依照本标准操作规程进行操作。
4作业程序4.1核酸提取：推荐使用QIAGEN公司QIAamp Viral RNA Mini Kit 提取RNA。
4.2引物4.2.1 扩增引物第一轮PCR：外侧上游引物MAW 26：5’-TTGGAAATGTGGAAAGGAAGGAC-3’; HXB2 2028-2050 外侧下游引物RT21：5’-CTGTA TTTCTGCTA TTAAGTCTTTTGA TGGG-3’; HXB2 3509-3539第二轮PCR：内侧上游引物PRO-1 ：5’-CAGAGCCAACAGCCCCACCA-3’; HXB2 2147-2166内侧下游引物RT20 ：5’-CTGCCAGTTCTAGCTCTGCTTC-3’; HXB2 3441-34624.2.2 测序引物正向测序引物：PROS3 ：5’-GCCAACAGCCCCACCA-3’RTAS ：5’-CTCAGA TTGGTTGCAC-3’RTB ：5’-CCTAGTATAAACAATGAGACAC-3’; HXB2 2946-2967反向测序引物：PROC1S ：5’-GCTGGGTGTGGTA TTCC-3’RT20S3 ：5’-GTTCTAGCTCTGCTTC-3’参照国际标准株HXB2株（全基因1-9719bp）POL基因序列(2253-5096bp)，其中蛋白酶(2253-2549bp)，逆转录酶基因(2250-4229bp)，整合酶基因(4230-5096bp)。
我们所使用的方法扩增产物长度为1.3kb，包括蛋白酶基因全长（1-99 codon）和逆转录酶基因前300个氨基酸(1-300 codon)。
4.3准备RT-PCR（逆转录及第一轮PCR）反应体系：在PCR准备间安全柜内进行，注意配置过程应在冰上进行。
推荐使用Takara One Step RNA PCR Kit(AMV)，总体系25μl，见下表：4.3.1将除酶以外的试剂取出置于室温，待其溶化后震荡混匀5秒钟，短暂离心后置于冰上备用。
4.3.2酶及逆转录酶抑制剂取出置于冰上，使用后立即放回-20℃保存。
4.3.3准备PCR管，管身标记清楚编号，置于冰上备用。
4.2.4使用1.5ml离心管配制RT-PCR反应体系（单位μl），按每管20μl将配制好的反应体系分装至PCR管中，注意将液体加至管底。
4.4RT-PCR（逆转录及第一轮PCR）4.4.1将分装好的PCR管拿到加样间，分别将样本RNA、阳性对照样本RNA及阴性对照样本RNA各5μl加入相应PCR管中。
注意不要发生交叉污染。
4.42 将混合物混匀并短暂离心后放入PCR仪中，设定程序：50℃ 30分钟；94℃ 5分钟；94℃ 30秒，55℃ 30秒，72℃ 2分30秒，30 cycles；72℃ 10分钟，4℃保温。
运行程序。
4.5 第二轮PCR4.5.1 在PCR准备区配制反应体系，注意配置过程应在冰上进行。
推荐使用TakaraPerfectshot TM Ex Taq Mix，总体系50μl，见下表：4.5.2 反应体系的配制同RT-PCR。
体系配制完成后，按照每管45μl将配制好的反应体系分装到PCR管中。
4.5.3将分装好的PCR管拿到加样间，将第一轮反应产物各5μl加入相应的PCR管中，将混合物混匀并短暂离心后放入PCR仪，设定反应程序：94℃ 5分钟；94℃ 30秒，63℃ 30秒，72℃ 2分钟30秒，30 cycles；72℃ 10分钟,4℃保温。
运行程序。
4.6 PCR扩增产物电泳鉴定4.6.1于三角烧瓶中称取1g琼脂糖，加入100ml 1×TAE溶液,配成1%的胶溶液，置于微波炉中，中火加热3分钟，冷却到60℃左右时加入5ul 1%的EB溶液混匀。
4.6.2洗净的电泳板和梳子擦干，倒入溶胶液，使胶的厚度达到0.5cm左右。
室温下放置至少40分钟以上,使胶彻底凝固。
4.6.3待胶凝好后缓慢拔出梳子，放入电泳槽，倒入1×TAE，使液面高出胶平面1mm左右。
4.6.4取第二轮PCR产物5ul缓慢加入电泳孔中。
（若反应体系中不含Loading Buffer则于玻璃纸上滴点10×上样缓冲液，每滴约1ul，取第二轮PCR产物5ul 与10×上样缓冲液液滴混匀后缓慢加入电泳孔中。
）同时在电泳孔中加入 5 ul分子量为2000的Marker，判断PCR扩增产物的正确位置。
4.6.5电泳仪电压设量为100v，恒压电泳，40分钟左右观察结果。
4.6.6将电泳后的胶从胶板上取下，置于紫外透射反射仪上观察电泳胶中期望的PCR产物条带并拍照。
4.6.7挑取PCR阳性样本用于扩增产物的纯化回收，同时应该暂时保存第一轮PCR产物（-20C）以备必要时进行再次扩增。
4.7 PCR扩增产物纯化此步骤用于将PCR产物纯化并回收，用于回收的样品应经电泳检测无明显拖尾，并且有足够的浓度，回收的样品DNA也应符合无明显拖尾、杂带的标准才可用于测序。
4.7.1方法如上配置2%的琼脂糖凝胶,使胶的厚度达到1cm左右.室温下放置至少40分钟以上, 待胶彻底凝固后将剩余45ul PCR产物全部加入电泳孔中。
（于剩余45ul PCR产物的PCR管中加入10×上样缓冲液5ul, 混匀后将第二轮PCR产物全部加入电泳孔中。
）4.7.2 PCR产物2%琼脂糖凝胶电泳, 恒压100v 1小时（具体电泳时间以将目的条带和其它混杂条带分开为准）。
4.7.3 用干净的手术刀将含有PCR产物的琼脂糖凝胶切下置于1.5mlPCR管中，胶块重量控制在0.1克左右。
注意在切胶时应在胶下铺一层PE手套，以防止刀片损坏紫外灯。
4.7.4 称量胶块的重量，然后依据QIAquick Gel Extraction试剂盒操作说明进行纯化。
