转录组测序技术原理及应用优秀课件
转录组测序ppt课件
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2019/5/5
环境转录组也可以这样做
• 使用RNA-seq手段对实验样本进行转录组分析，关注个体或者组织器 官在不同环境条件下基因表达的动态变化，挖掘生物对逆境适应的分 子机制。
转录组？
• 转录组是特定组织或细胞在某一功能状态下所能 转录出来的所有RNA的总和，包括mRNA和非编码 RNA。
• 转录组（transcriptome）广义上指某一生理条件 下，细胞内所有转录产物的集合，包括信使RNA、 核糖体RNA、转运RNA及非编码RNA；狭义上指所有 mRNA的集合。蛋白质是行使细胞功能的主要承担 者，蛋白质组是细胞功能和状态的最直接描述， 转录组成为研究基因表达的主要手段，转录组是 连接基因组遗传信息与生物功能的蛋白质组的必 然纽带，转录水平的调控是目前研究最多的，也 是生物体最重要的调控方式。
3. DNA成簇（Cluster）扩增
4. 高通量测序（Illumina Genome Analyzer IIx）信息分析流程
生物信息分析
基本信息分析
• 数据量产出：>2Gb per sample • 测序策略：HiSeq2000, PE91 or 101 • 插入片段大小：200 bps • 测序质量控制：Q20% >80
相关概念
• 高通量测序中，每测一个碱基会给出一个相应的质量值， 这个质量值是衡量测序准确度的。Q20与Q30则表示质量值 大于等于20或30的碱基所占百分比。
• Q20值是指的测序过程碱基识别过程中，对所识别的碱基 给出的错误概率。
• 质量值Q20，错误识别概率是1%，即正确率是99%； 质量值Q30，错误识别概率是0.1%，即正确率是99.9%； 质量值Q40，错误识别概率是0.01%，即正确率99.99%； Q“N”0的质量值，就是正确率有N个9的百分比。
RNA-seq技术原理及应用-课件PPT
3.把高通量测序技术应用到由 RNA 逆转录生成 的 cDNA 上，从而获得来自不同基因的RNA 片段 在特定样本中的含量，这就是 RNA测序或 RNA-
总结
高通量测序技术的应用面非常广，RNA-seq 只是 其中一个方面，除此之外，基因组的从头测序和重 测序 、染色质免疫沉淀测序、甲基化测序等技术都 同样有着广泛的应用。
进一步，通过对供体和受体位点的读段计数，结合 外显子其他区域的读段数据，还能定量地计算选择性 剪接事件之间的比例。
三、RNA-seq结果分析
两类样本 RNA-seq 数据比较分析的框架
四、RNA-seq技术应用
1、转录本结构研究 利用单碱基分辨率的RNA-Seq技术可极大地丰
富基因注释的很多方面内容, 包括 5′/3′边界鉴定、 UTRs区域鉴定以及新的转录区域鉴定等。RNA-Seq 还可对可变剪接(Alternative splicing)进行定量研究。
三、RNA-seq结果分析
2. 基因表达水平估计 RNA-seq 数据最基本的应用是检测基因的表达水 平 ，与基因芯片数据相比 ，RNA 测序得到的是数字 化的表达信号，具有灵敏度高、分辨率高、无饱和区 等优势。 RNA 测序数据是对提取出的 RNA 转录本中随机 进行的短片段测序，如果一个转录本的丰度高，则测 序后定位到其对应的基因组区域的读段也就多，可以 通过对定位到基因外显子区的读段计数来估计基因表 达水平。
二、RNA板扩增
序列
1234
TTTT…
簇序列读取反应
单细胞转录组测序技术的应用
单细胞转录组测序技术的应用随着生物学研究的深入，单细胞转录组测序技术 (single-cell RNA sequencing, ScRNA-seq) 逐渐成为重要的技术手段，能够帮助我们深入地探究单细胞的生物学特征，揭示不同细胞类型、状态、异质性等方面的信息。
本文将分为三个部分，分别介绍单细胞测序技术的基本原理、应用场景和挑战。
一、单细胞测序技术的基本原理从整体到单细胞的转录组测序技术，对于人们的认知层次有了很大的扩展。
ScRNA-seq是一种高通量测序技术，因其能够真正实现在单细胞尺度上进行基因表达谱分析而备受青睐。
其基本原理是：先将个体细胞分离成成功能独立的单细胞，将其转录组RNA股段反转录成合成cDNA，再在cDNA的每个末尾加上一个芯片特异性的序列，可以将所有单个细胞cDNA融合成一个DNA文库，最终由高通量测序技术进行测序，从而得到单个细胞的RNA序列。
测序完成后，我们可以获得丰富的单细胞转录组数据，对于分析特定细胞类型、功能等方面均有非常大的帮助。
二、单细胞测序技术的应用场景1、细胞异质性分析传统方法可能需要收集许多细胞并混合分析，由于共混样品中，每个样品对应多种细胞类型共存，无法获取单个染色体或簇的特定RNA信息。
