第八章mRNA剪接编辑
mRNA剪切机制简介mRNA专题
mRNA剪切机制简介mRNA专题细胞核内前体mRNA的剪接的执行者是剪接小体，它能够在成熟mRNA出核和翻译之前识别剪接信号，移除不编码内含子，并将能够编码蛋白的外显子拼接在一起。
细胞核内前体mRNA的剪接需要经历2次转酯化反应化步骤去掉内含子才能将相邻的外显子拼接成成熟的mRNA。
在前体mRNA上有三个反应区域分别在5'剪接位点(5'SS)，3'剪接位点(3'SS)以及分枝位点（图1）。
除了这三个反应区域外，在多细胞生物体的内含子上还拥有保守性的多聚嘧啶束，它位于3'剪接位点以及分枝位点之间。
图1选择性剪接发生过程示意图选择性剪接由内含子5'剪接位G和U2个核苷酸点以及3'剪接位点A和G 2个核苷酸介导。
分支点A核苷酸非常保守的，一般位于3'剪接位点上游20-50个核苷酸。
剪接反应的过程发生2次转酶化反应，这个过程中需要5个snRNPs复合物(Ul，U2,U4,U5,andU6)。
这些复合物能够聚集在前体mRNA上形成大分子的聚合物。
剪接小体，核内最大的RNP复合物，能够识别这些反应位点并催化前体mRNA发生剪接。
剪接小体中主要的模块是snRNPs复合物。
剪接小体一般包含5种snRNPs：U1、U2、U4，U5和U6 snRNP。
每一个snRNP包含了单个snRNA和至少7种蛋白亚基。
这些snRNP和另外的非snRNP相关蛋白（例如SF1、U2AF和Prp19复合物）一步步有序的聚集在前体mRNA上依次形成前剪接小体E，A，B以及C复合物（图1）。
在这有序的过程中，这些snRNP以及非snRNP相关蛋白和反应位点之间发生复杂的结合与去结合过程，这些复杂的过程为核小体提供了多次检查的机会以保证它们结合的准确性从而提高位点选择的精确性。
在核小体组装之前，U1 snRNP占据5'剪接位点，而SF1结合在分枝位点，这2个过程是ATP依赖的并最终形成前剪接小体E复合物（图1）。
现代分子生物学第八章
以后，照样可以产生有活性的mRN A; 另一些基因， 如SV40 T抗原基因，一旦除去内含子，成熟mRNA运 人细胞质基质的过程就完全被阻断。
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8.1.3基因家族 • 真核细胞的DNA是单顺反子结构，很 • 少出现置于一个启动子控制之下的操纵子。 真核细胞中许多相关的基因常按功能成套 组合，被称为基因家族。 • 同一家族的成员有时紧密地排列在一起， 成为一个基因簇;但更多的时候，它们分散 在同一染色体的不同部位.甚至位于不同的 染色体上。具有各自不同的表达调控模式。
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• 选择性剪接：同一基因的转录产物由于不同的剪接方式形成不同 mRNA的过程。 • 选择性剪接的典刑例子：小鼠淀粉酶基因表达的组织特异性变化
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• 在小鼠肝和唾液腺这两种组织中，淀粉酶mRNA的编码 序列完全相同，但5‘端起始部分长度不同。 • 事实上,L外显子只是唾液腺淀粉酶基因中内含子序列的 一部分，将在mRNA成熟过程中被切除。 • 有实验证明，由S外显子起始的转录产物是由L外显子起 始转录产物的100倍以上。 • 由于一个基因的内含子成为另一个基因的外显子，形成 基因的差异表达，这是真核基因断裂结构的一个重要特 点。
现代分子生物学
指导老师：杨林松 演绎人：徐楸能
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8.1真核基因表达调控相关概念和一 般规律
•
• 8.1.1基因表达的基本概念 基因组： 一个细胞或病毒所携带的全部遗传 信息或整套基因。 基因：指能产生一条肽链或功能RNA所必需的 DNA片段。它包括编码区和其上下游区域。以 及在编码片段间(外显子)的间断切割序列（内 含子) 基因表达：基因经过转录、翻译，产生具有特 异生物学功能的蛋自质分子或RNA分子的过程。 基因表达调控：受内源及外源信号调控的这个 调控的过程。
第8章 RNA转录后的加工
4-硫尿苷
次黄嘌呤核苷（肌苷）
1-甲基鸟苷
N6 -异戊烯基腺苷
假尿嘧啶核苷
二氢尿苷
真核tRNA内含子的特点：
• 位置相同，都在反密码 子环的下游，内含子和 反密码子配对形成茎环 • 外显子和内含子交界处 无保守序列 • 不同tRNA的内含子长度 和序列各异 • 内含子的剪切是依靠 RNA酶异体催化（自身 不是核酶）
mRNA
蛋白质合成模板
RNA的加工 rRNA和tRNA：不论原核或真核生物的rRNA和tRNA都是以初级 转录本形式被合成的，然后再加工成为成熟的RNA分子。
