第六章_植物转化载体的构建
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“缴械”其“武装”的Ti载体，记为Onc-，构 建的Onc-载体叫“卸甲载体”。
• 卸甲载体：构建无毒的Ti质粒载体 • 例：pGV3850是从胭脂碱Ti质粒PTIC58衍生而来
植物基因转化载体系统
Ti质粒
天然Ti质粒存在的缺陷
目的基因
中间表达载体的特性
中间表达载体
改良的Ti质粒
转化载体系统
卸甲载体
一元载体系统
构建
双元载体系统
存在缺陷
• Ti质粒分子量过大，一般在160～240kb，在基因 工程中难以操作；
• 很难找到单一的酶切位点； • 生长在培养基上的植物转化细胞产生大量的生长
T-DNA区（transferred-DNA regions）：T-DNA是农杆菌侵 染植物细胞时，从Ti质粒上切 割下来转移到植物细胞的一段 DNA，称为转移DNA。该片断上 的基因与肿瘤形成有关（致瘤
基因）。
章鱼碱的遗传图
胭脂碱的遗传图
Vir区（毒性区）：与T-DNA区彼此相邻，该区段 上的基因与T-DNA从细菌转移到植物细胞的遗传 过程有关，区段上的基因能够使农杆菌表现毒性
Vir区段总长度约35kb，由7个互补群组成
毒性区中各位点的表达情况分为两种：
组成性表达
植物诱导性表达
Vir区(virulence region)：该区段激活T-DNA的转移， 使农杆菌表现出毒性，故称为毒性区。它与T-DNA区
相邻，合起来占质粒的1/3。
Vir基因的功能：
诱导根癌农杆菌附着到植物受伤的部位上-VirA蛋白
Vir基因产物加工T-DNA形成单股DNA片段-VirD蛋白
T-DNA被转入植物细胞，整合到寄主基因组中 --VirD、E蛋白
T-DNA基因被表达，使植物细胞增殖并产生冠 瘿碱
Con区(region encoding conjugation)：该区段上存
在着细菌间结合转移的有关基因（tra），调控Ti质 粒在农杆菌之间转移，冠瘿碱能激活tra基因，诱导
Ti质粒是根癌农杆菌染色体外的遗传物质； 双股共价闭合的环状DNA分子； T-DNA能够插入到植物基因组中并能稳定表 达； 长度150-200KB； 植物基因工程常用的载体。
Ti质粒的生物学功能
为农杆菌提供附着于植物细胞壁的能力; 参与寄主细胞合成植物激素吲哚乙酸（IAA）和细胞分裂 素（cyt）的活动; 诱发植物产生瘤并决定所诱导的肿瘤的形态学特征和冠 瘿碱的成分; 赋予寄主菌株具有分解代谢各种冠瘿碱化合物能力; 赋予寄主菌株对土壤杆菌所产生的细菌素的反应性; 决定寄主菌株的植物寄主范围; 有的Ti质粒能够抑制某些根瘤土壤杆菌噬菌体的生长发 育，即具有对噬菌体的排外性。
▪ T-DNA(Transfer DNA)
▪ 是农杆菌侵入植物细胞时从Ti质粒上转移到 植物细胞的一段DNA；
▪ T-DNA两端各有一段25bp的同向重复序列，是 T-DNA的边缘区（LB和RB）；
▪ 在同一条单链的LB和RB内各形成一个缺口， 单链T-DNA进入植物细胞。
Ti质粒的基因位点及其功能区
Ti质粒转移，因此称为结合转移编码区。
Opine diffuses into the surrounding cells and serves as a signal molecules for the
conjugation of the agrobacterium
Ori区(origin of replication)：该区 段基因调控Ti质粒的 自我复制，故称为复
1.它能作为媒介将外源基因导入植物细胞中去， 并且整合到宿主细胞的基因组DNA上；
2.它能提供被寄主细胞的复制和转录系统所识别 的DNA序列。
1977年Chilton等在研究农杆菌侵染后形成的植物肿瘤 细胞时，用分子杂交发现在肿瘤细胞中存在着农杆菌 Ti质粒的一个片段，称为T-DNA（Transfer-DNA）。实 验表明，T-DNA转移到植物细胞后整合进植物基因组中 并得以表达，从而导致了冠瘿瘤的发生。进一步研究 发现，整合到植物基因组中的T-DNA可以通过减数分裂 稳定地传给植物的后代，Ti质粒的上述特性成为农杆 菌介导法植物遗传转化的重要基础。
电镜下的根癌农杆菌
冠瘿瘤
1974年Zaenen等在根癌农杆菌内发现并分 离了一种与肿瘤诱导有关的大型质粒（大 于200kb），称为Ti质粒。
The
Agrobacterium tumefaciens
microbe adhering to plant cells.
