酶的分离纯化 (2)优秀课件
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酶的分离纯化资料PPT课件
常用的缓冲液：20-50mmol/L的磷酸缓冲液； 0.1mol/L Tris-HCl，必要时可加入 EDTA、巯基乙醇或蛋白稳定剂等
胞外酶：过滤、离心等方法出去菌体
孙利20芹20年209月1238日制作
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◆细胞抽提液的制备
酶的提取是指在一定条件下，用适当的溶剂处理细胞 破碎后的含酶原料，使酶充分地溶解到提取液中的过 程。
通过降低溶液的介电常数，增强偶极离子间的静电吸引，从 而使分子聚集沉淀。此外，有机溶剂本身如酒精、甲醇、丙酮等， 对水的亲和力很大，能破坏蛋白质颗粒的水化膜，在等电点时使 蛋白质沉淀。在常温下，有机溶剂沉淀蛋白质往往引起变性
选择原则：
①必须与水混溶 ②不与pr反应 ③较好的沉淀效应 ④溶剂蒸汽无毒，
15
盐析法
向蛋白质水溶液中加入中性盐，可以产生两种影响:盐溶现 象和盐析现象
盐析方程:
lg0= β
Ks:盐析效率，是蛋 白质和盐种类的 特征常数。在一 定pH和温度条 件下，利用不同 蛋白质的Ks不同
β分段盐析：S0随pH和温度的变化而变化,在一定的I值下通过改变
§1.6酶的分离纯化
2013春
提纲
蛋白质纯化的一般考虑 蛋白质的粗分离 蛋白质的大规模分离纯化
孙利20芹20年209月1238日制作
2
一、蛋白质纯化的一般考虑
※从量上考虑
为测序或克隆的目的，只需几微克； 为工业或医药的用途，则可达几千克
※从纯化的标准
为临床治疗所需，纯度应达到98%或99%以上； 用于其它一般用途，要求低
高度纯化
孙利20芹20年209月1238日制作
成品加工
5
二、蛋白质的粗分离
材料的选择和细胞抽提液的制备 蛋白质的浓缩和脱盐 沉淀法分级蛋白
胞外酶：过滤、离心等方法出去菌体
孙利20芹20年209月1238日制作
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◆细胞抽提液的制备
酶的提取是指在一定条件下，用适当的溶剂处理细胞 破碎后的含酶原料，使酶充分地溶解到提取液中的过 程。
通过降低溶液的介电常数，增强偶极离子间的静电吸引，从 而使分子聚集沉淀。此外，有机溶剂本身如酒精、甲醇、丙酮等， 对水的亲和力很大，能破坏蛋白质颗粒的水化膜，在等电点时使 蛋白质沉淀。在常温下，有机溶剂沉淀蛋白质往往引起变性
选择原则：
①必须与水混溶 ②不与pr反应 ③较好的沉淀效应 ④溶剂蒸汽无毒，
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盐析法
向蛋白质水溶液中加入中性盐，可以产生两种影响:盐溶现 象和盐析现象
盐析方程:
lg0= β
Ks:盐析效率，是蛋 白质和盐种类的 特征常数。在一 定pH和温度条 件下，利用不同 蛋白质的Ks不同
β分段盐析：S0随pH和温度的变化而变化,在一定的I值下通过改变
§1.6酶的分离纯化
2013春
提纲
蛋白质纯化的一般考虑 蛋白质的粗分离 蛋白质的大规模分离纯化
孙利20芹20年209月1238日制作
2
一、蛋白质纯化的一般考虑
※从量上考虑
为测序或克隆的目的，只需几微克； 为工业或医药的用途，则可达几千克
※从纯化的标准
为临床治疗所需，纯度应达到98%或99%以上； 用于其它一般用途，要求低
高度纯化
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成品加工
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二、蛋白质的粗分离
材料的选择和细胞抽提液的制备 蛋白质的浓缩和脱盐 沉淀法分级蛋白
第四章酶工程酶的提取与分离纯化ppt课件
在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法： ⑴中性盐沉淀（盐析法） ⑵有机溶剂沉淀 ⑶选择性沉淀（热变性和酸碱变性） ⑷等电点沉淀 ⑸有机聚合物沉淀
从使用情况来看，闭胸式的使用比较 广泛。 敞开式 盾构之 中有挤 压式盾 构、全 部敞开 式盾构 ，但在 近些年 的城市 地下工 程施工 中已很 少使用 ，在此 不再说 明。
脂类
蛋白质(6% ~ 8%) 蛋白质
脂类(8.5% ~ 13.5%)