单细胞测序技术则可在单个细胞的水平上，为研究人员提供更详尽的RNA信息，还有利于分析不同细胞之间的异质性。
2、疾病诊断人体的基因组、转录组和蛋白质组的状态可受多种因素的影响。
采用单细胞测序技术可以探寻特定细胞的转录组变化，为疾病的诊断、预防提供新方法，如检测淋巴癌肿瘤细胞中的微RNA。
3、分析细胞发育过程单细胞测序技术的突出优势在于可以追踪单个细胞的分化和发育过程，通过对单个细胞的分析，可以揭示不同细胞类型间的转录组变化，从而找到控制癌症进程的新靶点。
三、单细胞测序技术的挑战虽然单细胞测序技术具有较大的优势，但是也存在着一些挑战，例如技术的稳定性、批次效应及灵敏度等缺陷，此外，单细胞测序的数据处理技术也需要不断地完善。
RNA-seq技术原理及应用[优质ppt]
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3.把高通量测序技术应用到由 RNA 逆转录生成 的 cDNA 上，从而获得来自不同基因的RNA 片段在 特定样本中的含量，这就是 RNA测序或 RNA-seq。
三、RNA-seq结果分析
2. 基因表达水平估计 RNA-seq 数据最基本的应用是检测基因的表达水 平 ，与基因芯片数据相比 ，RNA 测序得到的是数字 化的表达信号，具有灵敏度高、分辨率高、无饱和区 等优势。 RNA 测序数据是对提取出的 RNA 转录本中随机 进行的短片段测序，如果一个转录本的丰度高，则测 序后定位到其对应的基因组区域的读段也就多，可以 通过对定位到基因外显子区的读段计数来估计基因表 达水平。
进一步，通过对供体和受体位点的读段计数，结合 外显子其他区域的读段数据，还能定量地计算选择性 剪接事件之间的比例。
三、RNA-seq结果分析
两类样本 RNA-seq 数据比较分析的框架
四、RNA-seq技术应用
1、转录本结构研究 利用单碱基分辨率的RNA-Seq技术可极大地丰
富基因注释的很多方面内容, 包括 5′/3′边界鉴定、 UTRs区域鉴定以及新的转录区域鉴定等。RNA-Seq 还可对可变剪接(Alternative splicing)进行定量研究。
二、RNA板扩增
序列组装和比较
图像获得和处理
TGCT…
1234
TTTT…
簇序列读取反应
二、RNA-seq技术原理
RNA-seq实验流程图
三、RNA-seq结果分析
为了便于测序数据的发布和共享，高通量测序数据以 FASTQ 格式来记录所测的碱基读段和质量分数。 NCBI、EBI、 DDBJ 等数据中心建立了大容量的数据库 SRA来存放共享的测 序数据。
转录组测序原理.pptx
激发碱基荧光并收集荧光信号
去除阻断基团和荧光基团
Cycle 2-n:
重复前面的步骤
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ห้องสมุดไป่ตู้基片段杂交
OH
diol
P7 P5
Flow Cell接头
diol diol
模板杂交
diol diol
延长
diol diol
变性
第17页/共40页
Cluster station
• 剩下的复制链其一端“固定”在芯片上，
Throughput : up to 25 Gb per day
Output 26-35 Gb 75-100 Gb 150-200 Gb
第15页/共40页
基于SBS测序技术
3’-
…-5’
5’-
GTATTTTCGGCACAG
A
G
A
C
T
T
C TG
Cycle 1:按顺序加入反应试剂
合成第一个碱基
清除未反应的碱基和试剂
第25页/共40页
鉴定基因可变剪接
exon1
common reads
exon2
exon3
mRNA
exon1
junction reads
exon3
exon1
exon2
exon3
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鉴定融合基因
第27页/共40页
Paired Reads distribution
Reads cluster
主要内容• 样品检测 • 制备 • Cluster Station • Illumina Sequencing • 生物信息分析
第14页/共40页
新一代测序技术
转录组测序技术在生命科学中的应用
转录组测序技术在生命科学中的应用转录组测序技术是一种高通量的基因表达分析方法，其可以快速地测定给定组织或细胞类型的RNA表达谱，为生命科学研究提供了很多有用的信息。
本文将介绍转录组测序技术的原理、应用和发展趋势。
一、转录组测序技术原理转录组测序技术基本原理是基于对RNA序列的生成和定量测定进行研究，在这种技术中，研究人员首先通过提取细胞RNA，随后将RNA转录成cDNA，然后对cDNA进行序列测序，并利用计算机技术将所有序列比对到参考基因组上，最后进行差异表达分析。
