实验技术路线 PPT
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
技术路线
大家好
1
双光子激光建立斑马鱼脊髓损伤模型的探索：
14dpf 幼年斑马鱼 0.033%MS222麻醉
明场下对脊髓定位，利用双光子强 激光对脊髓进行深度扫描切割损伤
对损伤后的斑马鱼 进行解剖，观察扫 描处的脊髓及周围 组织的损伤情况
同时在损伤位点以下 2mm注射反向示踪剂 生物胞素
12小时后做纵切切 片，利用GAFP抗 体和纤连蛋白抗体 做免疫染色
大家好
Westen Bolt： 提总蛋白 检测sema4e 和plxnd1蛋 白表达水平 的变化
3
sema4e与plxnd1关系研究：
sema4e特异性肽段的 设计与合成 噬菌体展示技术淘选抗体
sema4e活性片段 DNA的扩增 sema4e表达载体的构建
表达载体的导入
转染细胞的筛选与培养
表达蛋白的提取
取脊髓（损伤位点以下1cm）： 术后4hour, 12hour, 6day, 11day组
基因芯片分析： 提总RNA 分析全部基因 的表达水平， 统计分析各个 基因表达变化
定量PCR： 提总RNA 反转录
检测sema4e 和plxnd1 相 对内参 GADPH表达 水平的变化
原位杂交： 制作切片 制作探针 检测sema4e和 plxnd1 mRNA的 表达水平变化及 表达细胞
10X 11day
10X anti-sense probes
10X sham
10X 4大h家o好ur
10X 12hour
10X 11day 9
通过双光子显微镜活体观察斑马鱼 脊髓内的血管
大家好
10
plxnd1 在血管内皮细胞上表达
10X
20X
大家好
11
结束
大家好
12
ELISA检测抗体活性
表达蛋白的活性检测
ELISA检测抗体专一性
sema4e免疫磁珠的制作
sema4e与plxnd1
大家好
sema4e与plxnd1
4
免疫共定位
免疫共沉淀
sema4e与plxnd1在斑马鱼脊髓损伤修复中的作用研究：
大家好
5
前期结果
Baidu Nhomakorabea
大家好
6
图1：斑马鱼脊髓损伤后的运动能力的变化 Before lesion
Red: sham operation (n=10) Blue: operation (n大=家10好)
Real time PCR
change folds
time points
大家好
8
sema4e:
10X anti-sense probes plxnd1:
10X sham
10X 4hour
10X 12hour
12小时后做纵切切片， 利用生物胞素抗体做 免疫染色
判断胶质斑痕的位 置与大小是否符合
5小时后通过行为 学软件分析损伤 后的运动能力， 判断损伤程度
判断损伤的位置与大大家好
2
小是否与符合
前期实验：
手术建模： 手术组（n=68） 假手术组（n=68）
建模成功性分析：每周分析术 后运动能力，连续跟踪7周
大家好
1
双光子激光建立斑马鱼脊髓损伤模型的探索：
14dpf 幼年斑马鱼 0.033%MS222麻醉
明场下对脊髓定位，利用双光子强 激光对脊髓进行深度扫描切割损伤
对损伤后的斑马鱼 进行解剖，观察扫 描处的脊髓及周围 组织的损伤情况
同时在损伤位点以下 2mm注射反向示踪剂 生物胞素
12小时后做纵切切 片，利用GAFP抗 体和纤连蛋白抗体 做免疫染色
大家好
Westen Bolt： 提总蛋白 检测sema4e 和plxnd1蛋 白表达水平 的变化
3
sema4e与plxnd1关系研究：
sema4e特异性肽段的 设计与合成 噬菌体展示技术淘选抗体
sema4e活性片段 DNA的扩增 sema4e表达载体的构建
表达载体的导入
转染细胞的筛选与培养
表达蛋白的提取
取脊髓（损伤位点以下1cm）： 术后4hour, 12hour, 6day, 11day组
基因芯片分析： 提总RNA 分析全部基因 的表达水平， 统计分析各个 基因表达变化
定量PCR： 提总RNA 反转录
检测sema4e 和plxnd1 相 对内参 GADPH表达 水平的变化
原位杂交： 制作切片 制作探针 检测sema4e和 plxnd1 mRNA的 表达水平变化及 表达细胞
10X 11day
10X anti-sense probes
10X sham
10X 4大h家o好ur
10X 12hour
10X 11day 9
通过双光子显微镜活体观察斑马鱼 脊髓内的血管
大家好
10
plxnd1 在血管内皮细胞上表达
10X
20X
大家好
11
结束
大家好
12
ELISA检测抗体活性
表达蛋白的活性检测
ELISA检测抗体专一性
sema4e免疫磁珠的制作
sema4e与plxnd1
大家好
sema4e与plxnd1
4
免疫共定位
免疫共沉淀
sema4e与plxnd1在斑马鱼脊髓损伤修复中的作用研究：
大家好
5
前期结果
Baidu Nhomakorabea
大家好
6
图1：斑马鱼脊髓损伤后的运动能力的变化 Before lesion
Red: sham operation (n=10) Blue: operation (n大=家10好)
Real time PCR
change folds
time points
大家好
8
sema4e:
10X anti-sense probes plxnd1:
10X sham
10X 4hour
10X 12hour
12小时后做纵切切片， 利用生物胞素抗体做 免疫染色
判断胶质斑痕的位 置与大小是否符合
5小时后通过行为 学软件分析损伤 后的运动能力， 判断损伤程度
判断损伤的位置与大大家好
2
小是否与符合
前期实验：
手术建模： 手术组（n=68） 假手术组（n=68）
建模成功性分析：每周分析术 后运动能力，连续跟踪7周