从使用情况来看，闭胸式的使用比较 广泛。 敞开式 盾构之 中有挤 压式盾 构、全 部敞开 式盾构 ，但在 近些年 的城市 地下工 程施工 中已很 少使用 ，在此 不再说 明。
细菌细胞壁的结构
从使用情况来看，闭胸式的使用比较 广泛。 敞开式 盾构之 中有挤 压式盾 构、全 部敞开 式盾构 ，但在 近些年 的城市 地下工 程施工 中已很 少使用 ，在此 不再说 明。
蛋白质溶解度与盐浓度之间的关系：
loSg loS0 g K sI
I：离子强度，I = 1/2∑MZ2；M：离子浓度（mol/L）； Z：离子价数
S：离子强度为I时的蛋白质的溶解度（g/L） S0：离子强度为0时蛋白质的溶解度（g/L） Ks：盐析常数，是与蛋白质和盐种类有关的特性常数。
b. 添加固体硫酸铵
适用于：蛋白质溶液原来体积已经很大，而要 达到的盐浓度又很高时。
实际使用时，可直接查表 （各种饱和度下 需加固体硫酸铵的量）。
从使用情况来看，闭胸式的使用比较 广泛。 敞开式 盾构之 中有挤 压式盾 构、全 部敞开 式盾构 ，但在 近些年 的城市 地下工 程施工 中已很 少使用 ，在此 不再说 明。
3. 化学法 应用各种化学试剂与细胞膜作用，
使细胞膜结构改变或破坏。
从使用情况来看，闭胸式的使用比较 广泛。 敞开式 盾构之 中有挤 压式盾 构、全 部敞开 式盾构 ，但在 近些年 的城市 地下工 程施工 中已很 少使用 ，在此 不再说 明。
脂类
蛋白质(6% ~ 8%) 蛋白质
脂类(8.5% ~ 13.5%)
从使用情况来看，闭胸式的使用比较 广泛。 敞开式 盾构之 中有挤 压式盾 构、全 部敞开 式盾构 ，但在 近些年 的城市 地下工 程施工 中已很 少使用 ，在此 不再说 明。
细菌细胞壁的结构
从使用情况来看，闭胸式的使用比较 广泛。 敞开式 盾构之 中有挤 压式盾 构、全 部敞开 式盾构 ，但在 近些年 的城市 地下工 程施工 中已很 少使用 ，在此 不再说 明。
蛋白质溶解度与盐浓度之间的关系：
loSg loS0 g K sI
I：离子强度，I = 1/2∑MZ2；M：离子浓度（mol/L）； Z：离子价数
S：离子强度为I时的蛋白质的溶解度（g/L） S0：离子强度为0时蛋白质的溶解度（g/L） Ks：盐析常数，是与蛋白质和盐种类有关的特性常数。
b. 添加固体硫酸铵
适用于：蛋白质溶液原来体积已经很大，而要 达到的盐浓度又很高时。
实际使用时，可直接查表 （各种饱和度下 需加固体硫酸铵的量）。
从使用情况来看，闭胸式的使用比较 广泛。 敞开式 盾构之 中有挤 压式盾 构、全 部敞开 式盾构 ，但在 近些年 的城市 地下工 程施工 中已很 少使用 ，在此 不再说 明。
3. 化学法 应用各种化学试剂与细胞膜作用，
使细胞膜结构改变或破坏。
3酶的分离纯化-2.ppt
颗粒状，装进凝胶层析柱使用。 设备简单，操作方便（不需经过再生处理可反复使用）。不 需要有机溶剂，以及对高分子物质有很高的分离效果，适于 不同分子量的各种物质。
１、凝胶层析的基本原理
凝胶颗粒装填到玻璃管中制成层析柱，加 入欲分离的混合物，大量蒸镏水或其它稀 溶液洗柱;
分子量最大的物质不能进入凝胶网孔而沿 凝胶颗 粒间的空隙最先流出柱外。分子量 最小的物质因能进入凝胶网孔而受阻滞， 流速缓慢，最后流出柱外。
第六节 层析分离
层析分离
是利用混合物中各组分的物理化学性质（分 子大小和形状、分子极性、吸附力、分子亲 和力和分配系数等）的不同，使各组分在两 相中的分布程度不同而达到分离。 层析分离中一个相是固定的,称为固定相; 另一个相是流动的,称为流动相; 各组分移动速度步同,使不同组分分纯化; 层析分离设备简单,操作容易;
胶膜放入底座
胶膜固定在底座上
加胶
安裝防护罩
整套安裝完毕准备电泳
放入电泳槽中
制胶完成取出
放电梳
Back
凝胶浓度和交联度与孔径大小的关系
凝胶的物理性质如机械强度、弹性、透明度和粘着度都取决 于凝胶总浓度（T）和Acr与Bis两者之比。凝胶总浓度（T）和交 联度（C）的计算公式分别为：
T= Acr（g）+Bis（g）XC1=00%
六 层析聚焦
将酶等两性物质的等电点特性与离子交换层析特 性结合在一起,实现组分分离。
柱内装上多缓冲离子交换剂，多缓冲液流经层析 柱时形成稳定pH梯度；酶液和组分移到与其等电 点相当的pH位置上。
１、交换剂和缓冲液体系 ２、pH梯度的形成 ３、层析聚集的操作过程
back
第七节 电泳分离
定义:electrophoresis带电粒子在电场中向着与其 本身所带电荷相反的电极移动的过程称为电泳。
