一株黄原胶降解菌的筛选与鉴定

基参考 刘 晗等 配制 ．
１ ． ４ 培养 基粘度 测定
乌 氏粘度计 ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ使用 参见《 基础 化学 实验教 程 》 Ｌ ８ Ｊ ．
１ ． ５ 菌株 的形态 学观察 （ １ ） 菌落形态 的观察． 将 菌株接 种于黄 原胶 固体 平板 培养基 上 中 ， ３ ７℃ 培养 ２ ４ ｈ ， 观察平板上菌 落的生长状况及菌落形态 ． （ ２ ） 革 兰氏染 色和芽胞染色． 详 细步骤 参见《 微生物学实验 》 ＿ ｇ Ｊ ． １ ． ６ 菌株 的常规 生理 生化特 征 的鉴 定 将 菌 株 接 种 于 富集 培 养 基 中 ， 于 ３ ７℃ 条 件 下 活化 培 养 ２ ４ ｈ
４ ６ ６
湖北大学学报（ 自然科学版）
第 ３ ５卷
１ 材 料 与方 法
１ ． １ 供试 菌 湖 北大 学应用 生化 实验室保 存 的黄原 胶 降解 菌菌 液．
取 菌液 接种 至 富集 培 养基 ， ３ ７℃ 、 摇速 １ ８ ０ ｒ ／ ｍｉ ｎ条 件 下 进行 培 养 ， 培养 ２ ４ ｈ １ ． ２ 菌株 的 富集培 养
ａ ｎ ａ ｌ ｙ ｓ ｉ ｓ ｒ ｅ ｓ ｕ ｌ ｔ ｓ ，ｗｅ ｃ ｏ ｎ ｆ ｉ ｒ ｍｅ ｄ ｔ ｈ ｅ ｓ ｔ ｒ ａ ｉ ｎ ｓ ｂ ｅ ｌ ｏ ｎ ｇ ｅ ｄ ｔ ｏ ｔ ｈ ｅ ｇ ｅ ｎ ｕ ｓ Ｂａ ｃ ｉ ｌ ｌ ｕ ｓ ｏ ｆ Ｂ ａ ｅ ｉ ｌ ｌ ａ ｃ ｅ ａ ｅ ． Ｔｈ ｉ ｓ ｒ ｅ ｓ ｕ ｌ ｔ
后， 吸取 培养液 转移 至新 的富集 培养基 中， 以相 同条 件继续 培养 ２ ４ ｈ ． 经 过 多次 的富集培 养 ， 使 培养液 中 可 以降解 黄原胶 的菌 株得 到富集． 在配制 的黄 原胶 富集培 养基 ＿ ６ 中添加 的黄原 胶浓度 为 ５ ｇ ／ Ｌ ． １ ． ３ 菌 株 的分 离纯 化 吸取富集 培养 后 的培养液 ， 稀释 １ ０ 倍 后涂 布 于黄 原胶 固体 培 养基 ， 观 察平 板
上 菌株 的生长情 况 ． 挑取平 板上 生长 良好 的菌株接 入 黄原 胶选 择 性培 养基 中 ， ３ ７℃ 、 摇速 １ ８ ０ ｒ ／ ｍｉ ｎ条
件 下培养 ２ ４ ｈ ， 观 察培养 液 的粘度变 化 ， 制 作菌 株 的生 长 曲线 ． 黄 原胶 固体 培养 基 和黄 原 胶选 择 性 培养
１ ． ７ 菌株 的碳 源及 氮源 的选择
将菌 株 接种 至 碳源 利 用基 本 培养 基 和 氮源 利 用基 本 培养 基 中， ３ ７℃
进行 培养 ７ ２ ｈ ， 连续 传代 ３次 ， 观察菌 株 的生 长情 况 ， 生 长则 为 阳性 ， 不 生长 则 为 阴性． 测试 用 的碳 源 有 蔗糖 、 木糖 、 乳糖 、 麦芽 糖 、 甘 露糖 、 葡萄糖 、 山梨 醇和 鼠李糖 ． 测试 用 的氮 源有 尿素 、 硝酸铵 、 硝 酸钾 、 氯 化 铵、 硝酸钠 和酪 蛋 白． 碳源基 本培养 基用 选择 的碳源 替 代 富集 培养 基 中的黄 原 胶 ； 氮源 基 本培 养 基用 选