mRNA： 原核生物的mRNA却不需加工，仍为初级转录本的形式。
真核生物pre-mRNA要经过复杂的加工历程，包括加帽、 加尾和内含子的剪接等。
1、在5’端加帽（cap）） 场所是核内
帽子0：m7 G ppp X 单细胞生物（如酵母） 帽子1：m7 G ppp Xm 多细胞生物，主要形式 帽子2：m7 G ppp XmpYm 占10-15%
三种帽子的 共同位置 在帽子1中 可被甲基化
帽子1
m7Gppp
鸟甘酸转移酶
帽子2
剪接前加帽，剪接后加帽 剪接前加帽
类似的加工过程也可以在某些噬菌体的多顺反子mRNA中见到。例 如，大肠杆菌噬菌体T7的早期基因转录出一条长的多顺反子mRNA， 经RNaseIII切割成5个单独的mRNA和一段5′端前导序列。mRNA的 切割对其中某些早期蛋白质的合成是必要的。推测可能是由于较 长的 mRNA产生二级结构，会阻止有关编码序列的翻译。这种RNA 二级结构（可能还有三级结构）与其功能的调控关系在多种情况 下均可看到，并不仅限于翻译起始的调控。通过 RNA 链的裂解， 改变了RNA的二级结构，从而影响它的功能。
mRNA的加工名词解释
mRNA的加工名词解释在细胞中，mRNA（messenger RNA）起着将DNA编码信息传递给蛋白质合成机器的重要角色。
然而，在DNA转录成mRNA的过程中，还需要经历多道加工步骤，以确保mRNA能够正确地在细胞内被翻译为蛋白质。
本文将解释mRNA加工过程中涉及到的一些关键名词。
1. 转录（Transcription）转录是指在细胞核内，DNA的一条链通过RNA聚合酶酶的作用，合成成对应的mRNA分子的过程。
转录是基因表达的第一步，它将DNA中的编码信息转录成mRNA的核酸序列。
2. 调控元件（Regulatory Elements）在转录的过程中，调控元件是指位于DNA序列上的特殊区域，它们可以增强或抑制一个基因的表达。
调控元件包括启动子（promoter）、增强子（enhancer）和抑制子（repressor）等。
3. 剪接（Splicing）剪接是指在mRNA的成熟过程中，对其原始转录产物的一部分内含子（intron）和外显子（exon）进行选择性切割和连接的过程。
这样的剪接过程可以将多个外显子连接在一起，形成成熟的mRNA分子。
4. 内含子（Intron）内含子是指转录过程中在DNA片段中编码区域以外的不含编码信息的区域。
剪接作用将这些内含子从mRNA序列中移除，只保留外显子编码信息。
5. 外显子（Exon）外显子是指在基因转录的过程中，DNA编码区域的片段，它们包含了将被翻译成蛋白质的编码信息。
外显子以剪接的方式连接在一起形成成熟的mRNA分子。
6. 5'帽（5' Cap）5'帽是指mRNA分子的5'端加上的一种独特化学修饰结构，它由一种三磷酸链和7-甲基鸟苷（m7G）残基组成。
5'帽的存在有助于稳定mRNA分子，并且在转录后的翻译过程中起到重要的识别作用。
7. 多聚腺苷酸尾（Polyadenylation Tail）多聚腺苷酸尾是指在mRNA分子的3'端加上的一串腺苷酸残基。
分子生物学试题及答案
分子生物学试题及答案一、单项选择题（每题2分，共20分）1. DNA分子的双螺旋结构是由谁提出的？A. 沃森和克里克B. 达尔文C. 孟德尔D. 摩尔根答案：A2. 以下哪个不是DNA聚合酶的功能？A. 合成DNA链B. 修复DNA损伤C. 催化RNA转录D. 校对新合成的DNA链答案：C3. 真核生物的mRNA帽子结构位于其5'端，其主要功能是什么？A. 促进翻译B. 保护mRNA不被降解C. 促进mRNA的剪接D. 促进mRNA的运输答案：B4. 以下哪种RNA分子在蛋白质合成中不直接参与？A. mRNAB. tRNAC. rRNAD. snRNA5. 基因表达调控中，转录因子的作用是什么？A. 提供转录所需的能量B. 识别并结合到特定的DNA序列上C. 催化DNA复制D. 促进DNA修复答案：B6. 以下哪种技术用于研究基因功能？A. PCRB. DNA测序C. 基因敲除D. DNA指纹分析答案：C7. 以下哪个不是DNA复制的特点？A. 半保留复制B. 需要引物C. 双向复制D. 需要逆转录酶答案：D8. 以下哪个不是RNA干扰（RNAi）的作用机制？A. 降解特定的mRNAB. 抑制基因表达C. 促进基因突变D. 沉默特定基因答案：C9. 以下哪个是真核生物中常见的非编码RNA？B. siRNAC. tRNAD. rRNA答案：A10. 以下哪个是原核生物和真核生物共有的基因表达调控机制？A. 转录后修饰B. 转录因子调控C. mRNA剪接D. 核糖体结合位点调控答案：B二、填空题（每空1分，共20分）1. DNA分子的基本组成单位是_______，而RNA分子的基本组成单位是_______。