二、转录组测序技术应用转录组测序技术可以用于解决很多生命科学领域的问题，例如：1. 基因表达和调控机制研究通过对不同组织或细胞类型的RNA表达谱进行测定，可以深入了解特定基因的表达方式和调控机制，从而研究基因功能和生物学过程。
2. 疾病诊断和治疗利用转录组测序技术可以鉴定疾病相关的基因或基因组表达差异，为疾病的早期诊断和治疗提供基础研究依据。
3. 新药开发和生物技术应用通过转录组测序技术可以鉴定新的生物标志物或靶点，为新药开发提供基础研究支持。
此外，该技术也可以用于鉴定新的生物工程应用和研究。
三、转录组测序技术的发展趋势1. 单细胞RNA测序传统的RNA-seq技术是基于从组织层面提取RNA，但这种方法可能掩盖了单个细胞内表达水平的差异。
单细胞RNA-seq技术可以快速准确地测定单个细胞的RNA表达级别，从而更好地了解细胞异质性。
2. 亚型和异构体表达的鉴定RNA-seq技术可以直接从RNA样本中测定不同亚型和异构体的表达信息。
这种信息可以帮助研究人员深入了解基因表达的复杂性和多样性。
3. 基因组编辑和治疗的潜在应用随着CRISPR/Cas9技术的快速发展，RNA-seq技术可以结合CRISPR/Cas9技术来研究基因编辑和治疗的潜在应用，例如基因敲除和插入等。
结论总之，转录组测序技术是一种强大的基因表达分析技术，其已在生命科学领域中取得了突破性进展。
RNA-SEQ原理及应用解析PPT课件
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2020/1/1
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• 3、RPKM（reads per kilobase per million reads）是每百万 读段中来自于某基因每千碱基长度的读段数。其公式为:
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高通量测序
• 高通量测序技术（High-throughput sequencing）是指 能够一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定， 每一次序列测定的读长一般较短的测序技术。
• 高通量测序技术是对传统测序一次革命性的改变，一次对 几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，因此在有些文 献中称其为下一代测序技术(next generation sequencin g)足见其划时代的改变，同时高通量测序使得对一个物种 的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，所以又 被称为深度测序(deep sequencing)。
所以近年来，许多通过RNA-seq进行测序分析的文章都包括对
ncRNA的分析，并且发现了许多新的ncRNA。
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二、RNA-seq技术原理
RNA-seq 实验流程图
首先，我们获得细胞总RNA，然后根据实 验需要，比如是需要测mRNA，ncRNA还 是 smallRNA等，对RNA样品进行处理。处理
好的RNA再进行片段化最后用新一代高通量测序 依进行测序。
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三种高通量测序技术的优缺点
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高通量测序中重要名词解释
• 1、测序深度：测序得到的总碱基数与待测基因组大小的比值。 假设一个基因组大小为7M，测序总碱基数为70M，则测序深 度为10×。
转录组测序技术原理及应用PPT课件
Total RNA
Eukaryon
Procaryon
Enrich mRNA by OligoT
Remove rRNA
RNA fragmentation (200nt~700nt)
Random hexamer primed cDNA synthesis
Size selection, then PCR amplification
Eukaryon
Procaryon
Enrich mRNA by OligoT
Remove rRNA
RNA fragmentation
Random hexamer primed cDNA synthesis
Size selection, then PCR amplification
HiSeq 2000 sequencing
Size selection, then PCR amplification
HiSeq 2000llumina Sequencing 生物信息分析
