实时荧光PCR检测瓜炭疽病菌

实时荧光PCR检测瓜炭疽病菌

组织、种子样品经液氮研磨后用试剂盒提取基因组DNA，采用建立的实时荧光PCR 体系检测。

2 结果与分析

2.1 引物与探针

根据GenBank中瓜炭疽病菌的GAPDH基因和GS基因相关序列，设计得到扩增瓜炭疽病GAPDH基因和GS基因的特异性引物和TaqMan探针。GAPDH-3：5′-CCCTTCATTGAGACCAAGT-3′；GAPDH-4：5′-GTACTTGAGCATGTAGGCCT-3′；GAPDH-p：5′-CCGGGATCTCTGGCATTACG-3′，产物大小234 bp。GS-3：5′-TTCGTTCTCGAACACGAT-3′；GS-4：5′-GAGACATGACGACCTTGTTC-3′；GS-p：5′-TGCACGTCTGGTCCAGTTCTGT-3′，产物大小209 bp。

2.2 实时荧光PCR条件优化

对PCR中的关键性条件Tm值和Mg2+浓度进行优化，确定获得最大ΔRn值和最小循环阈值（Ct）的Tm值和Mg2+浓度。

结果表明，在建立的实时荧光PCR反应体系中，扩增GAPDH基因的最佳退火温度为57.9 ℃；Mg2+浓度为3.5 mmol/L；扩增GS基因的最佳退火温度为56 ℃；Mg2+浓度为3 mmol/L。

2.3 检测灵敏度

以不同浓度的瓜炭疽病菌菌株DNA为模板，按照优化后的体系进行实时荧光PCR检测，结果表明病菌DNA浓度越大Ct值越小，25 μL体系中有39.6 pg（10-3）的核酸量，虽

然信号非常弱，但依然可以被检测到（图1～4），说明实时荧光PCR方法所能够检测的最低DNA浓度为1.584 pg/μL。实时荧光PCR方法的产物采用琼脂糖凝胶进行检测，在10-1稀释倍数下还可以看到条带，但是10-2已无可识别条带（图5～6）。说明实时荧光PCR 方法较常规PCR后电泳方法的检测灵敏度高100倍。

2.4 引物和探针特异性检测

采用实时荧光PCR方法对表1中所列的14个供试菌株进行检测，结果表明，瓜炭疽病菌的8个菌株都检测到荧光，Ct值均小于30，采用GAPDH 基因检测时，Colletotrichum lindemuthianum没有荧光信号，但是采用GS基因检测时，除8个瓜炭疽病菌菌株外，C.lindemuthianum也出现强阳性信号，瓜上的其他病原菌和其他菌株均不产生荧光，因此设计的2对引物和探针共同检测才能有效地将瓜炭疽病菌与其他病原菌区分开来（图7～8），说明上述引物和TaqMan探针有很强的特异性。

2.5 样品检测

使用本试验设计的2对引物和探针对田间采集的具有瓜炭疽病症状的西瓜病果、病叶、实验室自制西瓜带菌种子、4批出口用西甜瓜种子进行检测，结果表明，田间采集样品、实验室自制带菌种子中检测到瓜炭疽病菌（图9a～b），供试的4批西甜瓜种子中没有检测到荧光信号，常规分离培养的方法也没有分离到病原菌，证明这4批种子中不含有瓜炭疽病菌，两种方法的检测结果一致。

3 讨论

GenBank中报道的瓜炭疽病菌序列很多，有ITS、β-tubulin （TUB2）、chitin synthase 1 gene（CHS1）、histone H3 gene （HIS3）、glyceraldehyde-3phosphate dehydrogenase gene （GAPDH）、actin gene （ACT）、glutamine synthase gene （GS）等，为设计特异性引物和探针提供了充足的信息。但是经过大量的网上BLAST比对，从已经公布的瓜

炭疽病菌的序列中很难找到突变位点设计探针，最终找到GAPDH基因和GS基因，但是仅仅单独检测GAPDH基因或GS基因不能确定病原菌为瓜炭疽病菌，必须对GAPDH基因和GS基因一起检测，才能够把瓜炭疽病菌与其他近似病原菌完全区别开来，所以本研究针对这两个功能基因设计两对引物和两条探针进行检测。

本研究选择瓜炭疽病菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）基因和谷氨酰胺合成酶（GS）基因序列设计引物和探针，通过对侵染瓜类作物的瓜炭疽病菌和其他5种病原菌的检测研究，表明该方法具有良好的特异性、稳定性和灵敏性。本研究首次对瓜炭疽病菌进行了较为系统、深入的分子检测技术的研究；建立了快速、准确、灵敏的瓜炭疽病菌实时荧光PCR检测技术；成功地设计出了针对瓜炭疽病菌，具有稳定点突变的特异性引物对GAPDH-3、GAPDH-4和T aqMan探针GAPDH-p、GS-3、GS-4和TaqMan探针GS-p，通过对荧光反应体系中的退火温度、Mg2+两个关键参数进行优化确定了最佳值，建立了实时荧光PCR 检测方法，确定GAPDH最佳退火温度为57.9 ℃，Mg2+浓度为3.5 mmol/L。GS最佳退火温度为56 ℃，Mg2+浓度为3 mmol/L。

利用该方法对14株供试菌株进行了实时荧光PCR检测，结果表明本研究所设计的引物和探针能检测出瓜炭疽病菌菌株，而其他病原菌的菌株和空白对照均未检测到荧光信号，表明该引物和探针对瓜炭疽病菌具有很高的特异性；该对引物和探针具较高的灵敏度，能够达到1.584 pg/μL，可见本研究建立的实时荧光PCR方法保证了不同样品间检测结果的可靠性和稳定性。整个PCR检测时间大约40 min，与普通PCR相比，极大地缩短了检测的时间，同时无需后续的电泳检测。应用本研究建立的T aqMan探针实时荧光PCR方法对田间采集样品和种子混菌样品进行检测，检测出阳性样品，此结果与分离检测结果一致。

瓜炭疽病菌长距离传播主要依靠感病的植株、病残体以及受侵染的种子等植物性材料。目前

国内未见报道有关检测该病菌的荧光PCR特异性引物和探针。目前瓜炭疽病菌的检验方法主要是常规种子带菌检验。这种方法经验性较强，瓜炭疽病菌和其他近似病原菌在形态上较难区分。因此建立针对瓜炭疽病菌的快速、准确的检测方法至关重要。

本研究中所采用的瓜炭疽病菌为菌株、田间发病样品或人为混合样品，因为采集的样品种类有限，没有进行更系统的验证，需要在后续试验中加以验证。

在进行序列比对时发现，单独检测GAPDH基因，无法区别Colletotrichum spinosum和Colletotrichum malvarum，单独检测GS基因，无法区别Colletotrichum malvarum、Colletotrichum trifolii和Colletotrichum lindemuthianum，由于收集菌株数量有限，有的菌株无法进行验证。

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