靶向金黄色色素合成蛋白CrtN的苯并六元含氧脂肪环类抗MRSA候选药物：设计、合成和药理学评价

靶向金黄色色素合成蛋白CrtN的苯并六元含氧脂肪环类抗MRSA 候选药物：设计、合成和药理学评价

金黄色葡萄球菌是一种致病力及致死率都很高的革兰氏阳性菌,它能在抗生素环境下快速突变为耐药金黄色葡萄球菌

(methicillin-resistantS.aureus,MRSA),近年来几乎所有上市抗生素都出现了相应的MRSA菌。为了缓解抗生素耐药造成的公众健康危机,开发一类有别于传统抗生素的新型治疗策略尤其迫切。

细菌在生长和繁殖过程中会分泌出各种毒力因子,这些毒力因子不仅能随宿主环境变化进行自适性调节,为细菌营造出更适宜的生长环境,而且能够帮助细菌躲避宿主的免疫杀伤,更重要的是毒力因子不直接影响细菌的生长和繁殖。因此以毒力因子为靶点的新型抗细菌感染治疗策略,能够在“不杀菌”的前提下降低细菌对人体的伤害,并有效避免细菌的耐药性突变。

金黄色色素是金黄色葡萄球菌体内特有的毒力因子,不仅能够帮助细菌抵御人体的免疫杀伤(ROS杀伤机制),还会加速人体器官和组织的坏死,因此通过阻断金黄色色素的合成和产生,能高效专一的治疗MRSA引起的感染和损伤。金黄色色素的合成通路受操纵子crtOPQMN调控,CrtN是其中最重要的色素合成通路之一。

在课题组之前的研究中,我们通过自建“老药库”发现了已上市抗真菌药物盐酸萘替芬,能通过靶向CrtN来阻断金黄色色素的合成。我们以盐酸萘替芬为先导化合物,将其结构中的萘环替换成苯并脂肪环,发展了第一代靶向CrtN的苯并脂肪环类色素抑制剂,特别是候选药物44表现出了极佳的体内外药效。

但是在随后的研究中,我们发现候选药物44存在水溶性差,心脏hERG毒性强

等成药性缺陷。因此,本论文工作的主要目标就是发现一类具有良好体内外活性,同时能够克服第一代色素抑制剂缺陷的新型药物小分子。

我们首先以同是苯并脂肪环衍生物的46为先导化合物,分析了化合物水溶性差的主要根源在于结构中存在疏水性苯并脂肪环,并验证性在46的结构中插入了一个亲水性氧原子,合成了具有苯并二氢吡喃新骨架衍生物60。60不仅保持了较好的色素抑制活性(IC50 = 4.6±0.2nM),同时水溶性比46提高了20多倍(13.2 mg/mL)。

随后以苯并二氢吡喃为母核结构,在新化合物60的其他结构区域进行优化和改造,在保持其色素抑制活性和水溶性的基础上,改善心脏hERG毒性。在先导化合物46的烯丙基碳端位(A区域)引入环烷基、取代芳基及杂芳基等,设计合成了38个新衍生物(47-84),并考察它们对S.aureusNewman的色素抑制能力。

测试结果不仅清晰的展示了化合物结构与抑制活性之间的关系,而且发现了9个化合物的色素抑制活性达到了个位数纳摩尔级别,通过构效关系结果对化合物进行初步筛选后,4-二苯基取代基片段的化合物67表现出了最强的色素抑制活性(IC50 = 3.8±0.1nM)。随后将烯烃端位碳取代固定为对二苯基取代片段,开展了氮上(R)和链上取代变化(Linker)的考察。

对这两部分的考察共合成了 10个化合物(85-94),根据色素抑制结果可知,氮上甲基被替换成氢原子、乙基或异丙基后(85-87),色素抑制活性丧失,链上双键被替换或剔除(89-93)也会丧失色素抑制活性,而引入共轭多烯基团后,色素抑制活性反而有所上升。色素抑制活性较好的衍生物53、56、57、58、59、60、63、66、67、81、88、94被优选进行水溶性和心脏hERG毒性方面的筛选,化合物67和88凭借出色的色素抑制活性、较低的hERG毒性和良好的水溶性,被选中