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Applications of RNA-Seq
Application
Expression-profiling Alternative Splicing Fusion Gene SNP detection
RT ds cDNA
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末端修复(防止自连） cDNA 3′末端加A Adapter连接
.14第一天制备第二天第三天消化DNA
↓
mRNA的分离
↓
mRNA的打断
↓
cDNA的合成
末端修复
↓
3’端↓ 加A
↓
加接头↓胶回收质量检测： Aligent 2100：片段大小、纯度、浓度 qPCR：片段大小、浓度 手工检测：跑胶验证。
转录组测序技术原理及应用 ppt课件
转录组测序技术原理及应用
Applications of RNA-Seq
Application
Expression-profiling Alternative Splicing Fusion Gene SNP detection
真核mRNA的纯化
mRNA的纯化主要通过的磁珠与 生物素吸附原理从而分离纯化
Oligo（dT）25磁珠纯化原理主要 是mRNA的3′的poly A与磁珠在 bindingbuffer的作用下相结合。磁 珠通过MPC（磁分离器）从溶液 中分离出来。
mRNA与磁珠结合后，再用Tris-
HCL在加热条件下解离洗脱到溶
加入1µl的stop buffer终止 反应。
加入沉淀剂（NaAc 糖原 无水乙醇）沉淀产物。
RT ds cDNA
转录组测序技术原理及应用
末端修复(防止自连） cDNA 3′末端加A Adapter连接
转录组消化DNA
↓
mRNA的分离
↓
mRNA的打断
Size selection, then PCR amplification
HiSeq 2000n Illumina Sequencing 生物信息分析
转录组测序技术原理及应用
系统生物学-第三讲-转录组学PPT课件
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• 第一个被确认的miRNA——在线虫中首次发现的lin-4 和 let-7 ，可以通过部分互补结合到目的mRNA靶的3’非编 码区(3’UTRs)，以一种未知方式诱发蛋白质翻译抑制， 进而抑制蛋白质合成，通过调控一组关键mRNAs的翻译 从而调控线虫发育进程。
继线虫之后，随后多个研究小组在包括人类、果蝇、植物等多 种生物物种中鉴别出数百拼接和注释表达与分类功能分析作用机理分析qpcr验证est软件平台est序列库序列的质量检查测序量监控聚类和拼接检查借助于基因组信息全长orf寻找发现全长基因研究表达基因概况的主要实验手段dnachipproteomics的先驱功能分类表达量分析交替剪接检测est特有信息microarray和genechip大规模表达谱或全景式表达谱globalexpressionprofile
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表达序列标签(EST)测定及分析
1、什么是EST? 2、EST的应用 3、EST序列测定及分析过程
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1、表达序列与表达序列标签概念
(1) 什么是表达序列?
基因组表达为RNA的序列: mRNA和功能RNA
(2) 什么是表达序列标签?
（expressed sequence tag, EST）
• 转录组研究是基因功能及结构研究的基础和 出发点，是解读基因组功能原件和揭示细胞 及组织分子组成所必需的。
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• 转录组的特点：受到内外多种因素的调节，因而是 动态可变的。能够揭示不同物种、不同个体、不同 细胞、不同发育阶段及不同生理病理状态下的基因 差异表达信息。
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• 转录组学（Transcriptomics）：研究细胞在某 一功能状态下所含mRNA的类型与拷贝数；比较不
单细胞转录组测序技术的简介及应用 (1)
目录
CONTENTS
1. 技术简介 2. 研究应用 3.临床应用
01 技术简介
普通转录组（Bulk RNA）和单细胞转录组有什么区别？