答案：脱氧核苷酸；核糖核苷酸2. 在DNA复制过程中，_______酶负责解开双链DNA，而_______酶负责合成新的DNA链。
答案：解旋酶；DNA聚合酶3. 真核生物的基因表达调控主要发生在_______水平，而原核生物的基因表达调控主要发生在_______水平。
RNA的生物合成.pptx
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转录起始过程
1. RNA聚合酶全酶(2)与模板结合
2. DNA双链解开3. 在NA聚合酶作用下发生第一次聚合反应， 形成转录起始复合物
5-pppG -OH + NTP 5-pppGpN - OH 3 + ppi
转录起始复合物:
RNApol (2) - DNA - pppGpN- OH 3
RNA
UUUU...…
UUUU...…
茎环(stem-loop)/发夹(hairpin)结构
2019-11-11
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RNA-pol
5
3
3
5
5´pppG
茎环结构使转录终止的机理
• 使RNA聚合酶变构，转录停顿；
• 使转录复合物趋于解离，RNA产物释放。
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（二）转录延长
真核生物转录延长过程与原核生物大致相 似，但因有核膜相隔，没有转录与翻译同步的 现象。
RNA-pol前移处处都遇上核小体。 转录延长过程中可以观察到核小体移位和 解聚现象。
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转
核小体
录
延
RNA-Pol
长 转录方向
中
的
核
小
RNA-Pol
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结构基因
5
编码链
3
模板链
转录方向
转录方向
模板链
3
编码链
5
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不对称转录(asymmetric transcription)
前体mRNA的剪接过程
mRNA前体的加工过程有哪些步骤•浏览：1881•|•更新：2012-11-20 12:43原核生物转录作用生成的mRNA属于多顺反子mRNA，即由操纵子机制控制生成的一条mRNA可编码几种不同的蛋白质。
原核生物转录生成的初级转录本mRNA不需经过复杂的加工过程即可表现功能，惟一的加工过程是多顺反子mRNA在RnaseⅢ的催化下裂解为单个的顺反子。
真核生物转录生成的是单顺反子mRNA，其前体是非均一RNA(hnRNA)。
hnRNA加工过程包括方法/步骤1.剪接真核生物的基因是一种断裂基因，即其结构基因由若干编码序列和非编码序相间排列而成，其中为蛋白质编码的可转录序列称为外显子，不为蛋白质编码的可转录序列为内含子。
转录合成的hnRNA需经过剪接、切掉内含子部分，然后再将外显子部分拼接起来。
该过程有多种酶活性物质(包括snRNA)参与。
2.5′末端加“帽”真核细胞成熟mRNA的5′末端均有一个特殊的结构，即m7Gpp-pmnNp，称为“帽”。
帽的生成是在细胞核内进行的，但胞浆中也有酶体系，动物病毒mRNA 加帽过程就是在宿主细胞的胞浆内进行的。
3.3′末端加“尾”mRNA前体分子的3′末端有一段保守序列，由特异的核酸内切酶切去多余的核苷酸，然后在多聚A聚合酶的催化下，由ATP聚合生成多聚A尾。
该反应在核内发生，在胞浆中也可继续进行。
4.碱基修饰mRNA分子中有少量稀有碱基(如甲基化碱基)是在转录后经化学修饰(如甲基化)而形成的。
5.选择性加工某些MRNA前体含有多个3‘剪切位点和多聚腺苷酸化位点，因此利用这些选择性位点可产生具有不同3'端非编码区或者具有不同编码能力的RNA产物。
通过可变剪接途径可以挑先最保留在MRNA中的外显子，结果单个基因可以合成多种不同的蛋白质。
6.RNA编辑在合成并经RNA编辑加工之后，MRNA分子的序列可以发生改变。
个别核苷酸可以被置换，添加或者删除。
编辑过的MRNA翻译产生了较短脱脂基蛋白B48，由于基缺少一个结合受体的蛋白结构域，因此功能受限。
真核生物mRNA选择性剪接发生的相关因素
真核生物mRNA选择性剪接发生的相关因素摘要：在真核生物细胞中，选择性剪接扮演着非常重要的角色，如蛋白质多样性、细胞代谢、疾病的发生等。
据报道可知，选择性剪接的发生与很多因素相关如剪接因子、剪接相关的保守序列、染色质结构等，其具体机制一直随着科学工作者的不断努力而完善。
由于pre-mRNA选择性剪接在真核生物中具有的独特作用，使得选择性剪接发生的相关因素也成为人们研究的热点课题。