ｌ ａ ｙ ｅ ｄ ａ ｆ ｏ ｕ ｎ ｄ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｔ ｏ ｉ ｍｐ ｒ ｏ ｖ ｅ ｔ ｈ ｅ ａ ｂ ｉ ｌ ｉ ｔ ｙ ｏ ｆ ｄ ｅ ｇ ｒ ａ ｄ ａ ｔ ｉ ｎ ｇ ｓ ｔ ｒ ａ ｉ ｎ ｓ ｘ ａ ｎ ｔ ｈ ａ ｎ ｇ ｕ ｍ ｆ ｏ ｒ ｆ ｕ ｒ ｔ ｈ ｅ ｒ ｄ ｅ ｖ ｅ ｌ ｏ ｐ ｍｅ ｎ ｔ ａ ｎ ｄ ｔ ｈ ｅ ｉ ｍｐ ｒ ｏ ｖ ｅ ｍｅ ｎ ｔ ｏ ｆ ｔ ｈ ｅ ｓ ｔ ｒ ａ ｉ ｎ ｓ ｏ ｆ ｓ ｉ ｔ ｅ － ｄ ｉ ｒ ｅ ｃ ｔ ｅ ｄ ｍｕ ｔ ａ ｇ ｅ ｎ ｅ ｓ ｉ ｓ ． Ｋｅ ｙ ｗｏ ｒ ｄ ｓ ｘ ａ ｎ ｔ ｈ ａ ｎ － ｄ ｅ ｇ ｒ ａ ｄ ｉ ｎ ｇ ｂ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ｕ ｍ ；ｍｏ ｒ ｐ ｈ ｏ ｌ ｏ ｇ ｉ ｃ ａ ｌ ｃ ｈ ａ ｒ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ｓ ｔ ｉ ｃ ｓ ；ｐ ｈ ｙ ｓ ｉ ｏ ｌ ｏ ｇ ｉ ｃ ａ ｌ ａ ｎ ｄ ｂ ｉ ｏ ｃ ｈ ｅ ｍｉ ａｌ ｃ ｃ ｈ ａ ｒ ａ ｃ ｔ ｅ ｉｓ ｒ ｔ ｉ ｃ ｓ ；１ ６ Ｓ ｒ ＤＮＡ ｇ ｅ ｎ ｅ ｓ ｅ ｑ ｕ ｅ ｎ ｃ ｅ ａ ｎ ａ ｌ ｙ ｓ ｉ ｓ
第 ３ ５ 卷第 ４期
２ ０ １ ３年 １ ２月
湖北 大学 学报 （ 自然科学版）
Ｊ ｏ ｕ ｒ ｎ ａ ｌ ｏ ｆ Ｈｕ ｂ ｅ ｉ Ｕｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ（ Ｎａ ｔ ｕ ｒ ａ ｌ Ｓ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ ）
Ｖ０ １ ． ３ ５ Ｎｏ ． ４ Ｄｅ ｃ ． ，２ ０ １ ３
择 的氮源 替代 富集 培养基 中 的硝 酸钾 ． １ ． ８ 菌株 的 １ ６ Ｓ ｒ Ｄ Ｎ Ａ序 列分析及 系统 发育进 化树 的构 建 当菌株 细胞 浓度 ０ １ ） ６ 。 。 达到 ０ ． ２ ～Ｏ ． ３时 ， 进 行总 Ｄ Ｎ Ａ 的抽 提． 将 已抽提 出的菌株 总 Ｄ Ｎ Ａ作 为模板 ， 利用 Ｐ Ｃ Ｒ技术 扩增 出该 菌株 １ ６ Ｓ ｒ Ｄ Ｎ Ａ 片段［ ７ ］ ． 采用琼脂 糖凝 胶 电泳检测 Ｐ Ｃ Ｒ的产物 ， 再将 Ｐ Ｃ Ｒ的产 物交给上海桑尼生物科技 有限公 司进行 目的片段基
文章编号 ： １ ０ ０ ０ —２ ３ ７ ５ （ ２ ０ １ ３ ） ０ ４— ０ ４ ６ ５ 一Ｏ ４
一
株 黄 原 胶 降解 菌 的筛选 与鉴 定
刘亚云 ， 李洁 ， 杨伍 ， 苏柯 ， 杨艳 燕
（ 湖北大学生命科学学 院， 湖北 武 汉 ４ ３ ０ ０ ６ ２ ）
摘 要 从 土壤 中分 离 出一 株 能 够 降 解 黄 原胶 的 菌株 ， 对 这株 黄原 胶 降 解 菌 进行 形 态 特 征 、 生理 生 化 特 征 及 １ ６ Ｓ ｒ ＤＮＡ的序列分 析 ， 并利用系统发育分析等研究结果 ， 确认该菌株属于芽胞杆菌科 的芽胞 杆菌属 ， 为进一步 开展菌株