广义转录组（Transcriptome）：指从一种细胞或者组织的基因组所转录出来的 RNA 的总和，包括编码蛋白质的 mRNA 和各种非编码 RNA（rRNA, tRNA, microRNA 和其他非编码 RNA 等）。 狭义转录组:指所有参与翻译蛋白质的 mRNA 总和。 单细胞转录组学：单细胞转录组分析技术是一种高通量基因表达分析技术，可 以通过对单个细胞的RNA 进行测序，识别不同类型的细胞，分析基因表达变异 性等。 传统的转录组学研究通常采用大量细胞的混合物作为样本，而单细胞转录组学 则可以对单个细胞进行分析，从而揭示细胞之间的异质性和功能差异。
以10X单细胞转录组测序为例
➢ 10X单细胞转录组测序技术又叫流式细胞术分选技术，该技术的核心利用「微流控芯片」对细胞进行精确区分， 通过「10xBarcodes」标记每一个细胞，能实现大规模的单细胞转录组测序，从而更高分辨率地揭示细胞间的细 胞差异以及其在微环境中的功能情况，在细胞异质性研究中表现出色。
优势： ➢ 通量高:灵活的获取量，可一次性对500-10000个细胞建库，提高效率 ➢ 周期短:10 分钟内完成上万个细胞封装，一天之内完成细胞悬液制备、
单细胞捕获、扩增以及建库； ➢ 捕获效率高:细胞捕获效率高达 65 %，不需要微量扩增，降低假阳性
率； ➢ 应用范围广:成本低，动物细胞和植物细胞均可以进行单细胞测序，
2. 发现新细胞类型：通过单细胞转录组，我们可以识别和定义新的细胞类型，特别是在复杂组织如脑和免疫系统 中。
基因转录组的测定及分析ppt课件
● 与编码区具有很强的保守性不同，3’UTRs序列的保守性 较差，因此很容易将单个基因与编码序列关系非常紧密的相 似基因家族成员分开。 （精J选aPmPT课e件s Sikela等，1991年） 9
EST的应用 3
ESTs与基因预测SAGE的测序： 单向测序。精选PPT课件
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Serial analysis of gene expression (SAGE) 分析流程
在双标签多聚体序列中定位NlaIII酶切位点（即CATG）； 提取CATG位点之间的20－22bp长的双标签序列； 去除重复出现的双标签序列，包括反向互补方向上重复的双
EST数量排名前10的物种
Organism Homo sapiens (human) Mus musculus + domesticus (mouse) Zea mays (maize) Bos taurus (cattle) Arabidopsis thaliana (thale cress) Danio rerio (zebrafish) Glycine max (soybean) Xenopus tropicalis (western clawed frog) Oryza sativa (rice) Ciona intestinalis
精选PPT课件
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大规模EST序列测定的开始
1983年：Costanzo等提出EST概念的雏形
1991年：Adams测定了三种人脑组织共609条EST，宣布
了cDNA大规模测序的时代的开始代
1991年：Okubo等提出大规模cDNA测序的研究战略
1993年：Venter等创立现在的EST技术
转录组测序原理
最后，对测序结果进行数据分析。这包括质量控制、序列比对、注释和表达水平分析等。通过比较不同样品的转录本组成和表达水平，可以揭示基因调控和功能等方面的信息。
转录组测序技术的快速发展使我们能够全面了解细胞中的基因表达调控网络，从而深入理解生物体在不同生理状态和疾病中的分子机制。
接下来，使用RNA提取试剂盒等方法从细胞或组织中提取RNA，并通过纯化步骤去除污染物。
然后，利用反转录酶将mRNA转录为互补的cDNA。这一步骤通过引物（如寡聚dT引物）将RNA中的poly(A)尾部作为起便后续测序和标记。然后序是一种高通量测序技术，用于研究细胞中的所有转录本（mRNA）的组成和表达水平。该技术的原理基于将转录本转化为可测序的cDNA，并通过高通量测序平台进行测序。
转录组测序的步骤Байду номын сангаас要包括：样品准备、RN准备样品并提取总RNA。样品可以是各种细胞或组织类型，包括动物、植物或微生物。总RNA中包含多种类型的RNA，如mRNA、rRNA、tRNA和非编码RNA等。
转录组测序原理
通过比较不同条件或不同组织样本的转录本序列，可以检测基因表达的差异，从而分析基因表达的调控机制和相关生 物学过程。
稀有转录本的发现
转录组测序能够检测到稀有的转录本，这些稀有转录本在常规的基因表达分析中容易被忽略，但它们可 能在特定的生物学过程中发挥重要作用。
转录组测序的数据处理流程
数据质量控制
02
利用模式生物基因组小、繁殖 快、易培养等特点，进行高通 量、高分辨率的转录组测序。
03
将模式生物转录组研究成果应 用到人类和其他复杂生物的研 究中，促进生命科学领域的发 展。