本文就真核生物mRNA选择性剪接发生的相关因素做简要介绍。
关键词：选择性剪接；mRNA；真核生物；剪接相关Motif；染色质结构0前言1978年Gilbert[1]首次提出选择性剪接这一概念后，选择性剪接开始广泛成为人们研究的目标。
人类基因组计划公布的初步研究结果中人类基因数是3.5万个左右，而不是原先预计的8万至10万个。
由此可知一个基因不是只编码一个蛋白质，而是可能编码一个或多个蛋白质。
近期报道显示，在人类含多个外显子的pre-mRNA中，能发生选择性剪接的约占92-94%[2]。
同时选择性剪接与疾病的发生之间有着密切联系，如炎症路径和癌症发生等[25][26]。
这使得选择性剪接成为近年来研究的热点课题。
1选择性剪接的概念与模式pre-mRNA的选择性剪接（Alternative splicing，AS）,即一个基因能产生多种mRNA，这极大地丰富了蛋白质组的多样性和基因表达调控的灵活性[7]。
近年来，在不同的真核生物物种中都有选择性剪接事件被报道，如酵母和人类等[3][4]。
选择性剪接发生模式主要包括以下5种[5]：可变的5’剪接位点（alternative 5’splice site）:与内含子保守5’剪接位点相竞争，且能与该内含子的3’剪接位点相互作用发生选择性剪接的5’剪接位点；可变的3’剪接位点（alternative 3’splice site）：与内含子保守3’剪接位点相竞争，且能与该内含子的5’剪接位点相互作用发生选择性剪接的3’剪接位点；选择性保留某些内含子（intron retention）:在剪接过程中选择性保留整个内含子或部分内含子序列，使其成为成熟mRNA的一部分；外显子跳跃（exon skipping）和互斥外显子（mutually exclusive exons）:都是表现在剪接过程中外显子被选择性拼接。
第八章 RNA加工(RNA processing)
A snoRNA (小核 仁RNA) base pairs with a region of rRNA that is to be methylated — define methylation sites
Pseudouridine (假尿嘧啶) modification
5
OH
五、RNA的自剪接
Each operon contains one copy of each of the 16S, the 5S and the 23S rRNA sequences. About 1~4 coding sequences for tRNA molecules are also present.
（二）断裂基因的证据
R-looping
The intron regions of the DNA will not find counterparts in the mRNA and so will form unhybridized loops. We call them R loops because hybridization with RNA caused them to form.
3. RNA cleavage
RNase III
Other types of RNase
M5, M16, M23
四、真核生物rRNA的加工
（一）真核生物rRNA基因
The rRNA genes are present in a tandemly repeated cluster (串联重复) containing 100 or more copies of the transcription unit, and are transcribed in nucleolus by RNA Pol I.
剪接名词解释
剪接名词解释
在基因组学和RNA生物学领域，剪接指的是把基因转录为成熟mRNA时的一种调节和修饰过程。
在此过程中，转录的前体mRNA（pre-mRNA）分别切割和连接成为一个或多个成熟的mRNA分子，以便于进行翻译产生蛋白质。
在剪接过程中，含有内含子（intron）的前体mRNA被剪断，然后两个相邻的外显子（exon）被连接在一起形成一个连续的mRNA链。
这些外显子可以按照不同的方式进行组合，因此，在同一份基因中，可以通过剪接产生不同的mRNA 分子，这些分子往往编码不同的蛋白质，或者具有不同的功能。
剪接过程主要是由剪接酶（splicing enzymes）和其他调控因子共同完成的。
剪接酶能够识别内含子的边界并将其剪除，然后将外显子连接起来。
调控因子则可以影响剪接的进程，以便产生不同的mRNA分子。
剪接是一个复杂的过程，它受到许多因素的影响，包括序列特征、剪接酶的特异性和调控因子的调控。
在剪接过程中的错误可以导致基因表达异常，进而导致人类疾病的发生。