１、凝胶层析的基本原理
凝胶颗粒装填到玻璃管中制成层析柱，加 入欲分离的混合物，大量蒸镏水或其它稀 溶液洗柱;
分子量最大的物质不能进入凝胶网孔而沿 凝胶颗 粒间的空隙最先流出柱外。分子量 最小的物质因能进入凝胶网孔而受阻滞， 流速缓慢，最后流出柱外。
第六节 层析分离
层析分离
是利用混合物中各组分的物理化学性质（分 子大小和形状、分子极性、吸附力、分子亲 和力和分配系数等）的不同，使各组分在两 相中的分布程度不同而达到分离。 层析分离中一个相是固定的,称为固定相; 另一个相是流动的,称为流动相; 各组分移动速度步同,使不同组分分纯化; 层析分离设备简单,操作容易;
胶膜放入底座
胶膜固定在底座上
加胶
安裝防护罩
整套安裝完毕准备电泳
放入电泳槽中
制胶完成取出
放电梳
Back
凝胶浓度和交联度与孔径大小的关系
凝胶的物理性质如机械强度、弹性、透明度和粘着度都取决 于凝胶总浓度（T）和Acr与Bis两者之比。凝胶总浓度（T）和交 联度（C）的计算公式分别为：
T= Acr（g）+Bis（g）XC1=00%
六 层析聚焦
将酶等两性物质的等电点特性与离子交换层析特 性结合在一起,实现组分分离。
柱内装上多缓冲离子交换剂，多缓冲液流经层析 柱时形成稳定pH梯度；酶液和组分移到与其等电 点相当的pH位置上。
１、交换剂和缓冲液体系 ２、pH梯度的形成 ３、层析聚集的操作过程
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第七节 电泳分离
定义:electrophoresis带电粒子在电场中向着与其 本身所带电荷相反的电极移动的过程称为电泳。
酶的提取与分离纯化ppt课件
整理版课件
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4.干燥法
气流干燥 真空干燥 喷雾干燥 冷冻干燥
使细胞结合水分丧失，从而改变细胞的渗透性。当采用丙酮、 丁醇或缓冲液等对干燥细胞进行处理时，胞内物质就容易被 抽提出来。
气流干燥主要适用于酵母菌，一般在25-30℃的气流中吹干； 真空干燥多用于细菌。
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三、破碎率的测定与破碎技术的研究方向
整理版课件
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5.其他方法
1. X-press法
将浓缩的菌体悬浮液冷却至-25℃形成冰晶体，利用500MPa 以上的高压冲击，使冷冻细胞从高压阀小孔中挤出。细胞破 碎是由于冰晶体的磨损，使包埋在冰中的微生物变形而引起 的。
此法主要用于实验室，适应范围广、破碎率高、细胞碎片粉碎程度低及 活性保留率高等优点，但不适应于对冷冻敏感的生化物质。
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21
3. 反复冻结-融化法
将细胞放在低温下突然冷冻而在室温下缓慢融化，反复多 次而达到破壁作用。由于冷冻，一方面使细胞膜的疏水键 结构破裂，另一方面胞内水结晶，使细胞内外溶液浓度变 化，引起细胞膨胀而破裂。
适用于细胞壁较脆弱的菌体，破碎率较低，需反复多次，此外，在冻融 过程中可能引起某些蛋白质变性。
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化学渗透法优点：
对产物释放有一定的选择性，可使一些较小分子量的溶质 如多肽和小分子的酶蛋白透过，而核酸等大分子量的物质仍 滞留在胞内； 细胞外形完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和进 一步提取。
缺点： 通用性差；
时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过50%； 有些化学试剂有毒 。
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（2）EDTA螯合剂
处理G-细菌，对细胞外层膜有破坏作用。G-细菌的外层膜结 构通常靠二价阳离子Ca2+或Mg2+结合脂多糖和蛋白质来维持， 一旦EDTA将Ca2+或Mg2+螯合，大量的脂多糖分子将脱落， 使细胞壁外层膜出现洞穴。这些区域由内层膜的磷脂来填补， 从而导致内层膜通透性的增强。
酶的分离与纯化PPT课件
