改善植酸酶热稳定性的策略.
甲醇酵母植酸酶的热稳定性
甲醇酵母植酸酶的热稳定性摘要:对甲醇酵母发酵生产的植酸酶性质和热稳定性进行了研究。
实验结果显示该酶活的最佳pH值为pH 5.5,酶液的活性稳定区间为pH 5.0-6.0,当酶液中添加10 mmolCaCl2时,能明显提高植酸酶的热稳定性,在80e保温15 min,其保留酶活可达到原酶液的77.8%。
植酸酶液经过多羟基化合物颗粒化处理后,其酶制剂的高温热稳定性比液体酶或普通固体化处理的植酸酶制剂提高50%。
关键词:植酸酶;热稳定性;饲料添加剂;颗粒化;多羟基化合物植酸酶(E.C. 3.1.3.8 phytase)是磷酸酶的一种特殊类型,能够催化植酸(phytate)水解,放出5-6个磷酸基团[1],终产物为肌醇(inositol)或肌醇磷酸盐。
由于植酸酶蛋白氨基酸顺序中含有Arg-His-Gly模体结构,因此属于组氨酸磷酯酶一类[2]。
植酸酶广泛存在于微生物、植物或动物组织中[3],但它的作用在不同的组织中各不相同。
在植物中,植酸酶主要为种子萌发提供磷以及为植物提供非常重要的生长因子-肌醇[4],此外,植酸盐被水解还能够释放出钾、钙、镁和锌等植物生长所必需的微量元素,肌醇磷酸酯在物质进入细胞的运输系统中也发挥着重要作用,如3-磷酸肌醇在植物运输系统中作为次级信号传递体起信号转导作用[5]。
在微生物细胞中,植酸酶能够对磷的缺乏作出反应,以便及时从周围环境植酸中获得磷供细胞使用。
植酸酶在动物细胞中的作用现在还比较模糊,但已知有一个类似于植酸酶的酶(MIPP),它能够调整植酸和1,3,4,5,6-五磷酸肌醇的分子活力[6]。
由于能够水解植酸,解除植酸对营养物质的螯合作用,有效提高食品和饲料的营养价值,同时能够替代饲料中无机磷添加,降低生产成本,减少环境的磷污染,植酸酶已成为一种重要的饲用酶制剂。
饲料在加工过程中,一般都要进行颗粒化,以杀灭饲料中的沙门氏菌,改善饲料成分的结构,便于饲料储运,增加禽畜的采食量和营养吸收效率。
一种热稳定性和蛋白酶抗性提高的植酸酶突变体及其制备方法和应用[发明专利]
![一种热稳定性和蛋白酶抗性提高的植酸酶突变体及其制备方法和应用[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/409e0c2c53ea551810a6f524ccbff121dd36c5f2.png)
专利名称：一种热稳定性和蛋白酶抗性提高的植酸酶突变体及其制备方法和应用
专利类型：发明专利
发明人：郭建军,曾静,袁林,黄国昌,熊大维,王振希,聂俊辉
申请号：CN202111458828.8
申请日：20211202
公开号：CN114164193A
公开日：
20220311
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种热稳定性和蛋白酶抗性提高的植酸酶突变体及其制备方法和应用，属于基因工程和酶工程领域。
本发明将植酸酶YiAPPA中第108位丙氨酸和第322位丝氨酸均突变为半胱氨酸，向植酸酶YiAPPA中引入二硫键C108‑C322，获得突变体YiAPPA‑A108C/S322C。
本发明提供的植酸酶突变体YiAPPA‑A108C/S322C于85℃的半衰期由对照(突变前)的6min提高至15min，提高了1.5倍，并且YiAPPA‑A108C/S322C的胃蛋白酶抗性和胰蛋白酶抗性分别提高了16％和12％。