4.8 测序4..9 序列结果贴网分析(Stanford HIV Drug Resistance Database使用规程)4.9.1 直接进入Stanford Hiv Drug Resistance Database()，图1。
点击HIVdb，进入下一界面（图2）。
图1图24.9.2 点击左上角Analyze a sequence ，进入下一界面（图3）。
图34.9.3 点击Choose a file to upload from your computer using the file selection box below 标题下的浏览框选择所要分析的序列所在文件夹，选中文件名，点击打开或者将测序好的序列（文本格式）粘贴在此界面下方text box 里，点击Analyze 进入下一界面（图4）。
图4在此界面会出现一个表格，表明是Sequence Quality Assessment ，上表对所测得序列PR基因包含1-99个密码子和RT基因包含1-248个密码子的序列进行三个方面的质量评估：4.9.3.1Stop Codons（终止密码子）和Frame Shifts（移码突变）；4.9.3.2 B,D,H,V,N:：如果产生在耐药位点，用GCG 软件包或Bioedit软件进行序列比对分析，对照测序胶图比较是否在此位点出现重叠峰，这有可能是体内野生株和突变株共存；4.9.3.2Unusual Residues（非正常碱基）。
4.9.4 续上图（图5），此界面显示一个PI Drug resistance interpretation和PRComments。
此界面说明了产生的针对蛋白酶抑制剂相关耐药位点和耐药的程度。
例如：该序列分析结果说明这个病人接受了抗蛋白酶抑制剂（PI）的治疗，产生蛋白酶抑制剂主要耐药突变（PI Major Resistance Mutations），有三个突变位点，分别是I54V、V82A 和L90M。
产生蛋白酶抑制剂次要耐药突变（PI Minor Resistance Mutations），有五个突变位点，分别是L10I、D60E、L63P、A71V、I93L。
图54.9.5 续上图（图6），此界面显示一个NRTI and NNRTI Drug resistance interpretation和RT Comments.此界面说明了产生的针对逆转录酶抑制剂相关耐药位点和耐药的程度。
例如，序列分析结果说明这个病人同时也接受了抗逆转录酶抑制剂的治疗，产生核苷类逆转录酶抑制剂的耐药突变（NRTI Resistance Mutations），有四个突变位点，分别是D67N、K70R、T215F、K219Q。
未产生非核苷类逆转录酶抑制剂的耐药突变（NNRTI Resistance Mutations）。
图64.9.6 续上图（图7），此表显示一个Mutation Scoring, 它主要根据耐药突变位点得到关于每个药物的一个分值，分值累积得到这种药物的Total Scoreing，按照总分值来判断耐药的程度。
图74.9.7 五种类型耐药突变判断标准：4.9.7 .1 Susceptible (score 0-9): virus isolates of this type have not shown reducedsusceptibility to the drug4.9.7 .2 Potential low-level resistance (score 10-14): virus isolates of this type havemutations which by themselves may not cause drug resistance, yet indicatethe possibility of previous drug selection.4.9.7 .3 Low-level resistance (score 15-29): virus isolates of this type have reducedin vitro susceptibility to the drug and/or patients with viruses of this genotypemay have a suboptimal virologic response to treatment4.9.7 .4 Intermediate resistance (score 30-59): the genotype suggests a degree ofdrug resistance greater than low-level resistance but lower than high-levelresistance4.9.7 .5 High-level resistance (score >60): the genotype is similar to that of isolateswith the highest levels of in vitro drug resistance and/or patients infected withisolates having similar genotypes generally have little or no virologicresponse to treatment五、实验室数据汇总各实验室将测得数据整理成下表形式，汇总至国家CDC性艾中心，性艾中心将根据全国调查结果，撰写一份综合报告，并将报告发给各省CDC，各省可以利用本身的数据信息，在性艾中心人员的帮助下，撰写有关报告。