因此，剪接研究也成为了医学和生物学领域的一个热点研究方向。
11 生物化学习题与解析--RNA的生物合成过程
R N A的生物合成过程一、选择题（一）A型题1．下列关于转录的叙述正确的是A．转录过程需RNA引物B．转录生成的RNA都是翻译模板C．真核生物转录是在胞浆中进行的D．DNA双链一股单链是转录模板E．DNA双链同时作为转录模板2．DNA上某段编码链碱基顺序为5'-ACTAGTCAG-3'，转录后mRNA上相应的碱基顺序为A．5'-TGATCAGTC-3'B．5'-UGAUCAGUC-3'C．5'-CUGACUAGU-3'D．5'-CTGACTAGT-3'E．5'-CAGCUGACU-3'3．不对称转录是A．双向复制后的转录B．以DNA为模板双向进行转录C．同一单链DNA，转录时可以交替作为编码链和模板链D．同一单链DNA，转录时只转录外显子部分E．没有规律的转录4．真核生物的转录特点是A．发生在细胞质内，因为转录产物主要供蛋白质合成用B．转录产物有poly（A）尾，DNA模板上有相应的poly（dT）序列C．转录的终止过程需ρ（Rho）因子参与D．转录起始需要形成PIC（转录起始前复合物）E．需要α因子辨认起点5．下列关于转录编码链的叙述正确的是A．能转录生成mRNA的DNA单链B．能转录生成tRNA的DNA单链C．同一DNA单链不同片段可作模板链或编码链D．是基因调节的成份E．是RNA链6．Pribnowbox序列是A．AAUAAAB．TAAGGCC．TTGACAD．TATAATE．AATAAA7．真核生物的TATA盒是A．参与转录起始B．翻译的起始点C．RNA聚合酶核心酶结合位点D．σ因子结合位点E．复制的起始点8．原核生物DNA指导的RNA聚合酶由数个亚基组成，其核心酶的组成是A．α2ββ'(ω)B．α2β(σ)C．α2ββ'σ(ω)D．α2β'(ω)E．αββ' 9．原核生物识别转录起始点的是A．ρ因子B．核心酶C．RNA聚合酶的α亚基D．σ亚基E．RNA聚合酶的β亚基10．ρ因子的功能是A．参与转录的启动过程B．参与转录的全过程C．加速RNA的合成D．参与转录的终止过程E．可改变RNA聚合酶的活性11．在转录延长阶段，RNA聚合酶与DNA模板的结合是A．全酶与模板结合B．核心酶与模板特定位点结合C．结合松弛而有利于RNA聚合酶向前移动D．和转录起始时的结合状态没有区别E．结合状态相对牢固稳定12．下列关于转录因子（TF）的叙述正确的是A．是真核生物RNA聚合酶的组分B．参与真核生物转录的起始、延长和终止阶段C．是转录调控中的反式作用因子D．是真核生物的启动子E．是原核生物RNA聚合酶的组分13．真核生物转录终止A．需要ρ（Rho）因子B．需要释放因子（RF）C．与加尾修饰同步进行D．需要信号肽E．形成茎环形式的二级结构14．外显子是A．DNA的调节序列B．转录模板链C．真核生物的编码序列D．真核生物的非编码序列E．原核生物的编码序列15．DNA复制和转录过程具有许多异同点，下列关于DNA复制和转录的描述中错误的是A．在体内只有一条DNA链转录，而两条DNA链都复制B．在这两个过程中合成方向都为5'→3'C．两个过程均需RNA引物D．两个过程均需聚合酶参与E．通常情况下复制的产物其分子量大于转录的产物16．以下哪些代谢过程需要以RNA为引物A．DNA复制B．转录C．RNA复制D．翻译E．逆转录17．下列有关真核细胞mRNA的叙述，错误的是A．是由hnRNA经加工后生成的B．5'末端有m7GpppN帽子C．3'末端有poly（A）尾D．为多顺反子E．成熟过程中需进行甲基化修饰（二）B型题A．pppGB．PICC．TFD．TATAATE．AATAAA1．顺式作用元件2．反式作用因子3．真核生物的转录起始前复合物A．5'→3'B．3'→5'C．C端→N端D．N端→C端E．一个点向两个方向同时进行4．双向复制5．肽链的生物合成方向6．转录的方向A．DNA指导的RNA聚合酶B．RNA指导的DNA聚合酶C．DNA连接酶D．引物酶E．拓扑酶7．在复制中催化小片段RNA合成的酶8．RNA合成时所需的酶9．DNA合成时所需的酶A．DNA聚合酶B．RNA聚合酶C．逆转录酶D．核酶E．Taq酶10．化学本质为核酸的酶11．遗传信息由RNA→DNA传递的酶12．耐热的DNA聚合酶（三）X型题1．下列关于RNA生物合成的叙述，正确的是A．RNA聚合酶的核心酶能识别转录起始点B．转录复合物是由RNA聚合酶和DNA组成的复合物C．转录在胞质进行从而保证了翻译的进行D．DNA双链中仅一股单链是转录模板E．合成RNA引物2．真核生物mRNA转录后加工方式有A．在3'端加poly（A）尾B．切除内含子，拼接外显子C．合成5'端的帽子结构D．加接CCA的3'末端E．去掉启动子3．下列哪项因素可造成转录终止A．ρ因子参与B．δ因子参与C．在DNA模板终止部位有特殊的碱基序列D．RNA链3'端出现茎环结构E．RNA链3'端出现寡聚U与模板结合能力小4．真核生物的tRNAA．在RNA-polⅢ催化下生成B．转录后5'端加CCA尾C．转录后修饰形成多个稀有碱基（I、DHU、ψ）D．5'端加m7GpppN帽子E．二级结构呈三叶草型5．真核生物rRNAA．单独存在无生理功能，需与蛋白质结合为核蛋白体发挥作用B．在RNA-polⅠ作用下合成rRNA前体C．45S-rRNA剪切为5.8S、18S、28S三种rRNAD．45S-rRNA与蛋白质结合为核蛋白体E．转录后加工在细胞核内进行二、是非题1．复制和转录起始均需RNA引物。