2）非机械法：酶法、化学法、物理法 • 化学渗透法（chemical permeation）：改变细胞壁或细胞膜的通
透性；TritonX-100：结合、溶解磷脂，破坏膜脂双层；EDTA：对G-菌 外膜有破坏作用；有机溶剂：分解细胞壁中的脂类；变性剂：脲、盐 酸胍与水中氢键作用。优点：选择性，易于固液分离。缺点：通用性 差，效率低，毒性
(NH4)2SO4饱和度表
• 温度是影响蛋白质溶解度的重要因素。在无盐或稀盐溶液 中，温度低，蛋白质溶解度也低；在高盐溶液中，蛋白质 的溶解度随温度的升高反而减小。许多蛋白质在高离子强 度溶液中，25℃时的溶解度比0℃时明显减小。这主要是 因为蛋白质分子在水化时要吸热，失水时则放热，温度升 高有利于蛋白质失水沉淀。一般盐析时不要降低温度，除 非这种酶对温度比较敏感。
蛋白质的盐析
盐析应用最广泛的是硫酸铵
• 优点 1）溶解度大 25℃时硫酸铵的溶解度可达4.1mol/L(541g/L)以上。大 约每升水可溶解767g之多。在这一高溶解度范围内，许多蛋白质和酶 都可以被盐析沉淀出来。 2）温度系数小 硫酸铵的溶解度受温度影响不大。例如 0℃时，硫酸 铵的溶解度仍可达到3.9mol/L(515g/L)。大约每升水可溶解676g。对 于需要在低温条件下进行酶的纯化来说，应用硫酸铵是有利的。 3）硫酸铵不易引起蛋白质变性，对于很多种酶还有保护作用，且价格 低廉，容易获得。 • 缺点 铵离子干扰双缩脲反应，为蛋白质的定性分析造成一定困难。
（五）沉淀分离
1、盐析法 盐溶(salting in) 在低浓度盐溶液中，酶的溶解度增加。 盐析(salting out) 盐浓度升高到一定程度，蛋白质和酶浓 度随盐浓度的升高而不同程度下降并沉淀析出。 （1）盐析法的机制 （2）盐析用中性盐的选择 常用的中性盐：MgSO4、(NH4)2SO4、Na2SO4和NaH2PO4 （3）(NH4)2SO4饱和度表示法 （4）影响盐析的因素 1）蛋白质浓度 2）pH和温度的影响
酶的分离纯化 ppt课件
凝胶电泳
（88.9%）
共六步，总收率仅为16%
staehelin等人：
硫酸铵盐析
免疫亲和层析
阳离子交换层析 仅三步，总收率达81.0%
武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
在实践工作中选择方法时:
首先，应对被纯化的酶的理化性质有—个比较全面的了解;
其次，判断采用的方法和条件是否得当，始终以测定酶 活性为标准。
适用于耐热的酶，注意常要加适当的酶保护剂。 （2）加凝聚剂或絮凝剂
（3）调pH值 二、固液分离 方法：（1）离心分离；（2）过滤；（3）双水相萃取
武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
三、细胞破碎
捣碎法：捣碎机
机械破碎法
研磨法：研钵、细菌磨、石磨、球磨等 匀浆法：匀浆器
物理破碎法
温度差破碎法：冻融交替法 压力差破碎法：高压冲击法、突然降压法、渗透压变化
各国研究的热点。
广泛应用于生物工程、化学、制药、 饮料、电力、冶金、海水淡化、资源 再生等领域。
武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
一、膜分离的类型
1、按推动力不同可分为： （1）扩散膜分离：渗透、透析 （2）压力差膜分离：微滤、超滤、纳滤、反渗透 （3）电位差膜分离：电渗析
2、按膜孔径或截留物质的大小：
水
超滤（UF）
（10-200nm）
纳滤（MF） 反渗透滤（RO）
（2-10nm）
（＜2nm）
武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
各种膜分离法的原理和应用范围
膜分离法 截留的颗粒大小 截留的主要物质 过滤介质 应用举例
微 滤（MF） 0.2~2um
超 滤 （UF） 10nm~200nm 纳滤
《酶的分离和纯化》PPT课件
缓冲液 （e）硫铵溶液密度较高（1.24），故需较大离心力
此步可除去75%以上的杂蛋白，且可使蛋白浓缩
医学PPT
6
透析与浓缩
1）透析袋处理：
透析袋 0.5M EDTA煮半小时 蒸馏水煮半小时 反复八次 带橡皮手套用镊子拿取
2）透析除盐：200倍于被透析物；4小时换一次透 析液；监测电导值
a）关键：配体；配体与支持物的连接方法；吸附、洗脱条件 b）支持物的选择：非特异性吸附作用低；液体流动性好；较宽
