改善植酸酶热稳定性的策略.

来源最适温度(℃

热稳定性参考文献无花果曲霉58最高可以耐受65℃的高温Ullah 等(1998烟曲霉70100℃下加热20min 后,酶活仅损失10%Pasamontes 等(1997

米曲霉5665℃时酶活损失80%张玉帧等(1997淀粉液化芽孢杆菌6090℃处理10min 后酶活可保留50%Kim 等(1998地衣芽孢杆菌6595℃处理15min 后酶活可保留61%Tye 等(2002枯草芽孢杆菌5560℃处理1h ,活性减少90%Kerovuo 等(1998番茄

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60℃以下,活性很快损失

李明刚等(1998

植酸酶作为一种生物型饲料添加剂,对提高饲料中磷的利用率、动物的生产性能以及减轻因动物高磷粪便所导致的环境水污染具有重要意义。目前,通过基因工程微生物发酵来大规模廉价生产饲用植酸酶制剂已经基本得到实现,但是植酸酶制剂应用上的另一个关键性问题,即酶的热稳定性始终没有得到很好解决。饲料加工需经过制粒工艺,在制粒过程中有一个短暂的高温过程,温度一般为75~93℃,一般的植酸酶活性在此高温下大幅度地不可逆丧失,所以能在饲料中真正得到推广利用的植酸酶必须具有良好的热稳定性。但另一方面,饲料用酶又必须在常温下具有较高的酶活性,因为其最终的作用场所是在动物正常体温(37℃左右的胃肠道中,这与工业上所用的一些高温酶不同。这一矛盾是目前包括植酸酶在内的所有饲用酶制剂均需要迫切解决的问题。1自然选择法

从嗜温微生物嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila (Mitchell 等,1997、土曲霉(As-pergillus terreus (Mitchell 等,1997、淀粉液化芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens (Oh 等,2001、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis (Tye 等,2002中分离到的高温植酸酶其最适温度在70~80℃,虽然具有很好的耐热性,但它在37℃

下的酶活性极低,在饲料中没有应用价值;相反,

来源于黑曲霉(

A.niger 等的植酸酶在37℃下具有较高酶活性,但它不能经受制粒时的高温(Ul-

lah ,1998。由于耐热性是受基因控制的,当嗜热酶基因在常温菌细胞中表达时,通常会保留酶的耐热性,这说明嗜热菌的耐热性是可以遗传的,编

码嗜热酶的基因是对高温适应的结果(Zeikus 等,1998。部分植酸酶热稳定性见表1。

2蛋白质工程法

随着基因工程技术及分子生物学技术的发展,蛋白质工程法逐渐成为人们研究蛋白质稳定性的主要手段。目前在蛋白质热稳定性工程中常用的方法为:1推理设计(rational design ;2同序概念(consensus concept ;3杂合酶(hybrid en-zyme ;4定向进化(directed evolution 。2.1

推理设计

推理设计主要是把热稳定蛋白

改善植酸酶热稳定性的策略

浙江大学饲料科学研究所教育部动物分子营养学重点实验室

付石军

孙建义

表1部分植酸酶的热稳定性

[摘要]植酸酶作为一种生物型饲料添加剂对提高饲料中磷的利用率、动物的生产性能以及减轻因动物高磷粪便所导致的环境水污染具有重要意义,但由于其热稳

定性差,植酸酶的推广和应用受到限制。本文综述了自然选择法、蛋白质工程法、化学修饰法及生产工艺方面改善热稳定性的策略,并对其研究前景作了展望。

[关键词]植酸酶;热稳定性;自然选择;蛋白质工程;生产工艺[中图分类号]S816.7

[文献标识码]A

[文章编号]1004-3314(200714-0026-04

[Abstract]Phytase is a new-style enzyme used in monogastric animal feeds.It can increase phosphorus availability ,the performance of animal ,and decrease environmental phosphorus pollution.The application of natural phytase is limited due to its thermostability.The strategies of improving phytase thermostability ,with a view to discuss the research prospects were reviewed.

[Key words]phytase ;

thermostability ;natural selection ;protein engineering ;manufacturing technology 动物营养

与热不稳定蛋白的氨基酸序列进行比较,分析究竟是哪些氨基酸对蛋白质的热稳定性起关键作用。卢柏松等(1998对嗜热菌与常温菌的氨基酸组成做了比较,发现嗜热菌氨基酸中亮氨酸(Leu、脯氨酸(Pro、谷氨酸(Glu和精氨酸(Arg含量均高于常温菌,而胱氨酸(Cys、丝氨酸(Ser、苏氨酸(Thr、谷胺酰胺(Gln和天门冬氨酸(Asp含量显著低于常温菌。Pro结构熵小,易折叠,且一经折叠,需要很高的能量才能解开,从而提高蛋白质稳定性。Glu和Arg分别比带同样电荷的氨基酸有更大的侧链,侧链所提供的疏水作用及离子间互相作用能提高蛋白质的稳定性。Leu具有较强的疏水性和较大的侧链。Jaenicki (1996对嗜热菌蛋白与常温菌蛋白进行研究,发现嗜热菌蛋白与常温菌蛋白的大小、亚基结构、螺旋程度、极性大小和活性中心都极相似,但由于构成蛋白质高级结构的非共价力、结构域的包装、亚基与辅基的聚集,以及糖基化作用、磷酸化作用等不尽相同而导致热稳定性不同。事实上,酶的热稳定性受到许多因素的影响,如氨基酸序列、三维结构、辅助因子及pH值等。目前普遍采用