植酸酶突变体YiAPPA‑A108C/S322C的热稳定性和蛋白酶抗性明显改良，在动物饲料添加剂领域具有良好的应用前景。
申请人：江西省科学院微生物研究所,江西鑫维生物技术有限公司
地址：330000 江西省南昌市昌东大道7777号
国籍：CN
代理机构：深圳市智旭鼎浩知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：周超
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制剂学技术提高植酸酶热稳定性的研究进展
料中，在制粒温度为 75 ℃时，这 2 种植酸酶在颗粒 饲料中的活性回收率是相 似 的; 但 在 制 粒温度为 85 ℃时，来自黑曲霉的植酸酶活性比来自烟曲霉的 植酸酶活性要丧失得更多。 1.2 制粒过程
制粒过程中的高温、高湿和挤压是造成植酸酶 活性损失的关键因素：1) 高温引起酶蛋白分子中氢 键和疏水键断裂，从而改变酶分子的构象，使酶失 活。 生物酶制剂热稳定性差，易失活，在常温条件下 长期存放的干燥酶粉也易失活。 颗粒温度达到 84 或 87 ℃ 时 ， 则 酶 的 活 性 丧 失 17 % 或 54 % ；2)R P Igamnazarov 等（1999）指出，植酸酶去折叠温度与水 分活度相关。 完全干燥的植酸酶 去 折 叠 温 度 为 165 ℃；含 12 %的水分时去折叠温度迅速降为95 ℃； 含 16 %的水分时去折叠温度降为 88 ～ 90 ℃。 在制 粒时，湿与热同时起作用。 相比干热，湿热更具穿透 性，更能够穿透到植酸酶内部，破坏酶的三维结构； 3) 高压能改变酶蛋白的空间多维结构而导致酶变 性。
2 制剂学技术提高植酸酶热稳定的方法
提高植酸酶热稳定性常用的方法有以下几种: 1)自 然 选 择 法 ：即 筛 选 耐 高 温 菌 种 释 放 的 植 酸 酶 ；2) 固定化包埋：将酶固定在不溶性载体上，从而稳定 酶构象，消除逆性因子的变形作用，从而提高植酸 酶稳定性；3)蛋白质工程法：即通过基因工程重组得 到 耐 高 温 酶 的 基 因 ，再 表 达 获 得 热 稳 定 性 植 酸 酶 ；4) 化学修饰法: 通过化学试剂特异性修饰酶活性中心 的某个或某类氨基酸， 从而稳定蛋白质的构象，提 高其耐热性；5)制剂学方法：通过向植酸酶溶液添加 稳定剂、将植酸酶与载体结合制成普通颗粒、将植 酸酶颗粒进行液体后喷涂和包被等制剂学技术来 提高植酸酶的热稳定性。 2.1 添加稳定剂
提高植酸酶热稳定性的技术途径及产品评测方法
提高植酸酶热稳定性的技术途径及产品评测方法制粒是常用的饲料加工工艺，通过制粒改善饲料适口性，提高饲料利用率，保证动物均衡采食营养素和提高生长速度，同时在压制过程中实现高温杀菌。
在制粒过程中，通常会通入一定压力的蒸汽，从而使粉料在进入环模制粒前达到较高的温度，即调质过程。
粉料温度的测定点一般紧靠在调质器的出口处，这里测定的温度也就是通常所说的制粒温度，理想的制粒温度范围在80-90℃。
而实际使用的蒸汽温度则远高于此，湿蒸汽、饱和蒸汽和过热蒸汽的温度分别可以达到100、140和160℃，同时粉料通过制粒机环模后温度也会因摩擦力而增加。
此外，蒸汽调质时的高湿环境增强了热能的传递。
这些都对饲料中的热敏性因子，如植酸酶产生极大的破坏。
制粒对植酸酶的破坏源于高温对其空间结构的破坏，目前饲料上应用的植酸酶大部分属于酸性磷酸酶家族，其空间上包含两个结构域，因植酸酶的菌种来源不同，其包含的α、β结构数量不一，如无花果曲霉植酸酶的结构是由一个较大的α、β结构域和一个小的α结构域组成，α、β结构域是由5个α螺旋和8个β折叠构成，α结构域是由4个α螺旋组成。