进行随后的药理筛选实验。

在CrtN酶抑制活性试验中,两个化合物均表现出较好的酶抑制活性

(IC50<300nM)。在MRSA菌株色素抑制试验中,四组MRSA菌,USA400MW2、USA300 LAC、Mu50和NRS271菌株被用来考察化合物的色素抑制活性,结果显示67和88均表现出良好的MRSA色素抑制活性,但候选药物88在Mu50和NRS271菌株中的表现更佳(IC50 = 0.36±0.1 nM inMu50和IC50=0.4±0.1 nMinNRS271),我们将更有成药潜质的88作为候选药物开始进一步的考察。

利用高效液相色谱法测定CrtM的催化产物,证明了候选药物88确实作用在CrtN色素合成通路。随后设置了四种不同的体外实验,详细考察与候选药物88共孵育的MRSA菌在免疫清除上的变化,综合各实验结果可知,候选药物88能够在“不杀菌”的情况下,极大的削弱了细菌的毒力和繁殖能力。

鉴于第一代色素抑制体内药效评价中存在的缺陷,在本论文工作中,通过增加多种多重耐药MRSA菌株为受试菌、引入万古霉素和利奈唑胺作为阳性对照物、增加了对给药剂量(0.1mgb.i.d.和0.4mgb.i.d.)和给药模式(前给药模式和正

常给药模式)的考察,全面评价了候选药物88的体内抗毒活性。实验结果表明候选药物88在S.aureus Newman菌株、中度万古霉素耐药MRSA菌株Mu50和重度利奈唑胺耐药MRSA菌株NRS271的小鼠感染脓肿实验中均表现出较好的治疗效果,甚至小剂量给药组表现出好于阳性药组的抑菌能力(部分脏器中抑菌率达到了99%)。

为了进一步提高化合物水溶性,对88进行了盐型筛选,合成了 10类不同的盐型,结果发现88磷酸盐具有较好的水溶性(12.9 mg/mL)。以上实验结果都证明候选药物88可以作为抗毒力因子候选药物进行后续开发。

在苯并二氢吡喃类衍生物设计中,通过在苯并脂肪环结构中引入亲水性氧原子,显著提高了化合物的水溶性,但是比较遗憾的是,由于在结构优化中引入了疏水的4-二苯基和共轭双烯,虽极大地改善了hERG毒性,但同时消泯了亲水性氧原子带来的水溶性提升。在本论文的第二部分工作中,为了进一步改善化合物水溶性,同时拓展第二代靶向CrtN金黄色色素抑制剂的骨架类型,我们再次以46为先导化合物,在苯并脂肪环结构中引入两个氧原子,设计并合成一类新颖的,具有苯并二噁烷骨架的化合物。

苯并二噁烷候选药物的研究策略和发现过程与第一部分工作相同,共有46

个新结构衍生物被合成并测试了S.aureus Newman色素抑制活性,其中有11个位数纳摩尔抑制活性的化合物被获得。通过构效关系结果筛选,活性较好的A05、A06、A37、A38(ICs0<3.5nM)被选取测试水溶性、心脏hERG毒性、体外酶活和其他MRSA菌色素抑制活性,候选药物A37在其中表现出最好的成药潜力,并进行了体外“不杀菌”免疫清除实验,实验结果可知,A37在“不杀菌”的前提下,高效的削弱了细菌在免疫环境下的存活能力。

在体内药效实验中,候选药物A37依旧表现出色,实验结果显示大部分A37

给药组显示出了良好的体内药效活性,小剂量给药组的体内活性好于提前给药组,甚至小剂量正常给药组活性和两个阳性药组相当。所有这些数据都表明候选药物A37是极具潜力的抗MRSA,VISA和LRSA感染的候选药物。

本论文工作的创新性主要表现在以下3个方面:(1)在苯并脂肪环中引入亲水性氧原子,形成具有苯并二氢吡喃和苯并二噁烷骨架的第二代靶向CrtN金黄色葡萄球菌色素抑制剂;(2)克服了苯并脂肪环类色素抑制剂的缺陷,提升了候选药物的水溶性和改善了心脏hERG毒性;(3)优化了体内药效学评价模型,引入多