的pH、离子强度；丰富的化学基团；有效的多孔性 常用琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶和受控多孔玻璃球 c）配体的选择：有亲和力但不易过大 d）配体与支持物的连接：载体结合法；物理吸附法；交联法； 包埋法（先活化支持物上的功能基团再将配体连上去） e） 吸附剂的衍生物：支持物+空间臂 f） 层析条件的选择：蛋白质+配体 → 蛋白质-配体复合物 起初配体浓度恒定，随蛋白浓度增加平衡右移（逐渐保留特性）， 故亲和力较低也能成功的亲和。 g）洗脱：更高亲和力的物质置换；剧烈改变环境条件
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10
纸层
医学PPT
11
薄层
医学PPT
12
3）离子交换层析（ion exchange chromatography） ： 交换剂上带电荷，可根据样品的电荷予以分离
a）阳离子交换层析 b）阴离子交换层析
c）离子交换剂的类型：离子交换树脂、离子交换纤 维素、离子交换凝胶
d）实验室常用的离子交换剂：阴离子交换剂DEAECellulose 、DEAE-Sephadex；阳离子交换剂 CMCellulose、CM- Sephadex
a）凝胶预处理：凝胶→浸入洗脱液→轻轻搅拌
↓
加热90-100℃（水浴加热）
此步可除去75%以上的杂蛋白，且可使蛋白浓缩
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透析与浓缩
1）透析袋处理：
透析袋 0.5M EDTA煮半小时 蒸馏水煮半小时 反复八次 带橡皮手套用镊子拿取
2）透析除盐：200倍于被透析物；4小时换一次透 析液；监测电导值
a）关键：配体；配体与支持物的连接方法；吸附、洗脱条件 b）支持物的选择：非特异性吸附作用低；液体流动性好；较宽
的pH、离子强度；丰富的化学基团；有效的多孔性 常用琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶和受控多孔玻璃球 c）配体的选择：有亲和力但不易过大 d）配体与支持物的连接：载体结合法；物理吸附法；交联法； 包埋法（先活化支持物上的功能基团再将配体连上去） e） 吸附剂的衍生物：支持物+空间臂 f） 层析条件的选择：蛋白质+配体 → 蛋白质-配体复合物 起初配体浓度恒定，随蛋白浓度增加平衡右移（逐渐保留特性）， 故亲和力较低也能成功的亲和。 g）洗脱：更高亲和力的物质置换；剧烈改变环境条件
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3）离子交换层析（ion exchange chromatography） ： 交换剂上带电荷，可根据样品的电荷予以分离
a）阳离子交换层析 b）阴离子交换层析
c）离子交换剂的类型：离子交换树脂、离子交换纤 维素、离子交换凝胶
d）实验室常用的离子交换剂：阴离子交换剂DEAECellulose 、DEAE-Sephadex；阳离子交换剂 CMCellulose、CM- Sephadex
a）凝胶预处理：凝胶→浸入洗脱液→轻轻搅拌
↓
加热90-100℃（水浴加热）
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酶的分离纯化 (2)优秀课件
1
Contents of chapter 4
Go 第一节 酶的提取与分离纯化技术路线 Go 第二节 细胞破碎 Go 第三节 酶的提取 Go 第四节 酶的分离方法 Go 第五节 酶的浓缩、干燥与结晶 Go 第六节 纯化方案的设计与评价
2
第一节 酶的提取、分离纯化技术路线
革兰氏阳性芽孢菌 ++ + ++ +
酵母
++++
革兰氏阳性球菌 + - + +
菌丝
- ++ - ++
孢子
----
8
有机溶剂可以使细胞膜的磷脂结构破坏，从而改变细胞膜的 透过性，使胞内酶等细胞内物质释放到细胞外。为了防止酶 的变形失活，操作过程应在低温的条件下进行。
表面活性剂可以和细胞膜中的磷脂以及脂蛋白相互作用，使 细胞膜结构破坏，从而增加细胞膜的透过性。表面活性剂有 离子型和非离子型之分，离子型表面活性剂对细胞破碎效果 较好，但是会破坏酶的空间结构，从而影响酶的催化活性。 所以在酶的提取方面，一般采用非离子型的表面活性剂。
2、Ph
在等电点的条件下，酶分子的溶解度最小。不同的酶分子有 其各自不同的等电点。为了提高酶的溶解度，提取时应该避 开酶的等电点，以提高酶的溶解度。但是溶解的PH不宜过 高或过低，以免引起酶的变形失活。