作为植物基因转化的载体，必须具有两种功能：
• 根据其诱导的植物冠瘿瘤中所合成 的冠瘿碱种类不同分：
• 章鱼碱型（octopine） • 胭脂碱型（nopaline） • 农杆碱型（agropine） • 琥珀碱型（agrocinoine）
Ti质粒结构
T-DNA区、毒性区 ( vir)、质粒复制起点 ( ori)、 质粒结合转移位点 (con)、冠瘿碱分解位点 (ocs or nos)
制起始区。
Ti质粒是来自细菌（原核）系统，为何其基因能在真 核生物中表达？ 证据一. T-DNA的基因不含有内含子，几乎每个基因 的翻译起始位点都是AUG 证据二. 无论是胭脂碱合成酶基因nos还是章鱼碱合 成酶基因ocs的5’末端都具有真核特有的TATAbox,CAAT-box 证据三. T-DNA产生的mRNA均是典型的植物mRNA分子
素和分裂素阻止了细胞再生长为整株植物；
• Ti质粒只能在农杆菌中复制、繁殖而扩增，不能 在大肠杆菌中复制。
• Ti质粒上还存在一些对于T-DNA转移不起任何作用 的基因。
Ti质粒的改造-去除致瘤基因Onc
• 由于影响植株再生的直接原因是T-DNA中的Onc
基因的致瘤作用，因此，切除其致瘤源自因，使 成为无毒的质粒，即“卸甲” 、“解除” 、
植物转化载体的构建
植物遗传转化常用的方法 载体法转化——农杆菌介导法（Ti质粒） 非载体介导的遗传转化 （1）超声波法 （2）基因枪法 （3）脂质体法
农杆菌的Ti质粒
人们很早就发现双子叶 植物常发生一种冠瘿瘤病， 该病在法国、东欧和意大 利的葡萄和果树上曾大面 积发生。
1907年首先发现这种冠 瘿瘤病是由根癌农杆菌引 发的。
• 卸甲载体：构建无毒的Ti质粒载体 • 例：pGV3850是从胭脂碱Ti质粒PTIC58衍生而来
植物基因转化载体系统
Ti质粒
天然Ti质粒存在的缺陷
目的基因
中间表达载体的特性
中间表达载体
改良的Ti质粒
转化载体系统
卸甲载体
一元载体系统
构建
双元载体系统
存在缺陷
• Ti质粒分子量过大，一般在160～240kb，在基因 工程中难以操作；
• 很难找到单一的酶切位点； • 生长在培养基上的植物转化细胞产生大量的生长
T-DNA区（transferred-DNA regions）：T-DNA是农杆菌侵 染植物细胞时，从Ti质粒上切 割下来转移到植物细胞的一段 DNA，称为转移DNA。该片断上 的基因与肿瘤形成有关（致瘤
基因）。
章鱼碱的遗传图
胭脂碱的遗传图
Vir区（毒性区）：与T-DNA区彼此相邻，该区段 上的基因与T-DNA从细菌转移到植物细胞的遗传 过程有关，区段上的基因能够使农杆菌表现毒性
Vir区段总长度约35kb，由7个互补群组成
毒性区中各位点的表达情况分为两种：
组成性表达
植物诱导性表达
Vir区(virulence region)：该区段激活T-DNA的转移， 使农杆菌表现出毒性，故称为毒性区。它与T-DNA区
相邻，合起来占质粒的1/3。
Vir基因的功能：
诱导根癌农杆菌附着到植物受伤的部位上-VirA蛋白
Vir基因产物加工T-DNA形成单股DNA片段-VirD蛋白
T-DNA被转入植物细胞，整合到寄主基因组中 --VirD、E蛋白
T-DNA基因被表达，使植物细胞增殖并产生冠 瘿碱
Con区(region encoding conjugation)：该区段上存
在着细菌间结合转移的有关基因（tra），调控Ti质 粒在农杆菌之间转移，冠瘿碱能激活tra基因，诱导
Ti质粒是根癌农杆菌染色体外的遗传物质； 双股共价闭合的环状DNA分子； T-DNA能够插入到植物基因组中并能稳定表 达； 长度150-200KB； 植物基因工程常用的载体。
Ti质粒的生物学功能
