POD活性测定

可见光的范围350-770，紫外A 400-315nm，B 315-280nm，C 280-190nm

酶活单位=△ODmg一1·FW·min一1

1. POD活性测定：称取组织1g放于研钵中，加5mL0.05mol/L的磷酸缓冲液（pH5.5）在冰浴中研磨成匀浆。将匀浆全部转入离心管中，在3000rpm，4℃条件下离心10min，上清液为酶粗提液，4℃保存备用。

取酶液100μL，加反应混合液

1. 2.9ml 0.05mol/L的磷酸缓冲液(pH5.5)

2. 1mL 0.05mol/L愈创木酚溶液，0.05mol/L愈创木酚溶液,0.06207g愈创木酚定容10ml

3. 1.0 ml 2%H2O2, 30% H2O2670μL，加水至10ml.

在37℃水浴中混合均匀，于470nm处测定其吸光度，连续记录3min。以不加酶的反应混合液作对照，每30秒钟读一次数，以每分钟吸光度值变化值0.01为一个酶活单位。

酶活计算: OD290。g- 1.FW.h- 1=OD变化值/材料鲜重/反应时间

POD的酶活性增加倍数与抗病性呈正相关

2. CAT活性测定：设置两个重复一个对照,测定体系包括

1. 0.2 ml酶液、

2. 1.5 ml磷酸缓冲液pH7.0、

3. 1 ml蒸馏水，

4. 25℃预热后逐管加入300μL 0.1 mol/L的H2O2 (30% H2O256.8μL加水至10ml.)

在240 nm下测定吸光度，每隔1 min读一次，共测3 min，以1 min内减少0.1的酶量为1个酶活单位。

3. SOD活性的测定：采用改进的高灵敏度的氯化硝基氮兰四唑（NBT）光还原法测定SOD活性。每处理取3个小烧杯，分别加入3mLSOD反应液（参照附录B），

A）0.lmol/L pH7.8磷酸缓冲液

准确称取0.72gNa2HPO4·12H2O溶于20ml水中取18.3mL；准确称取0.312gNaH2PO4·2H2O 溶于20mL水中取1.7mL，混合并定容至20mL。

（B）104mmol/L的甲硫氨酸称取0.39g甲硫氨酸溶解并定容至25mL。

（C）0.3mmol/L的NBT 称取0.0025g氯化硝基氮兰四唑（NBT），溶解后定容于10mL。（D）0.8mmol/L的乙二胺四乙酸（EDTA）准确称取0.01gEDTA，定容于25mL。

（E）50μmol/L的核黄素称取0.0012g核黄素，定容于10mL容量瓶中。

取A液8mL、B液2mL、C液4mL、D液2mL，共16mL混匀为SOD反应液。

再加入150μL的50μmol/L的核黄素和150μL粗酶液，在25℃，4000Lx光照20min后于黑暗中停止反应。另作一组不加酶液其它处理同前的作为空白对照，并以pH7.8磷酸缓冲液调零。在560nm下测定吸光度。

计算公式：SOD的OD560值/g鲜重=（对照OD560-样品OD560）/0.5×60

分别计算不同酶液量的各反应系统中抑制NBT光还原的相对百分比,作出二者相关曲线,找出抑制NBT 50%光化学还原的酶液量(μl),定为一个酶活单位U,计算总酶活单位和酶的比活性。

4. MDA含量测定：取④中粗酶液1.5mL，加入2.5mL0.5%的硫代巴比妥酸（TBA，取0.5gTBA溶解于100mL20%三氯乙酸），在沸水浴中保温30min后，立即冷却，10000rpm 离心20min，取上清液分别在450nm、532nm和600nm下测吸光度值（A），计算公式：MDA （μmol/L）=6.45（A532-A600）-0.56A450。

5. PPO活性的测定：植物组织1g，用预冷的PH7.8(0.05M)磷酸缓冲液1ml，研磨，再加1ml缓冲液，倾入5ml离心管，于4度，10000rpm下离心20min，收集上清。反应体系为3ml0.2M邻苯二酚（用pH7.8磷酸缓冲液配制），1ml酶液，以灭活的酶液为空白对照，