和１ ６ Ｓ ｒ Ｄ ＮＡ的序列分析 ， 确定该菌株的菌属 ， 为进一步利用该菌株降解黄原胶的研究奠定基础．
收稿 日期 ： ２ ０ １ ２—１ ２ —２ ８ 基 金项 目： ２ ０ １ ２年地方高校国家级大学生创新 创业训 练计划项 目及工业生物技术湖北省重点实验室资助 作者简介 ： 刘亚云 （ １ ９ ９ ０ 一 ） ， 女， 本科 生； 杨艳燕 ， 通信作者 ， 教授 ， Ｅ － ｍａ ｉ ｌ ： ｙ ａ ｎ ｇ ｙ ａ ｎ ｙ ａ ｎ ＠ｈ ｕ ｂ ｕ ． ｅ ｄ ｕ ． ｃ ｎ
０ 引 言
黄原胶又称汉生胶 ， 是由野油菜黄单胞菌分泌的一种胞外水溶性多糖． 作为一种无毒性的生物多 糖， 具有 良好的水溶性、 增粘性 、 乳化稳定性及对酸、 碱、 盐、 反复冻融的高稳定性等特点 ， 被广泛用于食
品、 医药 、 日用化 工及 石油 开采 等多 个领 域 ， 是 一种 用途 广泛 的微 生物 多糖 ｕ 七 Ｊ ． 但 黄原 胶具 有 的高稳 定性 是一 把双 刃剑 ， 使黄 原胶 可 以广 泛应 用 于各个 领域 的 同时 ， 也 带 来 了一 些 问题． 比如 ， 在石 油 开采工 业 中使用 黄原 胶作 为驱 替 剂 ， 可 以增 加 驱替 剂 的粘度 ， 提 高采 油 率 ； 但 黄 原 胶 的使 用 也使 得采 出液 的油 物性发 生 了变化 ， 如 原油 密度增 加 ， 粘度 增大 ， 采 出液含 聚浓 度增 加 ， 原 油乳 化 状 态复 杂 ， 增 加 了污水 处理 的难 度 ， 增加 了后 续工艺 如 油料运 输及 产 品纯化 成本 ｌ ３ ］ ． 因此 ， 唯有 寻找 到 有 效 降解 黄原 胶 的方法 ， 才 能使 黄原胶 更好 地应 用 于石油 开采业 中 Ｊ ． 本 实验对 一 株从 土壤 中分 离 的能降解 黄原 胶 的菌株 进行 了筛 选鉴定 ， 包 括形 态特 征 、 生 理 生化 特 征
Ａ ｘ ａ ｎ ｔ ｈ ａ ｎ ｇ ｕ ｍ ｄｅ ｇ ｒ ａ ｄａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｂ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ｕ ｍ ｉ ｄ ｅ ｎ ｔ ｉ ｆ ｉ ｃ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ
Ｌ Ｉ Ｕ Ｙａ ｙ ｕ ｎ ， Ｌ Ｉ Ｊ ｉ ｅ ， ＹＡＮＧ Ｗ ｕ， Ｓ Ｕ Ｋｅ ， ＹＡＮＧ Ｙａ ｎ ｙ ａ ｎ
后， 参 照 Ｎａ ｎ ｋ ａ ｉ Ｈ等［ １ ０ － １ １ 报 道 的方 法 ， 对该 菌 株 分别 进 行 淀 粉水 解 试 验 、 明胶液 化 试 验 、 石 蕊 牛 奶试 验、 甲基红 试验 、 乙酰 甲基 甲醇 （ Ｖ・ Ｐ ） 试验 、 柠檬 酸盐 利用试 验 、 吲哚试 验 以及 接触 酶试 验．
