细胞电生理学与膜片钳技术2

膜片钳技术的一大优点就是在通道电 流记录中,可分别于不同时间、不同部位 (膜内或膜外)施加各种浓度的药物或毒素, 研究它们对通道功能的可能影响。通过 研究,一方面可深入了解哪些选择性作用 于通道的药物和毒素影响人和动物生理 功能的分子机理;另一方面,分析各种药物 对通道蛋白的选择性相互作用的特点,提 供有关通道蛋白亚单位结构与功能关系 的信息。
膜片钳在药理学研究中的应用
膜片钳技术不仅对于细胞生物学领域的 发展以及对于阐明各种疾病的机制具有革 命性意义，而且开辟了一条探索药物作用 机制和发展新的更为有效药物的途径。正 如 诺 贝尔 基 金会 在 颁奖 时所说 :“Neher 和 Sadmann的贡献有利于了解不同疾病机理, 为研制新的更为特效的药物开辟了道路” 。
电压门控离子通道的分子结构示意图 电压门控离子通道的分子结构示意图
亚基 (α,β,γ等） 亚基的四个跨膜区 跨膜区（ α亚基的四个跨膜区（D1-D4）
孔道区（ 孔道区（pore region） ）
S1
S2
S3 S4
S5
S6
电压感受器（ 电压感受器（voltage sensor） ）
6个呈α螺旋式的跨膜片断（transmembrane segments, S1-S6） 个呈α螺旋式的跨膜片断（ 个呈 跨膜片断
失活 状态
Inactive state
复活
recovery
静息 状态
resting state
失活 失活状态不仅是通道处于关闭状态， 失活状态不仅是通道处于关闭状态， inactivation 而且只有在经过一个额外刺激使通道从 失活关闭状态进入静息关闭状态后 失活关闭状态进入静息关闭状态后，通 道才能再度接受外界刺激而激活开放。 道才能再度接受外界刺激而激活开放。
离子通道药理学
离子通道药理学
Patch-clamp技术 Patch-clamp技术 单细胞电流记录 Na+,Ca2+,K+,Cl-等电流 分子生物学技术 基因克隆及蛋白表达 通道蛋白功能测定
离子通道的结构与功能 药物作用机制 新药开发
二、离子通道的特性 (Characteristic of Ion Channels)
开放 状态
激活
activation
open state
(参见 参见P27图24-1) 参见 图
三、离子通道的功能
(Function of Ion Channels)
1.产生细胞生物电现象,与细胞兴奋性相关。 1.产生细胞生物电现象,与细胞兴奋性相关。 产生细胞生物电现象 2.神经递质的释放、腺体的分泌、肌肉的运动、 2.神经递质的释放、腺体的分泌、肌肉的运动、 神经递质的释放 学习和记忆 3.维持细胞正常形态和功能完整性 3.维持细胞正常形态和功能完整性 膜离子通道的基因变异及功能障碍与许多 膜离子通道的基因变异及功能障碍与许多 基因变异 疾病有关，某些先天性 后天获得性疾病是离 先天性与 疾病有关，某些先天性与后天获得性疾病是离 子通道基因缺陷与功能改变的结果，称为离子 子通道基因缺陷与功能改变的结果，称为离子 通道病 (ionchannelpathies)。 。
DAD-VC system
MicroManipulators
CCD Camera
Electrophysiology-Apparatus
Electrophysiology-Apparatus
Patch clamp
Automatic Patch Clamp Robot
原理：硅硼玻璃制造的芯片对悬浮细胞进行钳制。芯片上有约 的孔， 原理：硅硼玻璃制造的芯片对悬浮细胞进行钳制。芯片上有约1µm的孔，从 的孔 芯片内侧用泵施以负压使悬浮细胞被吸引到开孔处而形成封接。 芯片内侧用泵施以负压使悬浮细胞被吸引到开孔处而形成封接。
2.电压门控钙通道 2.电压门控钙通道
钙通道存在于机体各种组织细胞， 钙通道存在于机体各种组织细胞，在正常情况 存在于机体各种组织细胞 平台期）， 下为细胞外Ca 内流的离子通道（AP平台期），是调 下为细胞外 2+内流的离子通道（AP平台期），是调 节细胞内Ca2+浓度（[Ca2+]i）的主要途径。 节细胞内 浓度（ 的主要途径。
OUTLINE
1、细胞电生理学 、 2、膜片钳技术及其应用 、 3、膜片钳系统装置 、
小林/forry 祝你科研学习顺利 小林
膜片钳实验室基本设备
• • • • • • • • • • 膜片钳放大器 信号转换器 倒置显微镜 微操纵器 防震工作台及静电屏蔽笼 微电极拉制仪及抛光仪 计算机 专用软件 细胞记录槽 恒速灌流泵
• 膜片钳技术还在作用于通道活性受体和 第二信使调节的药物的机制研究中发挥 了重要作用。如证明了肾上腺素能介质 及药物激活β受体后，通过第二信使 cAMP激活蛋白激酶A，使钙通道磷酸化， 由关闭状态转为开放。
新药开发
在现代药物研究中，新靶点的建立往往 是新药创制的前提。随着膜片钳技术运 用对许多新受体亚型的发现和特性研究， 新型受体阻断剂将在选择性 、高效性上 发挥更大的作用。
