第六篇 分子生物学技术

用支持体的电泳技术
1).纸上电泳
2).醋酸纤维薄膜电泳
3).薄层电泳
4).非凝胶性支持体区带电泳 （支持体有：淀粉， 纤维素粉，玻璃粉，硅胶等)
5).凝胶支持体区带电泳 ①淀粉液 ②聚丙烯酰胺 凝胶 ③琼脂（糖）凝胶
不用支持体的电泳技术 1).微量电泳 2).显微电泳 3).等电点聚焦电泳技术 4).等速电泳技术 5).密度梯度电泳
放射性同位素的应用——同位素示踪法
同位素示踪法（isotopic tracer method） 是利用放射性核素作为示踪剂对研究对象进行 标记的微量分析方法。
示 踪 实 验 的 创 建 者 是 Hevesy 。 Hevesy 于 1923年首先用天然放射性212Pb研究铅盐在豆科 植物内的分布和转移。继后Jolit和Curie于1934 年发现了人工放射性，以及其后生产方法的建 立（加速器、反应堆等），为放射性同位素示 踪法的更快的发展和广泛应用提供了基本的条 件和有力的保障。
二、核酸操作技术
1.核酸的提取和纯化 DNA的提取和纯化：质粒提取、植物DNA
提取、动物DNA提取； RNA的提取和纯化：mRNA的分离、细胞
总RNA的分离。
2.DNA合成技术
DNA合成已广泛采用DNA自动合成仪，仅有 少数特殊情况下采用人工合成。目前，主要有 ABI(Applied Biosystem Inc.) 。 Pharmacia 、 Backman等几家公司生产DNA/RNA合成仪，其中 以ABI公司的仪器占我国及世界市场的80～90%。 由于合成技术的现代化，人们已从繁重的劳动中 得到解脱。输入合成仪的DNA序列，可以在数小 时之内得到完成。我们所要做的工作只是从合成 柱取下，进行DNA切落和去保护基以及纯化，并 进行量鉴定和计算合成率。
b.气相色谱(gas chromatography):用气体作为流动相
气－固色谱(gas-solid chromatography)：以固体吸附剂作 为固定相；
气－液色பைடு நூலகம்(gas-liquid chromatography)：以附载在固体上 的液体作为固定相。
气相色谱法：是Martin和James于1952年首先描述 的，现已成为所有色谱法中最高级和最广泛使用的一种 方法，它特别适用于气体混合物或挥发性液体和固体， 即便对于很复杂的混合物，其分离时间也仅为几分钟左 右。高分辩率、分析迅速和检测灵敏等几种优点之综合 使气相色谱法成了几乎每个化学实验室要采用的一种常 规方法。近年来，因为新型液相色谱仪和新型柱填料的 发展以及对色谱理论的更深入了解，又重新引起对密闭 柱液相色谱法的兴趣。
5）最近邻序列分析法
放射性同位素示踪技术对蛋白质生物合成 的研究，从DNA复制、RNA转录到蛋白质翻译 均起了很大的作用。最近邻序列分析法应用同 位素示踪技术结合酶切理论和统计学理论，研 究证实了DNA分子中碱基排列规律，首次提出 了DNA复制与RNA转录的分子生物学基础，从 而建立了 分 子杂 交 技术 ， 从而 证明了 RNA与 DNA模板的碱基呈特殊配对的互补关系，用分 子杂交技术还证实了从RNA到DNA的逆转录现 象。
（3）按操作形式不同分类
柱层析（colum chromatography）将固定相装于柱 内，使样品沿一个方向移动而达到分离。
纸层析（paper chrmatography）用滤纸作液体的载体 （担体support），点样后，用流动相展开，以达到分 离鉴定的目的。
薄层层析（thin layper chromatography）将适当粒度 的吸附剂铺成薄层，以纸层析类似的方法进行物质的分 离和鉴定。
3）动态平衡的研究
阐明生物体内物质处于不断更新的动态平 衡之中，是放射性同位素示踪法对生命科学的 重大贡献之一，向体内引入适当的同位素标记 物，在不同时间测定物质中同位素含量的变化， 就能了解该物质在体内的变动情况，定量计算 出体内物质的代谢率，计算出物质的更新速度 和更新时间等等。
4）生物样品中微量物质的分析
3. 放射性同位素技术
放射性同位素的原子核很不稳定，会不间断地、自发 地放射出射线，直至变成另一种稳定同位素，这就是所 谓“核衰变”。放射性同位素在进行核衰变的时候，可 放射出α射线、 β射线、γ射线和电子俘获等。
放射性同位素放射出的射线碰到各种物质的时候，会 产生各种效应，它包括 射线对物质的作用和物质对射 线的作用两个相互联系的方面。例如，射线能够使照相 底片和核子乳胶感光；使一些物质产生荧光；可穿透一 定厚度的物质，在穿透物质的过程中，能被物质吸收一 部分，或者是散射一部分，还可能使一些物质的分子发 生电离；另外，当射线辐照到人、动物和植物体时，会 使生物体发生生理变化。
分配层析（partition chromatography）利用不同组分 在流动相和固定相之间的分配系数（或溶解度）不同， 而使之分离的方法。