而大肠杆菌植酸酶的两个结构域一个是由5个α螺旋和2个β折叠组成，另一个是由6个α螺旋和9个β折叠组成。
植酸酶活性部位的氨基酸序列具有高度保守性，其间的氨基酸被修饰或突变后都会导致酶活性的丧失，但高温的影响则在于去折叠效应。
植酸酶目前已通过基因工程微生物发酵实现了大规模廉价生产，而今，生物工程技术也为解决植酸酶的热稳定性提供了很好的途径。
同时研究发现，一些分子能通过化学修饰有效提高植酸酶的热稳定性。
此外，新型包被技术和包被材料的应用进一步提高了植酸酶热稳定性。
1、生物工程技术设计制造耐热植酸酶菌株自然界产生植酸酶的微生物多种多样，每种植酸酶的性质各不相同，自然界中存在的烟曲霉、淀粉液化芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌等中分离到的植酸酶都能耐受高温，但都在37℃时酶活性极低，缺乏饲用价值（见表1）。
饲用植酸酶热稳定性的研究
饲用植酸酶热稳定性的研究
赵海霞;王红宁;陈惠
【期刊名称】《微生物学通报》
【年(卷),期】2004(31)1
【摘要】植酸酶是一种能将植物性饲料中植酸(盐)降解为肌醇和无机磷酸盐的酶类.其作为单胃动物的饲料添加剂,对提高畜禽业生产效益及降低植酸磷对环境的污染有重要意义.针对目前饲用植酸酶存在的热稳定性不高的问题,介绍了国内外近年来的研究进展,并提出了解决的方法.
【总页数】5页(P105-109)
【作者】赵海霞;王红宁;陈惠
【作者单位】四川农业大学动物科技学院,雅安,625014;四川农业大学动物科技学院,雅安,625014;四川农业大学生命理学院,雅安,625014
【正文语种】中文
【中图分类】Q946.5
【相关文献】
1.大肠杆菌K12植酸酶热稳定性突变体在毕赤酵母中的高效表达和性质研究 [J], 周玉玲;邹由;付玲;江维;战飞翔;康立新;马向东;马立新
2.植酸酶包埋后酶活和热稳定性的变化规律研究 [J], 尹清强;张书锋;冯华;左瑞雨;郑秋红;程伟
3.海藻糖对植酸酶热稳定性的影响研究 [J], 李融;苏琰
4.从后处理工艺提高植酸酶热稳定性的研究进展 [J], 刘梅英;彭健;刘敏跃;高雁
5.制剂学技术提高植酸酶热稳定性的研究进展 [J], 张萍;王成润;邹积宏;金一因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
南昌大学科技成果——植酸酶热稳定性研究及其高温剂型开发
南昌大学科技成果——植酸酶热稳定性研究及其高
温剂型开发
技术原理
颗粒高温植酸酶制剂是一种新型的饲料添加剂，具有催化植酸及植酸盐水解成肌醇或磷酸盐，提高饲料中有机磷的利用率，减少环境的磷污染和解除植酸的抗营养作用等功能，是一种高效环保型生物饲料添加剂。
技术原理主要通过强化酶和载体的多点结合，使酶蛋白的构象更加稳定。
应用天然的多羟基化合物颗粒化材料还原末端含有许多的游离羟基，结合酶蛋白分子侧链氨基酸残基中的自由氨基提高酶结构的刚性和热稳定性。
产品技术性能指标达到颗粒酶90℃下30min，酶失活率为8%-13%；产品90%为球型颗粒，酶活2000-2500IU/g；常温保存一年酶的失活率≤10%。
技术特点
该成果应用生物酶活性结构的保护和微环境控制技术，有效提高植酸酶制剂的高温稳定性、添加流散性和保存稳定性；高温稳定性优于国外同类产品公开标准。