钙通道
钾通道
快反应细胞AP and Ion channels
1
IC
a
INa-Ca 2
ITo 0 Ito1 Ito2
IKr
IKs
IK1 3 IK1 4
IN
a
1.电压门控钠通道 1.电压门控钠通道
选择性允许Na 跨膜通过。 选择性允许 +跨膜通过。维持细胞膜兴奋性 及其传导（AP的 ）。存在于心房 存在于心房、 及其传导（AP的0相）。存在于心房、心室肌细 胞和希普系统。 胞和希普系统。
Electrophysiology-Apparatus
Faraday cage
Amplifiers
Microscope
CCD Camera Vibration Isolation Table
Micro-Manipulators Remote Controller
Electrophysiology-Apparatus
3.膜片钳记录
• 电极拉制：一般采用常规二步法完成，电极尖 端直径在0.5-2.0µm之间，是否涂胶与抛光应根 据经验而定，不必强求。 • 亿欧姆封接：电极充灌安装后即给持续正压， 在倒置显微镜监视下将电极贴近细胞，以微操 纵器将电极贴于细胞，去掉正压后再稍施负压 吸引，亿欧姆封接便瞬间形成。要保证亿欧姆 封接就必须做到： 1)电极电阻适当；2)电极尖 端清洁；3)电极气路通畅； 4)电极与细胞相贴 宁不及而勿过之； 5)细胞膜清洁，活性好。
电压门控钠通道分类 电压门控钠通道分类
敏感性高 敏感性低 神经类钠通道（对TTX敏感性高、对μCTX敏感性低） 敏感性 敏感性 敏感性均高 骨骼肌类钠通道（对TTX和μCTX敏感性均高） 和 敏感性均高） 敏感性均低 心肌类钠通道（对TTX和μCTX敏感性均低），又分为 和 敏感性均低） 持久（ 钠通道和瞬时（ 钠通道。 持久（慢）钠通道和瞬时（快）钠通道。 持久钠通道 激活电压较低 失活速度慢 激活电压较低、失活速度慢 维持动作电位2相 维持动作电位 相平台期 对低浓度TTX等敏感 低浓度 等敏感 瞬时钠通道 激活电压较高 失活速度快 激活电压较高、失活速度快 引起动作电位0相 引起动作电位 相去极化 对高浓度TTX等敏感 高浓度 等敏感
四、Classification 四、Classification of ion channels
背景或漏通道）： （一）、非门控离子通道 （背景或漏通道）： ）、非门控离子通道 始终处于开放状态，离子可随时进出细胞， 始终处于开放状态，离子可随时进出细胞，并不受外界信号 的明显影响，如产生静息电位的K+通道。 的明显影响，如产生静息电位的K 通道。 （二）、门控离子通道： ）、门控离子通道： 门控离子通道 ①电压门控（Voltage gated channels)离子通道：受膜电位 channels)离子通道 离子通道： 电压门控（ 的变化影响，如决定细胞兴奋性、不应期和传导性的K 通道、 的变化影响，如决定细胞兴奋性、不应期和传导性的K+通道、 通道、 通道。 Na+通道、Ca2+通道。 配体门控（ channels)离子通道 离子通道： ②配体门控（Ligand gated channels)离子通道：由递质与通 道蛋白分子上结合位点相结合开启，如乙酰胆碱激活钾通道等。 道蛋白分子上结合位点相结合开启，如乙酰胆碱激活钾通道等。 机械门控离子通道 离子通道(Mechanically channels)： ③机械门控离子通道(Mechanically gated ion channels)： 由机械牵拉激活，如内耳毛细胞顶端机械门控通道。 由机械牵拉激活，如内耳毛细胞顶端机械门控通道。
特征
电压依赖性：去极化激活，产生内向钠电流（ 电压依赖性：去极化激活，产生内向钠电流（INa） 激活 快速激活（ 失活（ 快速激活（1ms）和快速失活（10ms） 激活 ） 快速失活 ） 有特异性激活剂（BTX、GTX）和阻滞剂（TTX、 特异性激活剂（ 激活剂 、 ）和阻滞剂（ 、 STX、µCTX） µ ）
药物作用机制研究
• 膜片钳技术对离子通道的动力学研究以 及药物与通道相互作用机制的研究。 • 药物对通道电压依赖的激活和灭活过程 的影响 • 药物对离子通道状态依赖性的作用（如 大多数Ⅰ类抗心律失常药与失活状态的 Na+通道结合而发挥作用）。 • 药物的频率依赖性（frequency-dependent） 或使用依赖性（use-dependent）（如维拉 帕米）以及药物对离子通道亚型的选择 性作用等 。
膜片钳记录的基本步骤
可概括为4大部分： 1.液体配制。主要根据研究通道的不同，配制相 应的液体，基本原则是保持2个平衡：渗透压 平衡和酸碱平衡。 2.标本的制备。膜片钳记录标本的制备主要有： 急性分离、细胞培养、脑片或其它组织薄片。 当根据不同的研究要求而相应选择。 3.膜片钳记录 4. 资料分析用相应的计算机软件进行