17
3、提取液体积
增加提取液的用量，可以提高酶的提取率。一般总 用量为原料体积的3-5倍。 在酶的提取过程中，含酶原料的颗粒体积越小则扩 散面积越大，有利于提高扩散速度；适当的搅拌 可以使提取液中酶分子迅速离开原料颗粒表面， 从而增大两相界面的浓度差，有利于提高扩散速 度；适当延长提取时间，可以使更多的酶溶解出 来。
通过各种化学试剂对细胞 膜的作用，而使细胞破碎
通过细胞本身的酶系或外加酶 制剂的催化作用，使细胞外层 结构受到破坏，而达到细胞破 碎
捣碎法 研磨法 匀浆法
温度差破碎法 压力差破碎法 超声波破碎法
有机溶剂： 甲苯、丙酮 丁醇、氯仿 表面活性剂： Triton、Tween
自溶法 外加酶制剂法
6
利用捣碎机的高速旋转叶片所产生的剪切力将组织细胞 破碎。 用于破碎动物内脏、植物叶芽等比较脆嫩的组织细胞， 也可以用于微生物，特别是细菌细胞的破碎。
1）机械破碎 2）物理破碎 3）化学破碎 4）酶解破碎
DY89-I型 电动玻璃匀浆机
高 压 细 胞 破 碎 机
细 胞 破 碎 珠
5
细胞破碎方法及其原理
机械破碎
通过机械运动产生的剪切 力，使组织、细胞破碎。
物理破碎 化学破碎 酶促破碎
通过各种物理因素的作用， 使组织、细胞的外层结构破 坏，而使细胞破碎。
9
细胞破碎确认
1.直接测定破碎前后的细胞数： 破碎前，用显微镜或电子微粒计数器直接计数； 破碎后，用染色法区分破碎细胞与完整细胞。
2.测定导电率： 利用破碎前后导电率的变化测定破碎程度。
3.测定释放的蛋白质量或酶活力： 测定破碎液中胞内蛋白质或目的酶的释放量，估算破
碎率。
10
第三节 酶的提取
酶的提取是指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液处 理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程。
酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质，选择适当的 溶剂。一般说来，极性物质易溶于极性溶剂中，非极性 物质易溶于非极性的有机溶剂中，酸性物质易溶于碱性 溶剂中，碱性物质易溶于酸性溶剂中。
酶都能溶解于水，通常可用水或稀酸、稀碱、稀盐溶液 等进行提取，有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基 团，则可用有机溶剂提取。
细胞破碎 酶提取
动物、植物或微生物细胞 发酵液
酶分离纯化
酶浓缩 酶贮存
离心分离，过滤分离，沉淀分 离，层析分离，电泳分离，萃 取分离，结晶分离等。
3
酶分离纯化不同阶段
酶的纯化过程，约可分为三个阶段：
(1) 粗蛋白质 (crude protein): 取样 → 均质打破 细胞 → 抽出全蛋白，多使用 盐析沉淀法；可以粗略 去除蛋白质以外的物质。
时即发生相互聚集沉淀出来，这样就出现了“盐析”
现象。
14
15
16
二、影响提取的主要因素
1、温度
提取时的温度对酶的提取效果有明显影响。一般来说，适当 提高温度，可以提高酶的溶解度，也可以增大酶分子的扩散 速度，但是温度过高，这容易引起酶的变形。在不影响酶的 活性的条件下适当提高温度，有利于酶的提取。
13
盐溶:
当加入少量盐时，增多了蛋白质分子上
的极性基团，因而增大了蛋白质在水中溶解度，出现
“盐溶”现象。
盐析:当盐浓度增加到一定浓度时，一方面大量的水
同盐分子结合，使得蛋白质没有足够的水维持溶解状 态，破坏了维持蛋白质亲水胶的水膜，容易沉淀出来； 另一方面加入的盐离子中和了蛋白质分子，相互磁撞
(2) 部分纯化 (partially purified): 初步的纯化， 使用各种 柱层析法。
(3) 均质酶 (homogeneous): 目标酶的进一步精制纯 化，可用制备式电泳 或 HPLC。
4
第二节 细胞破碎
许多酶存在于细胞内。 为了提取这些胞内酶， 首先需要对细胞进行破 碎处理。
JY92-II D超声波 细胞粉碎机
盐溶液提取
酸溶液提取
碱溶液提取
有机溶剂提 取
0.02～0.5mol/L的盐 溶液 PH2～6的水溶液
PH8～12的水溶液
可与水混溶的有机溶 剂
用于提取在低浓度盐溶液中溶 解度较大的酶
用于提取在稀酸溶液中溶解度 大，且稳定性较好的酶
用于提取在稀碱溶液中溶解度 大且稳定性较好的酶
用于提取那些与脂质结合牢固 或含有较多非极性基团的酶