颗粒高温植酸酶制剂主要用于猪禽饲料和水产饵料。
植酸酶其最大的经济价值在于可减少饲料中磷酸氢钙等，无机磷的使用量在80%以上，向环境排泄的磷相应减少50%以上，可使氮污染排泄量降低10%。
市场预测
根据目前国际上植酸酶产品的一般价格折算，按年产600吨新型
高温植酸酶饲料添加剂的生产规模，其经济指标初步估算为：产品市场价：200元/kg（2000-2500IU）产值：200元/kg×1000kg×600=12000万元；总成本：80元/kg×1000kg×600=4800万元；利税：12000万元-4800万元=7200万元。
合作方式技术转让。
提高真菌植酸酶热稳定性的方法
的 方 法
宋会仪： 浙江大学动物科学学院。
通 过 构 建 基 因 工 程 菌 不 仅 可 以 提 高 真 菌 植
维普资讯
科技 视 伽 ７ｈｌ ｔ Ｓ ｉ 野 ｃ。 ｕ ｃ ｄ ｎ。 Ｏ
３ ４
植 酸 ． 称 肌 醇 六 磷 酸 ， 植 物 籽 实 中磷 的 又 是 主要 贮存 形 式 ， 是 一种 抗 营养 凶子 ， 胃动 物 也 单
ｓ ． ： 括 黑 曲霉 （ 花 果 曲霉 ） ｎ ｅ （ Ｍ ｍ） ｐ） 包 无 Ａ．ｉ ｒ肛 “ 、 ｇ 炯 曲霉 （ ｆ ｍ ｇｔｓ 、 曲霉 （ ． ｒ ｕ ） 米 曲霉 Ａ． ｉａｕ ） 土 ｕ Ａｔ ｒ ｓ 、 ｅｅ （ ｏｙａ ） ； Ａ． ｚｅ 等 根霉 属 （ ｈｚｐ ｓｓ．包括 Ｒ ｉ ｐ ｓ ｒ Ｒ ｉ ｕ ） ｏ ｐ ｈｚ ｕ ｏ
了耐 热 性 真 菌 Ｔ ｅｍ ｍ ｃｓｌ ｕ ｉｏｕ ｈｒ ｏ ｙ ｅ ａ ｇ ｓ ｓ的植 酸 ｎ ｎ 酶基 并 表达 ， 化 子产 生 的酶 活 高 ＿ 对 照菌 株 转 ｒ ｌ（ 倍 ． ５） 热稳 定性 也有 一定 提高 。 ２２ 真 菌植 酸 酶 的蛋 白质工程 ． 通 过 重 组 摹 冈 工 程 菌 构 建 得 到 的耐 热 植 酸 酶在 ３ 的酶 活往 往较 低 ， 不能 很 大 程度地 提 ７ 也
酶是 胞外酶 ，容 易分离 提 纯 ，而且 ｐ 作用 范 同 Ｈ 广、 活性 高 ． 饲用 植 酸酶 的 最佳 来 源 ， 是 已经 实现
７ｏ处理 残 余 酶 活仍 能 达 到 ８ ％） ０（ ＝ ０ ，多 数真 菌 植
酸酶 热稳 定性 不高 。
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大 学饲 料 科 学研 究所 教 育 部 动 物 分 子
植酸酶耐热性评价方法的研究
植酸酶耐热性评价方法的研究制粒对植酸酶活性的影响一直是限制植酸酶进一步推广应用的重要因素,针对这一问题,目前解决的方法有提高植酸酶添加量、包被技术、采用液体植酸酶制粒后喷涂技术、通过微生物菌株遗传改良开发耐高温植酸酶产品等。
不管是哪种途径,制粒对植酸酶活性的影响是不可避免的,有效评价制粒过程中植酸酶活性的损失具有重要的应用价值。
研究旨在系统比较水浴法、干热法和湿热法在评价植酸酶耐热性的效果,并比较同一温度条件下水浴法、干热法和湿热法测定结果与实际调质和制粒加工处理条件下的测定结果,来筛选相对科学、更能反映实际调质和制粒对植酸酶活性影响的实验室评价方法。
1 材料与方法1. 1 试验材料试验用植酸酶A、B、C来源于目前市场上具有代表性的产品,其中植酸酶A来源于真菌;植酸酶B来源于细菌;而植酸酶C来源于真菌,但经过了包被处理。