mrna异常剪接体外验证实验技术的流程
在讨论 mRNA 异常剪接的外部验证实验技术的流程之前，我们首先需要了解 mRNA 异常剪接的含义和意义。
在此之后，我们将介绍这一验证实验技术的流程，以及其在研究中的重要性和应用价值。
我们会共享一些个人观点和理解。
让我们深入探讨。
1. mRNA 异常剪接的含义和意义mRNA 异常剪接指的是在转录后的 mRNA 水平上发生的剪接异常，而不是在 DNA 水平上。
这种异常剪接可能导致编码蛋白质的错误，进而影响基因的功能。
这种异常在许多疾病中都起着关键作用，包括癌症、遗传性疾病和自身免疫性疾病。
研究 mRNA 异常剪接及其验证实验技术对于理解疾病的发生和发展至关重要。
2. mRNA 异常剪接的外部验证实验技术流程外部验证实验技术是通过实验手段对某一假设或猜想进行验证的过程。
在研究 mRNA 异常剪接的外部验证实验技术中，一般包括以下步骤：(1) 样本准备：选择合适的细胞系或组织样本，以及相应的对照样本，进行实验前的样本准备工作。
(2) RNA 提取：从样本中提取RNA，以获得研究所需的mRNA 样本。
(3) RT-PCR：利用逆转录-聚合酶链反应技术，将 mRNA 转录为cDNA，然后进行PCR 扩增，以检测mRNA 异常剪接的存在与比较。
(4) 凝胶电泳：将扩增后的产物进行凝胶电泳分析，以观察不同样本间mRNA 异常剪接产物的差异。
(5) Sanger 测序：对凝胶电泳检测到的异常剪接产物进行 Sanger 测序，以确定具体的剪接位点和剪接类型。
(6) 数据分析：对实验结果进行分析，判断是否存在mRNA 异常剪接，并对其进行定量和定性描述。
3. mRNA 异常剪接的外部验证实验技术在研究中的重要性和应用价值外部验证实验技术是验证和验证科研成果的关键手段之一。
在研究mRNA 异常剪接的外部验证实验技术中，其重要性和应用价值主要体现在以下几个方面：- 确认研究发现：通过外部验证实验技术，可以对初步研究结果进行验证，从而保证研究的可靠性和科学性。
mRNA选择性剪接的分子机制
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"#$% 剪接的基本模式
以外显子和内含子为单元的基因结构形式在真
可以被选择保留或切除 （图 !， ； 多个外显子可以 D） 进行不同组合的可变拼接 （图 !， ； 内含子可以被选 7） 择保留在 "#$% 中 （图 !， 等。这些不同的剪接形 6） 式形成了不同的剪接组合， 产生了不同的剪接产物。 有时候这种剪接组合产生的产物数目是极其惊人 的。如果蝇的 ?/58" 基因经选择性剪接产生的产物 达 <H +++ 余种， 超过果蝇整个基因组基因数目的两 倍。
-/01 选择性剪接的分子机制
章国卫，宋怀东，陈 竺
（上海市瑞金医院上海血液学研究所，上海 ’(((’K）
摘
要：真核细胞 5N0E 前体经过剪接成为成熟的 5N0E， 而 5N0E 前体的选择性剪接极大地增加了蛋白质的多
样性和基因表达的复杂程度， 剪接位点的识别可以以跨越内含子的机制 （内含子限定） 或跨越外显子的机制 （外显 子限定） 进行。选择性剪接有多种剪接形式： 选择不同的剪接位点， 选择不同的剪接末端， 外显子的不同组合及内 含子的剪接与否等。选择性剪接过程受到许多顺式元件和反式因子的调控， 并与基本剪接过程紧密联系， 剪接体 中的一些剪接因子也参与了对选择性剪接的调控。选择性剪接也是 + 个伴随转录发生的过程， 不同的启动子可调 控产生不同的剪接产物。5N0E 的选择性剪接机制多种多样， 已发现 N0E 编辑和反式剪接也可参与选择性剪接过 程。 关键词：5N0E；选择性剪接 中图分类号：WK’’ 文献标识码：E 文章编号：(*-14)+-’ （’(()） (+4(+(’4(X
第八章RNA的生物合成转录
• 如前所述，某些抗生素如利福霉素和利福平能抑 制细菌RNA聚合酶，因而能抑制细菌RNA的合成。
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第三节 转录后的加工和修饰