利用研钵、石磨、球磨等研磨器械所产生的剪切力将 组织细胞破碎。可以加入精制石英砂、小玻璃球、氧 化铝等作为助磨剂。 常用于微生物和植物组织细胞的破碎。7细胞对破碎方法的敏感性
细胞
声波 机械 渗透压 冻融
——————————————————— —
动植物
+++ +++ +++ +++
革兰氏阴性菌 ++ ++ ++ ++
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提高温度，降低溶液粘度、增加扩散面积、縮 短扩散距离，增大浓度差等都有利于提高酶分 子的扩散速度，从而增大提取效果。
为了提高酶的提取率并防止酶的变性失活，在 提取过程中还要注意控制好温度、pH值等提取 条件。采用低温下（0--10℃）操作。
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一、酶的主要提取方法
提取方法 使用的溶剂或溶液 提取对象
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Contents of chapter 4
Go 第一节 酶的提取与分离纯化技术路线 Go 第二节 细胞破碎 Go 第三节 酶的提取 Go 第四节 酶的分离方法 Go 第五节 酶的浓缩、干燥与结晶 Go 第六节 纯化方案的设计与评价
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第一节 酶的提取、分离纯化技术路线
革兰氏阳性芽孢菌 ++ + ++ +
酵母
++++
革兰氏阳性球菌 + - + +
菌丝
- ++ - ++
孢子
----
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有机溶剂可以使细胞膜的磷脂结构破坏，从而改变细胞膜的 透过性，使胞内酶等细胞内物质释放到细胞外。为了防止酶 的变形失活，操作过程应在低温的条件下进行。
表面活性剂可以和细胞膜中的磷脂以及脂蛋白相互作用，使 细胞膜结构破坏，从而增加细胞膜的透过性。表面活性剂有 离子型和非离子型之分，离子型表面活性剂对细胞破碎效果 较好，但是会破坏酶的空间结构，从而影响酶的催化活性。 所以在酶的提取方面，一般采用非离子型的表面活性剂。
2、Ph
在等电点的条件下，酶分子的溶解度最小。不同的酶分子有 其各自不同的等电点。为了提高酶的溶解度，提取时应该避 开酶的等电点，以提高酶的溶解度。但是溶解的PH不宜过 高或过低，以免引起酶的变形失活。
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3、提取液体积
增加提取液的用量，可以提高酶的提取率。一般总 用量为原料体积的3-5倍。 在酶的提取过程中，含酶原料的颗粒体积越小则扩 散面积越大，有利于提高扩散速度；适当的搅拌 可以使提取液中酶分子迅速离开原料颗粒表面， 从而增大两相界面的浓度差，有利于提高扩散速 度；适当延长提取时间，可以使更多的酶溶解出 来。
通过各种化学试剂对细胞 膜的作用，而使细胞破碎
通过细胞本身的酶系或外加酶 制剂的催化作用，使细胞外层 结构受到破坏，而达到细胞破 碎
捣碎法 研磨法 匀浆法
温度差破碎法 压力差破碎法 超声波破碎法
有机溶剂： 甲苯、丙酮 丁醇、氯仿 表面活性剂： Triton、Tween
自溶法 外加酶制剂法
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利用捣碎机的高速旋转叶片所产生的剪切力将组织细胞 破碎。 用于破碎动物内脏、植物叶芽等比较脆嫩的组织细胞， 也可以用于微生物，特别是细菌细胞的破碎。
1）机械破碎 2）物理破碎 3）化学破碎 4）酶解破碎
DY89-I型 电动玻璃匀浆机
高 压 细 胞 破 碎 机
细 胞 破 碎 珠
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细胞破碎方法及其原理
机械破碎
通过机械运动产生的剪切 力，使组织、细胞破碎。
物理破碎 化学破碎 酶促破碎
通过各种物理因素的作用， 使组织、细胞的外层结构破 坏，而使细胞破碎。
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细胞破碎确认
1.直接测定破碎前后的细胞数： 破碎前，用显微镜或电子微粒计数器直接计数； 破碎后，用染色法区分破碎细胞与完整细胞。
2.测定导电率： 利用破碎前后导电率的变化测定破碎程度。