30度下水浴10min，立即用20%三氯乙酸中止反应。离心5000rpm10min，于495nm处测定其

吸光值。

6 . PAL活性的测定：pH 8.8硼酸缓冲液(含15 mmol/L巯基乙醇)和50 mg PVP，

1. 1.6 mL 0.1 mol/L-1硼酸缓冲液(pH8.8，内含10 mmol•L-1苯丙氨酸)

2. 0.2 mL酶液,

37℃反应1 h后,加入0.2 mL 6 mol•L-1 HCl终止反应,测290nm处的吸光值,以反应时间零作参比。A290变化0.01为一个酶活单位(U•h-1•g-1•m-1)。活性=（OD值/0.01t）乘稀释倍数. 附录B—超氧化物歧化酶（SOD）反应液

（A）0.lmol/L pH7.8磷酸缓冲液

准确称取7.2gNa2HPO4·12H2O溶于200mL水中取183mL；准确称取3.12gNaH2PO4·2H2O 溶于200mL水中取17mL，混合并定容至200mL。

（B）104mmol/L的甲硫氨酸

准确称取0.78g甲硫氨酸溶解并定容至50mL。

（C）0.3mmol/L的NBT

准确称取0.025g氯化硝基氮兰四唑（NBT），溶解后定容于100mL容量瓶中。

（D）0.8mmol/L的乙二胺四乙酸（EDTA）

准确称取0.02gEDTA，定容于50mL容量瓶中。

（E）0.32mmol/L的核黄素

准确称取0.012g核黄素，定容于100mL容量瓶中。

取A液40mL、B液10mL、C液20mL、D液10mL，共80mL混匀为SOD反应液。

过氧化物酶、多酚氧化酶、过氧化氢酶、苯丙氨酸解氨酶在五分钟内，所读取的5个数值，以每分钟数值最大的为所测得的酶活性，之所以测量5次，就是为了找出吸光值变化最大的，也就是酶活性最大的区间值

PAL POD 酶活结果都跟书上的不同，吸光值该增大的，没有增大，反而降低。

伤口接种：用灭过菌的接种刀在叶中部垂直于叶脉处割一个约6 mm的伤口，于伤口处贴菌丝处理5株，重复3次，对照在伤口处贴无菌的培养块。参照Viaud等[1]的离体叶片接种法:在培养皿内铺双层滤纸,加少量水,进行灭菌。剪取生长整齐一致的各供试寄主幼苗的第1片平展真叶,冲洗后用75%的酒精表面消毒30 s,用灭菌水冲洗3遍,待吸干叶表水后,展平铺到灭菌培养皿上。用直径为3mm的打孔器在培养好的各地灰霉菌菌落边缘打取菌饼,反接于叶片的不同部位。每片叶接4块菌饼,每个菌株在每个寄主上接5片叶,对照接相同大小的PDA培养基块。接种后置于25℃恒温光照培养箱内,3 d后调查发病情况。按照十字交叉法测量病斑大小,并根据各处理的病斑大小评价各菌株致病力的差异。参照朱建兰等[9]的灰霉病斑调查方法,其分级标准为:0级,无症状或症状不明显;1级,形成直径2~5 mm(包含2 mm)水渍状黄褐色病斑;2级,形成直径5~10 mm(包含5 mm)水渍状黄褐色病斑;3级,形成直径10~15 mm(包含10 mm)水渍状黄褐色病斑;4级,形成直径15~20 mm(包含15 mm)水渍状黄褐色病斑;5级,形成

直径≥20 mm水渍状黄褐色病斑。

用DPS统计软件对供试灰霉菌株引起的病斑直径数据进行方差分析,采用Duncan’s新复极差检验(LSR test)进行多重比较。

根据灰霉菌株在不同寄主叶片上形成病斑的大小,将供试12个菌株的致病力类型分为强、中、弱3种,平均病斑大小在3级以上的菌株为强致病力,平均病斑在1级以下的菌株为弱致病力,平均病斑在2级的菌株为中等致病力。