1. 2 试验方法水浴法:正确称取酶样品0. 8 g,转移到100 mL容量瓶中,用含有吐温-20的乙酸缓冲溶液定容至100 mL,提取45 min。
待溶解混合完成后,分别取3个10 mL离心管,分别取1 mL上述溶液转移到离心管中,再用含有吐温-20的乙酸缓冲溶液定容至10 mL,分别置于70, 80, 90e水浴锅加热10 min(5 min预热, 5 min加热处理),取出用于测定高温处理后溶液中植酸酶活性。
干热法:用称量瓶(30mm@50mm)分别称取2 g植酸酶A、B、C样品,置于70, 80, 90e恒温烘箱中处理10 min(其中前5 min为预热期),取出冷却后备用。
湿热法:先测定各种植酸酶样品中水分含量,用称量瓶(30mm@50mm)分别称取2 g植酸酶A、B、C样品,根据植酸酶样品中水分含量并通过添加纯化水的方法调节待处理植酸酶样品中水分至16% (模拟实际调质和制粒时配合饲料通入蒸汽后湿度),置于70, 80, 90e恒温烘箱中处理10min(其中前5min为预热期),取出冷却。
基因工程植酸酶表达的优化途径和方法
外源基因在表达的过程中同时伴随着一定量的 蛋白酶的表达。因此, 表达的外源蛋白就存在被降解 的可能, 在一定程度上影响蛋白质的表达量, 同时, 还 给目的蛋白的纯化带来难度。为了提高外源蛋白在 发酵液中的稳定性, 免受蛋白酶降解, 可采用以下几 种方法: ( 1) 使用蛋白酶缺陷株作为受体菌, 保护外 源蛋白不被降解。( 2) 培养基中添加蛋白胨或酪蛋 白水解物等物质作为蛋白酶的底物。( 3) 可调节溶 液 pH 值抑制蛋白水解酶活性, 防止目的蛋白降解。 ( 4) 突变外源蛋白基因的个别位点, 改变其蛋白序列 中蛋白酶的作用部位使其免受蛋白酶的破坏[9]。 2. 6 发酵条件的优化
酵母是单细胞低等真核微生物, 作为表达系统 具有独特的优点。与大肠杆菌不同的是, 酵母可以 对异源蛋白进行修饰, 当采用酵母信号肽时, 蛋白能 被正确折叠和加工, 然后分泌到培养基中, 能适应工 业化生产的需要。此外, 酵母易培养、繁殖快; 遗传 背景清楚, 便于进行遗传操作, 且使用安全, 已长期 广泛应用于酿酒和食品工业。用于表达外源蛋白质 的甲醇营养型 酵母的宿主菌主要是巴 氏毕赤酵母 ( P. pastoris, Pp) 和多型汉逊酵母( H. polymorpha, Hp) 两种。此类酵母生存能力强, 易于培养, 在廉价 的非选择性或半合成培养基上能高密度生长, 其主 要特性是利用甲醇作为唯一碳源和能量来源。用该 系统表达蛋白可以获得大于 1 g/ L 的目的蛋白, 由 此可把此类系统列入表达量较高的真核表达系统之 一[ 2] 。Seonho 等[ 3] 将 来 源 于 大 肠 杆菌 的 植 酸 酶 AppA2 在毕 赤酵母中表达, 重组植酸 酶分子量 56 kD, 摇瓶发酵最高酶活 272 U/ ml, 最适 pH 3. 5, 最 适温度 55 e 。虽然酵母具有上述优点但也有不尽 人意之处, 在酵母中表达的外源蛋白容易出现过度 糖基化现象, 这一现象可阻碍外源蛋白的运输和分 泌。此外, 外源蛋白还可能形成聚合体而影响表达 效率, 其信号肽加工不完全或蛋白质的内部降解等, 可造成表达产物的差异, 产生极不均一的现象, 为表