案例三：生态与环境转录组研究
01
02
03
研究生物与环境之间的相互作用 和适应机制，揭示生态系统中物 种间的相互关系和协同进化。
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转录组测序的关键技术
下一代测序技术
下一代测序技术，也称为高通量测序技术，能够同时对大量DNA或RNA 片段进行序列测定，大大提高了测序的速度和通量。
常见的下一代测序技术包括全基因组测序、全外显子测序和转录组测序等。
下一代测序技术的基本原理是采用可逆性末端终止的合成方法，通过不同 碱基的荧光标记和计算机系统进行序列读取。
基因注释与功能分类
01
基因注释是指对基因的功能、位置、表达等特征进行描述和 分类的过程。
02
通过基因注释，可以了解基因的生物学功能、参与的生物过 程以及在细胞中的定位等信息。
03
功能分类是将基因按照其功能相似性进行归类，有助于深入 理解基因的协同作用和调控网络。
基因网络与通路分析
01
基因网络是指基因之间相互作用的复杂网络，包括蛋
通过比较不同条件或组 织样本的转录本序列， 检测基因表达的差异， 筛选出差异表达的基因 。
转录组测序的原理及步骤
转录组测序的原理及步骤转录组测序是一种用于研究生物体内转录组的高通量测序技术。
转录组测序可以帮助我们全面了解基因在特定条件下的表达情况，从而揭示基因调控的机制、功能和调控网络等重要信息。
本文将详细介绍转录组测序的原理和步骤。
一、转录组测序的原理转录组测序的原理基于高通量测序技术，它通过将RNA转录本转化为DNA片段，再进行测序，从而获得RNA转录本的序列信息。
转录组测序可以分为两种主要方法：全长转录本测序和非全长转录本测序。
全长转录本测序（Full-Length Transcript Sequencing，FLTS）是指对转录本进行全长测序，并且能够确定转录本的5'端和3'端序列信息。
全长转录本测序可以通过一系列的实验步骤来实现，包括RNA提取、RNA逆转录、cDNA合成、DNA片段构建和测序等。
非全长转录本测序（Non-Full-Length Transcript Sequencing，NFLTS）是指对转录本进行部分测序，并且只能确定转录本的部分序列信息。
非全长转录本测序可以通过不同的方法来实现，如转录组测序技术中常用的RNA-Seq技术。
二、转录组测序的步骤转录组测序的步骤主要包括样品准备、RNA提取、RNA质量检测、RNA逆转录、cDNA合成、文库构建、测序和数据分析等。
1. 样品准备：选择合适的样品，如细胞、组织或体液等，根据实验设计的需要确定不同条件下的样品。
2. RNA提取：从样品中提取总RNA，常用的方法有TRIzol法、RNAeasy Mini Kit法等。
3. RNA质量检测：使用比较常用的方法如NanoDrop、Agilent 2100 Bioanalyzer等检测RNA的浓度和纯度。
4. RNA逆转录：将RNA转化为cDNA，逆转录反应可以使用逆转录酶和随机引物或寡聚引物进行。
5. cDNA合成：将逆转录得到的cDNA进行二次扩增，得到足够的DNA量用于后续的文库构建。
转录组测序技术原理
转录组测序技术原理
转录组测序技术主要是利用高通量测序技术来进行转录组的分析。
其主要步骤包括：
准备RNA样本：首先需要从感兴趣的组织或细胞中提取总RNA。
可以选择不同的提取方法来保证RNA的完整性和纯度。
构建RNA文库：将提取的总RNA通过逆转录反应合成cDNA，然后通过加入适配体和连接等步骤，构建成文库。
这些文库包含了所有转录过程中的RNA分子，包括mRNA、ncRNA等。
高通量测序：将构建的RNA文库进行高通量测序。
目前常用
的测序技术包括Illumina的RNA-seq和PacBio的SMRT-seq。
这些测序技术可以快速获取大量的测序数据。
数据分析：通过生物信息学分析将测序得到的数据转化为可解读的信息。
首先，对测序数据进行质量控制和去除低质量的数据。
然后，将剩余的数据比对到参考基因组或转录组中，得到每个基因的表达水平。
最后，对表达水平进行统计学分析、差异分析和功能注释等进一步分析。
转录组测序技术可以广泛应用于研究基因表达调控、新基因的发现、剪接异构体的鉴定等。
通过该技术，可以全面、准确地了解细胞或组织的基因表达情况，从而帮助我们理解生物体的发育、疾病等重要生命过程。
转录组测序技术.精选PPT
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RNA-Seq 技术背景
有关于ncRNA的一些知识
非编码RNA（ncRNA）主要包括：转运 RNA（tRNA），核糖体RNA(rRNA)，小核 RNA（snRNA），核仁小分子RNA（ snoRNA），细胞质小分子RNA（scRNA）， 不均一核RNA（hnRNA）及小RNA（ microRNA,miRNA）等。