• 真核细胞中转录生成的RNA是初级转录产物，均需经过一定程度的加工才具有活性。原核细胞由于没有细 胞核，其结构基因是连续的核苷酸序列，转录后产生的RNA很少需要加工处理（tRNA例外）就转运到核蛋 白体上参与蛋白质的合成。新生的无活性的RNA转变为有活性的RNA的过程，称为RNA的成熟（转录后的 加工），包括链的断裂、拼接和化学修饰等。
tRNA
氨基酸臂
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反密码环
• （三）rRNA与蛋白质构成核蛋白体是蛋白质合成的场所 rRNA是一类分子量不等 的非均一性RNA，它们与多种蛋白质互相镶嵌，结合成为显微镜下可见的核蛋白体 颗粒，是氨基酸聚合成肽链的场所。核蛋白体由大、小亚基构成。大亚基有转肽酶 活性和两个tRNA结合部位，一个是结合肽酰-tRNA的部位（P位），另一个是结合 氨基酰-tRNA的部位（A位）。小亚基有结合模板mRNA的功能，在大小亚基之间 有容纳mRNA的部位，核蛋白体能沿着mRNA5′→3′方向阅读遗传密码。
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• （二）．mRNA的剪接 • 真核细胞的mRNA前体称核内不均一RNA(hnRNA)，它是由断裂基因转录的，包
含有内含子和外显子的区段，所以其分子量比成熟的mRNA大几倍，甚至数十倍。 剪接就是把hnRNA中的内含子除去，把外显子拚接起来，成为具有翻译功能的模 板—mRNA。
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基因编辑中的非编码RNA和剪接调控研究方法
基因编辑中的非编码RNA和剪接调控研究方法引言：随着科技的不断进步，基因编辑成为了生物学研究领域中的重要技术。
基因编辑的主要目的是改变生物体染色体上的基因序列，进而影响基因的表达和功能。
然而，除了编码蛋白质的基因之外，80%以上的基因组区域都是由非编码RNA组成的。
非编码RNA和剪接调控在基因编辑中起着重要的作用。
本文将介绍基因编辑中的非编码RNA和剪接调控的研究方法。
一、非编码RNA的研究方法非编码RNA是指不编码蛋白质的RNA分子，它们在细胞中扮演着各种重要的功能角色。
研究非编码RNA对于我们理解细胞的功能和疾病的发生机制至关重要。
以下是一些常用的非编码RNA研究方法：1.1 转录组测序（RNA-seq）：RNA-seq是一种通过高通量测序技术来检测和定量转录组中的RNA分子的方法。
通过RNA-seq，可以全面地检测非编码RNA的存在与表达水平，并进一步分析其在基因调控中的功能。
1.2 序列比对和注释：对于非编码RNA，通过将RNA测序数据与已知的参考基因组进行比对和注释，可以确定其在基因组中的位置和相应的基因组上游和下游区域。
1.3 RNA干扰（RNAi）：RNAi是一种通过引入外源RNA分子来抑制目标基因表达的技术。
在非编码RNA研究中，可以使用RNAi技术来研究特定非编码RNA的功能和作用机制。
1.4 CRISPR-Cas9技术：CRISPR-Cas9是一种基因编辑技术，可以通过靶向特定的DNA序列来切除或修改基因组中的目标区域。
在非编码RNA的研究中，可以使用CRISPR-Cas9技术来靶向性地剪接或编辑非编码RNA的序列。
二、剪接调控的研究方法剪接是指在基因表达过程中，将基因转录产生的初级转录本（pre-mRNA）中的内含子剪接出来，形成成熟的mRNA。
剪接调控是指通过剪接方式的调节，控制基因的表达和功能。
以下是一些常用的剪接调控研究方法：2.1 RT-PCR：RT-PCR是一种通过逆转录和聚合酶链反应（PCR）来检测和分析RNA的方法。
真核生物核基因mrna前体的剪接机制
真核生物核基因mrna前体的剪接机制下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。
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Step1
RNA三磷酸酶
鸟苷转移酶
GMP
Step2
SAM
Step3
CAP1:OCH3
CAP2:OCH3
CAP 0
帽子的类型
在末端鸟苷的第7位上存在单个甲基化位点的称O类帽子 （capO）； 在次末端核苷酸的核糖上的 2′-O 位点上还有一个甲基位
点的称1类帽子(cap 1)；
mRNA前体的加工内容： 3. 内含子的剪接
1. mRNA依赖snRNA的拼接
2.选择拼接
3.顺式和反式拼接 4. I型自我拼接 5. II型自我拼接
帽0
m7GpppXpYp------
普遍存在
帽1
m7GpppXmpYp-----
普遍存在
帽2
m7GpppXmpYmp-----
很少发生
帽子结构的功能
1.
2. 3. 4.
5.