为农杆菌提供附着于植物细胞壁的能力; 参与寄主细胞合成植物激素吲哚乙酸（IAA）和细胞分裂 素（cyt）的活动; 诱发植物产生瘤并决定所诱导的肿瘤的形态学特征和冠 瘿碱的成分; 赋予寄主菌株具有分解代谢各种冠瘿碱化合物能力; 赋予寄主菌株对土壤杆菌所产生的细菌素的反应性; 决定寄主菌株的植物寄主范围; 有的Ti质粒能够抑制某些根瘤土壤杆菌噬菌体的生长发 育，即具有对噬菌体的排外性。
▪ T-DNA(Transfer DNA)
▪ 是农杆菌侵入植物细胞时从Ti质粒上转移到 植物细胞的一段DNA；
▪ T-DNA两端各有一段25bp的同向重复序列，是 T-DNA的边缘区（LB和RB）；
▪ 在同一条单链的LB和RB内各形成一个缺口， 单链T-DNA进入植物细胞。
Ti质粒的基因位点及其功能区
Ti质粒转移，因此称为结合转移编码区。
Opine diffuses into the surrounding cells and serves as a signal molecules for the
conjugation of the agrobacterium
Ori区(origin of replication)：该区 段基因调控Ti质粒的 自我复制，故称为复
1.它能作为媒介将外源基因导入植物细胞中去， 并且整合到宿主细胞的基因组DNA上；
2.它能提供被寄主细胞的复制和转录系统所识别 的DNA序列。
1977年Chilton等在研究农杆菌侵染后形成的植物肿瘤 细胞时，用分子杂交发现在肿瘤细胞中存在着农杆菌 Ti质粒的一个片段，称为T-DNA（Transfer-DNA）。实 验表明，T-DNA转移到植物细胞后整合进植物基因组中 并得以表达，从而导致了冠瘿瘤的发生。进一步研究 发现，整合到植物基因组中的T-DNA可以通过减数分裂 稳定地传给植物的后代，Ti质粒的上述特性成为农杆 菌介导法植物遗传转化的重要基础。
电镜下的根癌农杆菌
冠瘿瘤
1974年Zaenen等在根癌农杆菌内发现并分 离了一种与肿瘤诱导有关的大型质粒（大 于200kb），称为Ti质粒。
The
Agrobacterium tumefaciens
microbe adhering to plant cells.
作为植物基因转化的载体，必须具有两种功能：
• 根据其诱导的植物冠瘿瘤中所合成 的冠瘿碱种类不同分：
• 章鱼碱型（octopine） • 胭脂碱型（nopaline） • 农杆碱型（agropine） • 琥珀碱型（agrocinoine）
Ti质粒结构
T-DNA区、毒性区 ( vir)、质粒复制起点 ( ori)、 质粒结合转移位点 (con)、冠瘿碱分解位点 (ocs or nos)
制起始区。
Ti质粒是来自细菌（原核）系统，为何其基因能在真 核生物中表达？ 证据一. T-DNA的基因不含有内含子，几乎每个基因 的翻译起始位点都是AUG 证据二. 无论是胭脂碱合成酶基因nos还是章鱼碱合 成酶基因ocs的5’末端都具有真核特有的TATAbox,CAAT-box 证据三. T-DNA产生的mRNA均是典型的植物mRNA分子
素和分裂素阻止了细胞再生长为整株植物；
• Ti质粒只能在农杆菌中复制、繁殖而扩增，不能 在大肠杆菌中复制。
• Ti质粒上还存在一些对于T-DNA转移不起任何作用 的基因。
Ti质粒的改造-去除致瘤基因Onc
• 由于影响植株再生的直接原因是T-DNA中的Onc
基因的致瘤作用，因此，切除其致瘤源自因，使 成为无毒的质粒，即“卸甲” 、“解除” 、
植物转化载体的构建
植物遗传转化常用的方法 载体法转化——农杆菌介导法（Ti质粒） 非载体介导的遗传转化 （1）超声波法 （2）基因枪法 （3）脂质体法
农杆菌的Ti质粒
人们很早就发现双子叶 植物常发生一种冠瘿瘤病， 该病在法国、东欧和意大 利的葡萄和果树上曾大面 积发生。
1907年首先发现这种冠 瘿瘤病是由根癌农杆菌引 发的。