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来源最适温度(℃热稳定性参考文献无花果曲霉58最高可以耐受65℃的高温Ullah 等(1998烟曲霉70100℃下加热20min 后,酶活仅损失10%Pasamontes 等(1997米曲霉5665℃时酶活损失80%张玉帧等(1997淀粉液化芽孢杆菌6090℃处理10min 后酶活可保留50%Kim 等(1998地衣芽孢杆菌6595℃处理15min 后酶活可保留61%Tye 等(2002枯草芽孢杆菌5560℃处理1h ,活性减少90%Kerovuo 等(1998番茄4560℃以下,活性很快损失李明刚等(1998植酸酶作为一种生物型饲料添加剂,对提高饲料中磷的利用率、动物的生产性能以及减轻因动物高磷粪便所导致的环境水污染具有重要意义。
目前,通过基因工程微生物发酵来大规模廉价生产饲用植酸酶制剂已经基本得到实现,但是植酸酶制剂应用上的另一个关键性问题,即酶的热稳定性始终没有得到很好解决。
饲料加工需经过制粒工艺,在制粒过程中有一个短暂的高温过程,温度一般为75~93℃,一般的植酸酶活性在此高温下大幅度地不可逆丧失,所以能在饲料中真正得到推广利用的植酸酶必须具有良好的热稳定性。
但另一方面,饲料用酶又必须在常温下具有较高的酶活性,因为其最终的作用场所是在动物正常体温(37℃左右的胃肠道中,这与工业上所用的一些高温酶不同。
这一矛盾是目前包括植酸酶在内的所有饲用酶制剂均需要迫切解决的问题。
1自然选择法从嗜温微生物嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila (Mitchell 等,1997、土曲霉(As-pergillus terreus (Mitchell 等,1997、淀粉液化芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens (Oh 等,2001、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis (Tye 等,2002中分离到的高温植酸酶其最适温度在70~80℃,虽然具有很好的耐热性,但它在37℃下的酶活性极低,在饲料中没有应用价值;相反,来源于黑曲霉(A.niger 等的植酸酶在37℃下具有较高酶活性,但它不能经受制粒时的高温(Ul-lah ,1998。
由于耐热性是受基因控制的,当嗜热酶基因在常温菌细胞中表达时,通常会保留酶的耐热性,这说明嗜热菌的耐热性是可以遗传的,编码嗜热酶的基因是对高温适应的结果(Zeikus 等,1998。
部分植酸酶热稳定性见表1。
2蛋白质工程法随着基因工程技术及分子生物学技术的发展,蛋白质工程法逐渐成为人们研究蛋白质稳定性的主要手段。
目前在蛋白质热稳定性工程中常用的方法为:1推理设计(rational design ;2同序概念(consensus concept ;3杂合酶(hybrid en-zyme ;4定向进化(directed evolution 。
2.1推理设计推理设计主要是把热稳定蛋白改善植酸酶热稳定性的策略浙江大学饲料科学研究所教育部动物分子营养学重点实验室付石军孙建义表1部分植酸酶的热稳定性[摘要]植酸酶作为一种生物型饲料添加剂对提高饲料中磷的利用率、动物的生产性能以及减轻因动物高磷粪便所导致的环境水污染具有重要意义,但由于其热稳定性差,植酸酶的推广和应用受到限制。
本文综述了自然选择法、蛋白质工程法、化学修饰法及生产工艺方面改善热稳定性的策略,并对其研究前景作了展望。