有助于mRNA跨越核膜转运; 保护 mRNA 5′不被酶降解； 使mRNA能与核糖体小亚基结合； 被蛋白质合成的起始因子所识别，促进蛋白质 合成; 提高剪接效率
mRNA剪接编辑
真核生物基因组DNA的结构
真核基因大多是断裂的: 一个基因可由多个内含子和外显子间隔排 列而成。 内含子在真核基因中所占的比例很高，甚 至超过99%。
RNA
部分人类基因中内含子序列所占的比重分析
前体mRNA--hnRNA
5’-Cap
3‘-Poly(A)
mRNA 剪接
成熟mRNA的转运
hnRNP
hnRNP:核糖核蛋白颗粒
hnRNA的物理结构是核糖核蛋白颗粒 (hnRNP)，颗粒中蛋白质包围着hnRNA， 这种hnRNA和蛋白质组成的复合物称为 hnRNP。
1. mRNA 加帽
帽子结构 (m7GpppGp-) 7-甲基鸟核苷三磷酸:它由甲基化 鸟苷酸经焦磷酸化与mRNA的5‘末端核苷酸相连，形成 5’,5‘-三磷酸连接(5’,5‘-triphosphate linkage)， mRNA5’端 的这种结构称为帽子(cap)。 反应空间：在mRNA的5‘-端加上m7GTP的结构。此过程 发生在细胞核内，即hnRNA即可进行加帽。 加工过程:首先是在磷酸酶的作用下，将5'-端的磷酸基水 解，然后再加上鸟苷三磷酸，形成GpppN的结构，再对G 进行甲基化。
此外，在第三个核苷酸的核糖上（ 2′-O ）有甲基化位点 的称2类帽子（cap2）。
这 三 种 帽 子 都 有 特 殊 面 对 面 核 苷 酸 结 构 （ confronted nucleotide structure）。
HN—CH3
m7G
帽子0
mRNA 5端的帽子位置 和可被甲基化的位点
三种5’帽结构形式
CPSF
PAP
PAPB
Pol II的CTD促进切割
3 端多聚腺苷酸尾巴的功能
提高mRNA的稳定性 在核－质转运中起作用 提高mRNA的翻译效率 影响最后一个内含子的切除
创造终止密码子UGA
选择性加尾调节基因的表达
3. RNA剪接(Splicing)
真核生物mRNA前体的剪接
பைடு நூலகம்
加帽的顺序
当新生RNA链长度约为25nt 时，其5’端经修饰被加上 一个7-甲基G，以5’-5’三磷酸连接。 RNA三磷酸酶(Triphosphatase) 鸟苷酸转移酶（guanyltransferase） 鸟嘌呤-7-甲基转移酶（guanosine ethyltransferase） 反应步骤如下： 核苷酸水解酶从RNA的5‘-端切掉γ 基团； 鸟苷酸转移酶将来自GTP的GMP连接到RNA 5’-端的β 磷酸上，形成5-5三磷酸，释放出PPI 甲基转移酶催化SAM的甲基转移到Cap-0的N7位。
mRNA的多聚腺苷酸化过程
CPSF因子专一性与加尾信号AAUAAA结合 CstF因子与富GU区结合 CFI、CFII在加尾信号下游的15～25 nt处切割 poly(A)多聚酶催化多聚腺苷酸化，先添加约10 个腺苷酸，速度较慢 poly(A)结合蛋白的结合加快多聚酶延伸速度， 控制多聚腺嘌呤尾巴的长度
2. Poly A 尾巴
多聚腺苷化的信号及参与的蛋白因子
有效的信号是： AAUAAA及随后的 23-24nt的富GU区， 再后的富U区。 参与的蛋白因子： CPSF，CstF，CFI， CFII
加尾反应需要的顺式元件
3 端添加多聚腺苷酸
长度：20～200 nt 加尾信号： 切割与加尾： a. 剪切/多聚腺苷酸化特异性因子（cleavage and polyadenylation specificity factor, CPSF） b. 剪切刺激因子（cleavage stimulation factor, CstF） c. 剪切因子I，II（CFI， CFII） d. poly(A)多聚酶（polyadenylate polymerase, PAP） e. poly(A)结合蛋白（poly (A) binding protein, PBP）
RNA加工过程及其生理功能
断裂基因 hnRNA，hnRNP，sRNA Exons (外显子): the coding sequences Introns (内含子) : the intervening sequences RNA splicing: 去除pre-mRNA的内含子形成成熟 mRNA的过程.
Spliceosome 剪接体 Self-splicing introns and mechanisms
Alternative splicing (可变剪接): 有些pre-mRNAs 可以通过不同的剪接方式产生不同的成熟的 mRNA. 60% of the human genes are spliced in this manner.
hnRNA
hnRNA (heterogeneous nuclear RNA):核内不 均一RNA，是mRNA的原初转录产物在核 内形成的大小不等的中间物，相对分子质 量大，也不均一，成为hnRNA。 hnRNA与mRNA的关系：
两者具有部分相同的序列； 两者都可以做翻译的模板； 两者都有5-端帽子和3-端polyA尾巴； 两者都是由RNA聚合酶转录