（ Ｓ ｃ ｈ ｏ ｏ ｌ ｏ ｆ Ｌｉ ｆ ｅ Ｓ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ ， Ｈｕ ｂ ｅ ｉ Ｕｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ， Ｗｕ ｈ ａ ｎ ４ ３ ０ ０ ６ ２， Ｃｈ ｉ ｎ ａ ）
Ａｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ Ａ ｓ ｔ ｒ ａ ｉ ｎ ｓ ｏ ｆ ｂ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ｕ ｍ ｔ ｈ ａ ｔ ｃ ａ ｎ ｄ ｅ ｇ ｒ ａ ｄ ｅ ｔ ｈ ｅ ｘ ａ ｎ ｔ ｈ ａ ｎ ｇ ｕ ｍ ｈ ａ ｓ ｂ ｅ ｅ ｎ ｉ ｓ ｏ ｌ ａ ｔ ｅ ｄ ｆ ｒ ｏ ｍ ｓ ｏ ｉ ｌ ． Ｗｅ ａ ｎ ａ ｌ ｙ ｓ ｅ ｄ ｔ ｈ ｉ ｓ ｘ ａ ｎ ｔ ｈ ａ ｎ － ｄ ｅ ｇ ｒ ａ ｄ ｉ ｎ ｇ ｂ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ｕ ｍ ｉ ｎ ｔ ｅ ｒ ｍｓ ｏ ｆ ｔ ｈ ｅ ｍｏ ｒ ｐ ｈ ｏ ｌ ｏ ｇ ｉ ｃ ａ ｌ ｃ ｈ ａ ｒ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ｓ ｔ ｉ ｃ ｓ ， ｐ ｈ ｙ ｓ ｉ ｏ ｌ ｏ ｇ ｉ ｃ ａ ｌ ａ ｎ ｄ ｂ ｉ ｏ ｃ ｈ ｅ ｍｉ ｃ ａ ｌ ｃ ｈ ａ ｒ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ｓ ｔ ｉ ｃ ｓ ａ ｎ ｄ １ ６ Ｓ ｒ ＤＮＡ ｓ ｅ ｑ ｕ ｅ ｎ ｃ ｅ ．Ｃ ｏ ｍｂ ｉ ｎ ｅ ｄ ｗｉ ｔ ｈ ｔ ｈ ｅ ｓ ｔ ｒ ａ ｉ ｎ ｓ ｏ ｆ ｍｏ ｒ ｐ ｈ ｏ ｌ ｏ ｇ ｉ ｃ ａ ｌ ｃ ｈ ａ ｒ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ｓ ｔ ｉ ｃ ｓ ，ｐ ｈ ｙ ｓ ｉ ｏ ｌ ｏ ｇ ｉ ｃ ａ ｌ ａ ｎ ｄ ｂ ｉ ｏ ｃ ｈ ｅ ｍｉ ｃ ａ ｌ ｃ ｈ ａ ｒ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ｓ ｔ ｉ ｃ ｓ ａ ｎ ｄ ｓ ｙ ｓ ｔ ｅ ｍ ｄ ｅ ｖ ｅ ｌ ｏ ｐ ｍｅ ｎ ｔ
因测序 ， 并将 测序得到 的基 因序 列输 入 ＮＣ Ｂ Ｉ 数据库 进行 Ｂ ｌ ａ ｓ ｔ 比对 ， 搜索 相 匹配 的相 关序列 作 为参 比 ， 用 Ｃ ＵＪ Ｓ １ 、 Ａ Ｉ ， Ｘ１ ． ８ ． １ 软件进行 序列 比对 ， ＭＥ Ｇ Ａ ３ ． １ 软件绘制供试 菌株与参 比菌株之 间的系统进化树．
改 良、 定 点诱变 等提高菌株降解黄原胶能力 的工作奠定基础． 关键词 黄原胶 降解菌 ； 形态特征 ； 生理生化特征 ； １ ６ Ｓ ｒ Ｒ ＮＡ基 因序列分 析
Ｑ９ ３ ６ 文献标 志码 Ａ Ｄ ＯＩ ： １ ０ ． ３ ９ ６ ９ ／ ｊ ． ｉ ｓ ｓ ｎ ． １ Ｏ ０ ０ — ２ ３ ７ ５ ． ２ ０ １ ３ ． ０ ４ ． ０ １ ４ 中图分类号