转录组测序技术：是指利用第二代 高 通 量 测 序 技 术 进 行 cDNA 测 序 ， 全面快速地获取某一物种特定器 官或组织在某一状态下的几乎所 有转录本。
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RNA-Seq 技术背景
高通量测序技术（High-throughput sequencing ）是指能够一次并行对几十万到几百万条DNA 分子进行序列测序，每一次序列测定的读长一 般较短的测序技术。 高通量测序技术是对传统测序一次革命性的改 变，一次对几十万几百万条DNA分子进行序列 测序，因此在有些文献中称其为下一代测序技 术（next generation sequencing）组件其划时代 的改变，同时高通量测序使得对一个物种的转 录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能， 所以又被称为深度测序（deep sequencing）
台测序原理及序列长度的差异决定了各种高通
量测序仪具有不同的应用侧重。
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RNA-Seq 技术背景
转录组（transcriptome）
广义：指某一生理条件下，细胞内所 有转录产物的集合，包括信使RNA、 核糖体RNA、转运RNA及非编码RNA。
狭义：指所有mRNA的集合。
5技术
转录组测序技术
RNA-Seq第一技讲术背景 RNA-Seq第二技讲术原理 RNA-Seq第三技讲术应用领域 RNA-Seq 技术优势 RNA-Seq 技术...面..... 临的挑战及发展
转录组学测序
转录组学测序随着基因组学技术的快速发展，转录组学测序成为了研究生物学问题的重要手段之一。
通过对转录组的测序分析，可以了解生物体内的基因表达情况、基因调控机制以及疾病发生的分子机制等重要信息。
一、转录组学测序的基本原理转录组学测序是指利用高通量测序技术对细胞或组织中的RNA进行测序分析，以获取基因表达的信息。
转录组学测序的基本原理如下：1. RNA提取：首先从样品中提取RNA，利用RNA清洁试剂去除DNA和蛋白质等杂质。
2. RNA质量评估：通过凝胶电泳、分光光度计等方法对RNA质量进行评估，保证RNA质量符合测序的要求。
3. RNA文库构建：利用RNA分离、逆转录、二代测序等技术构建RNA文库，其中逆转录过程将RNA转化为cDNA，再将cDNA片段连接到测序芯片上。
4. 测序：通过二代测序技术对文库进行测序，产生大量的测序数据。
5. 数据分析：对测序数据进行质控、数据清洗、比对等处理，得到基因表达的信息。
二、转录组学测序的应用转录组学测序在许多领域中都有广泛的应用，主要包括以下几个方面：1. 基因表达谱分析：通过对转录组测序数据的分析，可以了解不同组织或细胞在基因表达方面的差异，进而研究基因调控机制。
2. 代谢通路分析：转录组测序数据可以用于代谢通路分析，了解代谢通路中基因的表达情况，进而探究代谢通路的调控机制。
3. 疾病诊断和治疗：转录组测序可以用于疾病的诊断和治疗，通过比较健康人和患病人的转录组数据，找出与疾病相关的基因和通路，进而开发新的治疗方法。
4. 新基因的发现：通过转录组测序分析，可以发现新的基因，进而研究新基因的功能和调控机制。
三、转录组学测序的挑战和发展趋势虽然转录组学测序技术在生物学研究中有着广泛的应用前景，但也面临着一些挑战和限制。
主要表现在以下几方面：1. 数据量大：转录组测序数据量庞大，需要高效的数据处理和存储方式。
2. 数据分析复杂：转录组测序数据的分析需要运用统计学和生物信息学等多种方法，需要专业的分析人员和软件。
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HiSeq 2000n Illumina Sequencing 生物信息分析
真核mRNA的纯化
链霉亲合素包被磁珠+生物素标记 Oligo（dT）25+poly（A）
RNA-Seq (单端测序---Quantification)
√ － － －
RNA-Seq (双端测序---Transcriptome)
√ √ √ √
HiSeq 2500
17
RNA-Seq (Transcriptome)
Workflow of RNA-Seq(Transcriptome)
Total RNA
mRNA的纯化主要通过的磁珠与 生物素吸附原理从而分离纯化
Oligo（dT）25磁珠纯化原理主要 是mRNA的3′的poly A与磁珠在 bindingbuffer的作用下相结合。磁 珠通过MPC（磁分离器）从溶液 中分离出来。
mRNA与磁珠结合后，再用TrisHCL在加热条件下解离洗脱到溶 液中。