[关键词]植酸酶;热稳定性;自然选择;蛋白质工程;生产工艺[中图分类号]S816.7[文献标识码]A[文章编号]1004-3314(200714-0026-04[Abstract]Phytase is a new-style enzyme used in monogastric animal feeds.It can increase phosphorus availability ,the performance of animal ,and decrease environmental phosphorus pollution.The application of natural phytase is limited due to its thermostability.The strategies of improving phytase thermostability ,with a view to discuss the research prospects were reviewed.[Key words]phytase ;thermostability ;natural selection ;protein engineering ;manufacturing technology 动物营养与热不稳定蛋白的氨基酸序列进行比较,分析究竟是哪些氨基酸对蛋白质的热稳定性起关键作用。
卢柏松等(1998对嗜热菌与常温菌的氨基酸组成做了比较,发现嗜热菌氨基酸中亮氨酸(Leu、脯氨酸(Pro、谷氨酸(Glu和精氨酸(Arg含量均高于常温菌,而胱氨酸(Cys、丝氨酸(Ser、苏氨酸(Thr、谷胺酰胺(Gln和天门冬氨酸(Asp含量显著低于常温菌。
Pro结构熵小,易折叠,且一经折叠,需要很高的能量才能解开,从而提高蛋白质稳定性。
Glu和Arg分别比带同样电荷的氨基酸有更大的侧链,侧链所提供的疏水作用及离子间互相作用能提高蛋白质的稳定性。
Leu具有较强的疏水性和较大的侧链。
Jaenicki (1996对嗜热菌蛋白与常温菌蛋白进行研究,发现嗜热菌蛋白与常温菌蛋白的大小、亚基结构、螺旋程度、极性大小和活性中心都极相似,但由于构成蛋白质高级结构的非共价力、结构域的包装、亚基与辅基的聚集,以及糖基化作用、磷酸化作用等不尽相同而导致热稳定性不同。
事实上,酶的热稳定性受到许多因素的影响,如氨基酸序列、三维结构、辅助因子及pH值等。
目前普遍采用的手段是基因定向突变,通过改变某个或几个氨基酸来改变蛋白质结构,提高热稳定性。
其中,脯氨酸残基在稳定蛋白质结构和提高酶热稳定性方面具有不可忽视的作用。
脯氨酸具有较大的比咯烷环,偏爱β-转折或无规卷曲结构,所以只要在主链构象不发生聚变的情况下可在适当的β-转折或无规卷曲结构中,通过其刚性的比咯烷环,降低脯氨酸去折叠时的骨架熵和肽链骨架的柔性,从而使周围构象更稳定、牢固。
对于植酸酶,可把邻近活性中心处的柔性较大的甘氨酸、苏氨酸等替换为脯氨酸,但注意最好不要替换活性中心的氨基酸,因为脯氨酸有较大的侧链,有可能阻止底物的进入,使植酸酶不表达或表达量少(赵海霞等,2004。
2.2同序概念同序概念是一种半推理的方法,是对一组同源蛋白质的氨基酸序列进行比较,以一定的标准程序计算各氨基酸序列,从中选择对每个氨基酸位点最保守的残基,拼成序列,然后将最后确定的氨基酸序列翻译成相应的DNA序列,最后选用合适的表达系统对这个“人造的”目的基因进行表达。
该方法具有以下优点:同序基因中的每个给定的氨基酸残基与同源野生蛋白质中相应位点的氨基酸残基至少有一个是适宜进化的,从而减少有害突变的冒险;此方法不需要了解蛋白质的三维结构;不需要进行高通量的筛选。