3.测定释放的蛋白质量或酶活力： 测定破碎液中胞内蛋白质或目的酶的释放量，估算破
碎率。
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第三节 酶的提取
酶的提取是指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液处 理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程。
酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质，选择适当的 溶剂。一般说来，极性物质易溶于极性溶剂中，非极性 物质易溶于非极性的有机溶剂中，酸性物质易溶于碱性 溶剂中，碱性物质易溶于酸性溶剂中。
酶都能溶解于水，通常可用水或稀酸、稀碱、稀盐溶液 等进行提取，有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基 团，则可用有机溶剂提取。
细胞破碎 酶提取
动物、植物或微生物细胞 发酵液
酶分离纯化
酶浓缩 酶贮存
离心分离，过滤分离，沉淀分 离，层析分离，电泳分离，萃 取分离，结晶分离等。
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酶分离纯化不同阶段
酶的纯化过程，约可分为三个阶段：
(1) 粗蛋白质 (crude protein): 取样 → 均质打破 细胞 → 抽出全蛋白，多使用 盐析沉淀法；可以粗略 去除蛋白质以外的物质。
时即发生相互聚集沉淀出来，这样就出现了“盐析”
现象。
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二、影响提取的主要因素
1、温度
提取时的温度对酶的提取效果有明显影响。一般来说，适当 提高温度，可以提高酶的溶解度，也可以增大酶分子的扩散 速度，但是温度过高，这容易引起酶的变形。在不影响酶的 活性的条件下适当提高温度，有利于酶的提取。
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盐溶:
当加入少量盐时，增多了蛋白质分子上
的极性基团，因而增大了蛋白质在水中溶解度，出现
“盐溶”现象。
盐析:当盐浓度增加到一定浓度时，一方面大量的水
同盐分子结合，使得蛋白质没有足够的水维持溶解状 态，破坏了维持蛋白质亲水胶的水膜，容易沉淀出来； 另一方面加入的盐离子中和了蛋白质分子，相互磁撞
(2) 部分纯化 (partially purified): 初步的纯化， 使用各种 柱层析法。
(3) 均质酶 (homogeneous): 目标酶的进一步精制纯 化，可用制备式电泳 或 HPLC。
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第二节 细胞破碎
许多酶存在于细胞内。 为了提取这些胞内酶， 首先需要对细胞进行破 碎处理。
JY92-II D超声波 细胞粉碎机
盐溶液提取
酸溶液提取
碱溶液提取
有机溶剂提 取
0.02～0.5mol/L的盐 溶液 PH2～6的水溶液
PH8～12的水溶液
可与水混溶的有机溶 剂
用于提取在低浓度盐溶液中溶 解度较大的酶
用于提取在稀酸溶液中溶解度 大，且稳定性较好的酶
用于提取在稀碱溶液中溶解度 大且稳定性较好的酶
用于提取那些与脂质结合牢固 或含有较多非极性基团的酶
利用研钵、石磨、球磨等研磨器械所产生的剪切力将 组织细胞破碎。可以加入精制石英砂、小玻璃球、氧 化铝等作为助磨剂。 常用于微生物和植物组织细胞的破碎。7细胞对破碎方法的敏感性
细胞
声波 机械 渗透压 冻融
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动植物
+++ +++ +++ +++
革兰氏阴性菌 ++ ++ ++ ++
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提高温度，降低溶液粘度、增加扩散面积、縮 短扩散距离，增大浓度差等都有利于提高酶分 子的扩散速度，从而增大提取效果。
为了提高酶的提取率并防止酶的变性失活，在 提取过程中还要注意控制好温度、pH值等提取 条件。采用低温下（0--10℃）操作。
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一、酶的主要提取方法
提取方法 使用的溶剂或溶液 提取对象