转录组测序技术原理及应 用优秀课件
基因组—转录组—表观遗传组—蛋白组层次 遗传的中心法则
什么是转录组？
All transcripts
All mRNAs
RNA是解读基因组的关键
Genotype
Phenotype
DNA
Protein
RNA
RNA 测序技术
测序技术
RNA-Seq
研究对象
mRNA
鉴定新分子
RT ds cDNA
末端修复(防止自连） cDNA 3′末端加A 消化DNA
↓
mRNA的分离
↓
mRNA的打断
↓
cDNA的合成
末端修复
↓
3’端↓ 加A
↓
加接头↓胶回收质量检测：Aligent 2100：片段大小、纯度、浓度 qPCR：片段大小、浓度 手工检测：跑胶验证。
RNA-Seq (Transcriptome resequencing)
20
RNA-Seq (De novo transcriptome assembly)
原核mRNA的纯化
Ambion MICROExpress Kit
LNA扣锁型探针
mRNA反转录---fragment+RT
纯化过的mRNA样品加入 1 µl的fragment buffer 70℃ 作用1.5min。
加入1µl的stop buffer终止 反应。
加入沉淀剂（NaAc 糖原 无水乙醇）沉淀产物。
Eukaryon
Procaryon
Enrich mRNA by OligoT
Remove rRNA
RNA fragmentation (200nt~700nt)
Random hexamer primed cDNA synthesis
Size selection, then PCR amplification
HiSeq 2000n Illumina Sequencing 生物信息分析
Applications of RNA-Seq
Application
Expression-profiling Alternative Splicing Fusion Gene SNP detection
Eukaryon
Procaryon
Enrich mRNA by OligoT
Remove rRNA
RNA fragmentation
Random hexamer primed cDNA synthesis
Size selection, then PCR amplification
HiSeq 2000 sequencing
HiSeq 2000 sequencing 101PE
生物信息学分析
RNA-Seq (Transcriptome)
Technique
2
Characterize the transcriptome in unparalleled detail
RNA-Seq (De novo transcriptome assembly)
O
表达谱研究
O
基因结构分析
O/X
EST 测序
O/X
筛选分子标记
O
转录融合基因 表达
O/X
Small RNA 测序
Small RNA
O
降解组测序 mRNA
Non-coding RNA测序
Non-coding RNA
O
O
O
O
O
X
X
O
X
X
X
O
O
X
X
X
X
Workflow of RNA-Seq
Total RNA样品检测 制备Cluster Station Illumina Sequencing 生物信息分析
Total RNA样品检测
Agilent 2200 检测 OD260/280:1.8~2.2 RNA 28S:18S ≥ 1.0; RIN≥7
新型安捷伦2200 TapeStation 系统是新一代测序（NGS）、生物微阵列芯片分析和qPCR 工作流程以及蛋白质纯化和抗体生产过程中对生物样品进行质量控制（QC）的理想解 决方案。 ● 可扩展的通量—16联或96孔微量滴定板 ● 快速得到结果—平均每个样品只需一分钟便可获得结果 ● 使用简单—可直接使用的ScreenTape预制胶条简化了工作流程 ● 样品用量少—每次运行仅需要不到2ul样品
检测报告-合格样品
棉铃虫/果蝇
检测报告-不合格样品
Workflow of RNA-Seq
Total RNA
Eukaryon
Procaryon
Enrich mRNA by OligoT
Remove rRNA
RNA fragmentation (200bp)
Random hexamer primed cDNA synthesis
PCR
↓
PCR胶回收
Workflow of RNA-Seq
Total RNA
Eukaryon
Procaryon
Enrich mRNA by OligoT
Remove rRNA
RNA fragmentation (200bp)
Random hexamer primed cDNA synthesis
Size selection, then PCR amplification