Lehmann等(2000把同序概念应用在真菌植酸酶家族含有13种不同子囊菌类的序列,进行同序比较计算,设计合成了同序植酸酶基因fcp,构建表达载体pFP,在H.polymorpha中表达出同序植酸酶-1。
同序植酸酶-1的最适温度增加了16~26℃,而催化性质与亲本植酸酶相似。
经定点突变发现在同序植酸酶-1中有5个氨基酸Tyr31、Pro225、Met342、Phe346和Tyr372表现增加同序植酸酶的热稳定性。
晶体结构表明,Met342和Phe346氨基酸残基增加疏水侧链的大小,导致更紧密的疏水核;Tyr31和Tyr372由于形成额外的氢键而增加稳定性;Pro225稳定同序植酸酶的环。
2.3杂合酶把来自不同酶分子的结构单元(二级结构、三级结构及功能域或整个酶分子进行组合或交换以产生具有所需要性质的优化酶杂合体结构,组合出新酶,并可产生催化自然界不存在的反应的新酶分子为杂合酶。
Jermutus等(2001根据黑曲霉(A.niger植酸酶晶体结构,将土曲霉(A. terreus植酸酶表面的一个二级结构α-螺旋(66~ 82区域用A.niger植酸酶上相应长度的一段序列替换,获得了酶活性未变而热稳定性提高的新植酸酶。
其原因在于两个不同来源的植酸酶在分子表面α-螺旋中氨基酸改变,导致疏水作用,增加热稳定性。
同源蛋白稳定性的不同是由于许多在进化中分散在整个序列中单点突变引起的。
通过用更稳定或较不稳定相互作用的同源片段改变具有很小稳定性或更多不稳定的相互作用的元素能引起稳定性的改善。
2.4定向进化定向进化主要包括多轮随机突变和DNA shuffling技术。
多轮随机突变是以目的基因进行第一轮随机突变,然后筛选出最佳突变子作为下一轮突变的亲本,如此循环下去获得性状优良的突变体(Lehmann和Wyss,2001。
DNA shuffling 技术是由Stemmer(1994提出的,DNA 改组是指DNA分子的体外重组,通过改变单一个或多个基因原有的核苷酸序列,创造新基因,并赋予表达产物以新功能。
实际上是一种分子水平上的定向进化,因此,也称为分子育种。
该方法可在短时间内通过重组有效的变异体发掘所有可能的重组体与突变序列。
该方法虽然在获得有益突变体方面有很大的优势,但有效的筛选方法对试验的成功与否至关重要。
3化学修饰法酶的化学修饰作为一种提高酶热稳定性的重要手段,是酶工程研究的重要课题。
根据X射线晶体衍射数据,蛋白质分子表面约一半是由疏水氨基酸占据着。
从热力学角度看,水溶液中疏水氨基酸与水接触对酶热稳定性不利。
因此,通过合适的化学修饰增加酶分子表面的亲水性,将有利于提高酶的热稳定性(Mozhaev等,1988。
不过,至今未找到普遍性的修饰规律,目前仅仅建立在分子模拟技术对修饰结果的合理推测上。
4生产工艺的改善法4.1添加酶稳定剂通常酶在非常干燥的情况下,构象比较稳定,具有一定的耐热性,而当体系中含有一定水分或者在高温水蒸汽作用下,酶就极易变性失活。
究其原因,酶的变性是由其空间三维结构的变化引起的,即构象发生了变化,从而导致酶活性中心的结构受到破坏,使其催化能力降低或丧失。
在热作用下,酶蛋白的热作用时间越长,酶失活越严重。
氢键在维持酶的空间构象中起着重要的作用,当体系中含有大量的自由水时,就会破坏酶分子内部的氢键,使酶分子构象容易发生变化,酶就易于变性失活。
在颗粒饲料制粒过程中酶制剂经历的正是高温、高湿和高压的环境,因此,在改善酶的热稳定性方面,不仅应考虑改善酶的热稳定性,还应考虑提高其耐湿性。