离子交换层析（ion-exchange chromatography ）利 用不同组分对离子交换剂亲和力的不同，而进行分离的 方法。
凝胶层析（gelchromatography）利用某些凝胶对于不 同组分因分子大小不同而阻滞作用不同的差异，进行分 离的技术。
高 效 液 相 色 谱 法 （ High-Performance Liquid Chromatography，HPLC）迅速成为与气相色谱法一样广 泛使用的方法，对于迅速分离非挥发性的或热不稳定的 试样来说，高效液相色谱法常常是更可取的。
（2）按层析过程的机理分类
吸附层析（adsorption chromatography ）利用吸附 剂表面对不同组分吸附性能的差异，达到分离鉴定的目 的。
此外，放射性同位素示踪技术对分子生物学 的贡献还表现在：
⑴对蛋白质合成过程中三个连续阶段，即肽链 的起始、延伸和终止的研究；
⑵核酸的分离和纯化；
⑶核酸末端核苷酸分析，序列测定；
⑷核酸结构与功能的关系；
⑸RNA中的遗传信息如何通过核苷酸的排列顺 序向蛋质中氨基酸传递的研究等等。
4. 色谱技术
色谱法是1906年俄国植物学家Michael Tswett将含有植 物色素的溶液通过装填有白垩粒子吸附剂的柱子，企图 分离它们时而发现并命名的。各种色素以不同的速率通 过柱子，从而彼此分开。分离开的色素形成不同的色带 而易于区分，由此得名色谱法（Chromatography），又 称层析法。
同位素示踪法在分子生物学中的应用
放射性同位素示踪法在生物化学和分子生物 学领域应用极为广泛，它为揭示体内和细胞内理 化过程的秘密，阐明生命活动的物质基础起了极 其重要的作用。
近几年来，同位素示踪技术在原基础上又有许 多新发展，如双标记和多标记技术，稳定性同位 素示踪技术，活化分析，电子显微镜技术，同位 素技术与其它新技术相结合等。由于这些技术的 发展，使生物化学从静态进入动态，从细胞水平 进入分子水平，阐明了一系列重大问题，如遗传 密码、细胞膜受体、RNA-DNA逆转录等，使人类 对生命基本现象的认识开辟了一条新的途径。
同位素示踪技术在生物化学和分子生物学中应 用的几个主要方面：
1）物质代谢的研究
应用适当的同位素标记物作示踪剂分析物 质中同位素含量的变化，知道它们之间相互转 变的关系。
2）物质转化的研究
同位素示踪技术的应用，使有关物质转化 的实验的周期大大缩短，而且在离体、整体、 无细胞体系的情况下都可应用，操作简化，测 定灵敏度提高，不仅能定性，还可作定量分析。
3.DNA重组技术
4.核酸杂交技术 5.DNA序列测定技术
6.聚合酶链式反应（PCR）
色谱法分类：
（1）按两相所处的状态分类
a.液相色谱(liquid chromatography)：液体作为流动相
液－固色谱(liquid-solid chromatography):以固体吸附剂作 为固定相；
液－液色谱(liquid-liquid chromatography)：以附载在固体 上的液体作为固定相。
分光光度技术的基本应用： 1) 测定溶液中物质的含量 2) 用紫外光谱鉴定化合物
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2. 电泳技术
电泳是指带粒子在电场中向与自身带相反电 荷的电极移动的现象。例如蛋白质具有两性电 离性质。当蛋白质溶液的pH在蛋白质等电点的 碱侧时，该蛋白质带负电荷， 在电场中向正极 移动，相反则带正电荷，在电场中向负极移动， 只有蛋白质溶液pH在蛋白质的等电点时静电荷 是零，在电场中不向任何一极移动。
在放射性同位素示踪技术被应用之前，由 于制备样品时的丢失而造成回收率低以及测量 灵敏度不高等问题，使得对机体正常功能起很 重要作用的微量物质不易被测定。近年来迅速 发展、应用愈来愈广泛的放射免疫分析 （radioimmunoassay）技术是一种超微量的分 析方法，它可测定的物质300多种，其中激素 类居多，包括类固醇激素，多肽类激素，非肽 类激素，蛋白质物质，环核苷酸，酶，肿瘤相 关的抗原，抗体以及病原体，微量药物等其它 物质。
1941年Martin和Synge 发现了液－液（分配）色谱 法[Liquid-Lipuid（partition）Chromatography，简称LIC]。 他们用覆盖于吸附剂表面的并与流动相不混溶的固定液 来代替以前仅有的固体吸附剂。试样组分按照其溶解在 两 相 之 间 分 配 。 Martin 和 Synge 因 为 这 一 工 作 而 荣 获 1952 年诺贝尔化学奖。
第五篇 分子生物学技术
一、 基本技术
1. 分光光度技术
有色溶液对光线有选择性的吸收作用，不同物 质由于其分子结构不同，对不同波长线的吸收能 力也不同，因此，每种物质都具有其特异的吸收 光谱。
有些无色溶液，虽对可见光无吸收作用，但所 含物质可以吸收特定波长的紫外线或红外线。
分光谱来鉴定物质性质及含量的技术，其理论 依据是(分光光度法)主要是指利用物质特有的 Lambert和Beer定律。